Isolering och karakterisering av RNA-Innehållande Exosomes

Summary

Detta papper visar metoder för isolering, rening och detektion av exosomes, samt tekniker för analys av deras molekylära innehåll. Dessa metoder är anpassningsbara för exosome isolerade från både media cellkultur och biologiska vätskor och kan bortom analys av molekylära innehåll också vara användbart i funktionella studier.

Abstract

Området exosome forskning expanderar snabbt, med en dramatisk ökning av publikationer under de senaste åren. Dessa små blåsor (30-100 nm) av endocytic ursprung var först föreslogs att fungera som ett sätt för retikulocyter att utrota transferrin receptorer medan mogna till erytrocyter ^1, och var senare namnet exosomes. Exosomes bildas genom inåt spirande sena endosomes, producera multivesicular organ (MVBs) och släpps ut i miljön genom fusion av MVBs med plasmamembranet ^2. Sedan den första upptäckten av exosomes, har ett brett utbud av celler visat att frigöra dessa blåsor. Exosomes har också påvisats i flera biologiska vätskor, inklusive plasma, nässköljvätska, saliv och bröstmjölk ^3-6. Dessutom har det visats att innehåll och funktion exosomes beror på ursprung cellen och på vilka villkor de produceras. Ett antal funktioner har demonertrerade för exosomes, såsom induktion av tolerans mot allergen ^7,8, utrotning av etablerade tumörer i möss ^9, hämning och aktivering av naturliga mördarceller ^10-12, främjande av differentiering till T reglerande celler ^13, stimulering av T-cell proliferation ¹⁴ och induktion av T-cell apoptos ^15. År 2007 har vi visat att exosomes frigörs från mastceller innehåller budbärar-RNA (mRNA) och mikro-RNA (miRNA), och att RNA kan skytteltrafik från en cell till en annan via exosomes. I mottagarens celler, var mRNA skytteltrafik genom exosomes visat översätts till protein, vilket tyder på en reglerande funktion av den överförda RNA ^16. Dessutom har vi också visat att exosomes härrör från celler som odlas under oxidativ stress kan inducera tolerans mot ytterligare stress i mottagarens celler och därmed antyder en biologisk funktion av exosomal transfer-RNA ^17. Cellodling media och biologiska vätskor samarbetentain en blandning av blåsor och skjul fragment. En högkvalitativ isolering metod för exosomes, följt av karakterisering och identifiering av exosomes och deras innehåll, är därför mycket viktigt att skilja exosomes från andra blåsor och partiklar. Här presenterar vi en metod för isolering av exosomes från både cellkulturmedium och kroppsvätskor. Denna isolering Metoden bygger på upprepade centrifugering och steg filtrering, följt av en slutlig ultracentrifugering steg där exosomes är pelleterat. Viktiga metoder för att identifiera exosomes och karakterisera exosomal morfologi och proteinhalt lyfts fram, bland annat elektronmikroskopi, flödescytometri och Western blot. Rening av den totala exosomal RNA är baserad på spin kolonnkromatografi och exosomal RNA avkastning och storleksfördelning analyseras med hjälp av en Bioanalyzer.

Protocol

1. Exosome isolering

1. Väx celler i medium med exosome utan serum. Därför lagt till några serum till cellkulturmedium bör vara uttömda i exosomes genom ultracentrifugering till 120 000 xg över natten vid 4 ° C före användning.
2. Överför cellsuspension till koniska rör.
3. Centrifugera vid 300 xgi 10 minuter vid 4 ° C till pellets cellerna.
4. Överför supernatanten till ultracentrifugen rör och om inte helt fulla lägga PBS.
5. Centrifugera provet vid 16 500 xgi 20 minuter vid 4 ° C för att ytterligare ta bort celler och skräp.
6. Filtrera supernatanten genom ett 0,2 ìm filter som tar bort partiklar större än 200 nm.
7. Överför filtrerade supernatanten till nya ultracentrifugen rör och försegla rören innan ultracentrifugen till 120 000 xgi 70 minuter vid 4 ° C till pellets i exosomes.
8. Kassera supernatanten.
9. För maximal exosome hämtning resuspendera exosome berikaED pellets upprepade gånger i en liten volym (~ 3 x 50 l) med en lämplig buffert. Denna buffert beror på den efterföljande experimenten planerades efter exosome isolering. Till exempel är lyseringsbuffert används för protein och RNA isolering är PBS används för elektronmikroskopi och flödescytometri samt för funktionella studier medium kan vara att föredra.

Observera, exosomes kan också isoleras från olika kroppsvätskor, såsom plasma, med hjälp av samma procedur som för cellodling media. För trögflytande vätskor kan det vara nödvändigt att späda provet med PBS före centrifugering och filtrering steg. I förhållande till centrifugeringsvarvtal för punkt 5 ovan, kan det höjas till 29 500 xg, och ultracentrifugering i punkt 7 kan förlängas till 90 minuter ^18.

Om provet behöver renas ytterligare i exosome pellets kan noteras på ett sackaros lutning och exosomes kommer främst att finnas i den fraktion representing en densitet på 1,13-1,19 g / ml ^2.

2. Exosome identifiering genom elektronmikroskopi

1. För att ytterligare eliminera kontaminerande proteiner resuspendera exosome berikas pelleten i PBS och ultracentrifugen till 120 000 xgi 70 minuter vid 4 ° C för att åter Pelletera exosomes.
2. Ta en liten delmängd av provet för protein isolering och totalprotein mätning. Se till att endast en liten del av provet lyseras och används för proteinet mätning och hålla intakt exosomes, löst i PBS, separat på is eller vid -80 ° C i ytterligare experiment.
3. Placera en droppe, cirka 10 mikrogram exosomal protein av intakt exosomes återsuspenderade i PBS, på ett Parafilm. Då, med pincett försiktigt placera en formvar kol belagt nickel rutnät ovanpå varje droppe i 30-60 minuter. Se till att nätet är positionerat med beläggningen vänd drop innehåller exosomes.
4. Placera tre droppar, varje 30 l, av PBS på tHan Parafilm och tvätta nätet genom att sekventiellt placera nätet på toppen av droppar av PBS, och använda ett absorberande papper i mellan. Använd absorberande papper försiktigt bara genom att hålla den nära till sidan av nätet, utan att ta kontakt med den belagda området.
5. Fixera provet genom att deponera en nedgång på 2% paraformaldehyd på Parafilm och placera gallret på toppen av nedgången i 10 minuter.
6. Upprepa tvätt i punkt 4, innan immunfärgning med en lämplig antikropp. Vanligt använda antikroppar anti-CD63 och anti-MHC klass II. Elektronmikroskop kan även utföras utan immunfärgning som exosomes kan identifieras enbart baserat på storlek och morfologi. Vi rekommenderar dock att utvärdera storlek, morfologi och närvaron av ett membran protein för en mer avgörande validering.
7. Överför nätet till en 30 l droppe av den primära antikroppen i valet och inkubera i 40 minuter. Tvätta genom att upprepa punkt 4, men använd 0,1% bovint serumalbumin i PBS istället för PBS ensam.
8. Upprepa punkt 7, men med 10 märkta NM-guld sekundär antikropp och tvätta med PBS ensam.
9. Post-fix provet genom att lägga till en nedgång på 2,5% glutaraldehyd till Parafilm och inkubera nätet på toppen av nedgången i 10 minuter. Upprepa tvätta i punkt 4, men använder fem droppar av avjoniserat vatten i stället för tre droppar av PBS.
10. Kontrast provet genom att lägga till en nedgång på 2% AUC acetate att de Parafilm och inkubera nätet på toppen av nedgången i 15 minuter.
11. Bädda in provet genom att lägga en droppe 0,13% metylcellulosa och 0,4% AUC acetate att de Parafilm och inkubera nätet på toppen av nedgången i 10 minuter.
12. Ta bort överflödig vätska genom att försiktigt använda en absorberande papper innan du placerar gallret på ett papper med den belagda sidan upp och låt det lufttorka i 5 minuter.
13. Undersök förberedelserna med ett elektronmikroskop eller förvara nät i ett rutnät låda för framtida arbete.

3.Exosome karakterisering med flödescytometri

Som exosomes är för små för att upptäckas av dagens flödescytometri utrustning är det nödvändigt att först binda exosomes att antikroppsförsedda pärlor (Figur 1). Dessa pärlor kan antingen köpas som en färdiglagad produkt eller tillverkat i laboratorium med antikroppen val. Beroende på exosomal cellulära ursprung, kan olika antikroppar kopplas till pärlor som kan vara antingen av magnetiska eller latex karaktär. Vi använder för närvarande anti-MHC klass II eller anti-CD63 belagd pärlor för denna analys.

1. Vid användning av "hemlagad" antikroppsförsedda pärlor, använder vi 4 ìm latex pärlor belagda med anti-CD63-antikropp. Tvätta 25 l 4 pärlor ìm latex (30 x 10 ⁶ pärlor) två gånger i 100 l MES buffert, 3 000 xgi 15-20 minuter och lös upp pelleten i 100 l MES buffert. Förbered antikroppen blandning som innehåller en volym som motsvarar av 12,5 mikrogram antikropp med samma volym av MES buffert. Lägg tillpärlor till antikroppen blandningen och Inkubera under omrörning över natten i rumstemperatur. Tvätta antikroppsförsedda pärlorna tre gånger med PBS (3 000 xgi 20 minuter) och lös pelleten i 100 ìl lagring buffert (med en slutlig koncentration av 300 000 pärlor / l).
2. För varje prov (varje antikropp), fortsätt med en volym som motsvarar minst 30 mikrogram av exosomal protein (i intakta exosomes lösas i PBS) per ~ 100 000 antikroppsförsedda pärlor.
3. Inkubera exosomes och pärlor, i en total volym på 300 l PBS, över natten vid 4 ° C under varsam rörelse.
4. Blockera genom att tillsätta 300 l 200 mm glycin och inkubera i 30 minuter.
5. Tvätta exosome-pärla komplex två gånger i Wash Buffer (1-3% serum i PBS), 600 xgi 10 minuter.
6. Inkubera exosome-pärla komplex med 50 l IgG-antikroppar vid 4 ° C. Tvätta exosome-pärla komplex två gånger i tvättbuffert som beskrivs i steg 5.
7. Tillsätt 90 l tvättbuffert och 10 lantikropp val (helst anti-CD9, anti-CD63 eller anti-CD81) till exosome-pärla komplex och inkubera i 40 minuter under varsam rörelse. Tvätta exosome-pärla komplex två gånger i tvättbuffert som beskrivs i steg 5.
8. Tillsätt 300 l tvättbuffert och skaffa data med hjälp av flödescytometri.

Som diskuterats ovan, olika pärlor kan användas, såsom latex pärlor som beskrivs i protokollet eller magnetiska kulor. Om magnetiska kulor används i stället, observera, att protokollet är något annorlunda. Blockeringen steg (punkt 4) krävs inte och tvätta utförs genom att placera röret i en magnetisk monter istället för en centrifugering.

Lagring buffert används för "hemgjorda" antikroppsförsedda pärlor, innehåller 0,1% glycin och 0,1% natrium azid i PBS, med ett pH på 7,2.

Viktigt, se till att använda exosome utarmat serum för flödescytometri tvättbufferten (1-3% serum i PBS), för att undvikaserum exosomes förorenar analysen.

Observera, när du utför exosome karaktärisering med hjälp av antikroppar kopplade pärlor är det viktigt att erkänna att det bara är en specifik subpopulation, specifika för den använda antikroppar, som är isolerat och karakteriseras.

4. Exosome upptäckt av Western blot

Western blot är en väl etablerad metod och vi kommer inte gå in på detaljer om själva metoden, utan fokuserar på vikten av ett lämpligt protein isolering innan Western Blot och de olika används antikroppar.

1. Lös exosome pelleten i proteinet lyseringsbuffert valfrihet och pipettering ordentligt, följt av Vortex-blandning. För att ytterligare Lyse de exosomes, Sonikera provet i ett vattenbad 3 x 5 minuter med Vortex-blandning däremellan. Slutligen centrifugera provet, 13 000 xgi 5 minuter vid rumstemperatur, och överför supernatanten till ett nytt Eppendorf-rör.
2. Mätär den totala proteinhalten med en metod för val och belastning 20-50 mikrogram protein per brunn.
3. Separera och överför de proteiner med gelelektrofores och electroblotting.
4. Block och tvätta membranet innan du utför immunfärgning mot proteiner anrikas i exosomes.
5. Identifiera de specifika protein kemiluminiscens, digitala bildsystem och analysprogram.

Eftersom det inte finns några exosome specifika markörer, proteiner som anrikas i exosomes, från alla olika cellulära ursprung, används ofta för exosome upptäckt. Dessa är proteiner som tetraspanins (t.ex. CD9, CD63 och CD81), cytoskelettet tillhörande protein (t.ex. Ezrin) och proteiner involverade i multivesicular biogenes (t.ex. Tsg101 och Alix). Andra proteiner som också ofta upptäcks i exosomes är Flotillin, Hsc70 och olika proteiner Rab etc. Men det finns också cellen specifika proteiner som finns i exosomes såsom A33 (intestinala epitelceller), CD3(T-celler) och MHC klass II (antigenpresenterande celler). Således kan beroende på från vilken celltyp det exosomes frigörs från markörer för detektion varierar.

Som andra fack i cellen också kan producera blåsor, rekommenderas dessutom att fastställa förekomsten av proteiner från dessa avdelningar som endoplasmatiska retiklet (t.ex. calnexin och Grp78) och Golgiapparaten (t.ex. GM130). Således visar brist på dessa proteiner ingen eller liten förorening av blåsor i andra fack i provet studeras.

5. Isolering av exosomal RNA och RNA-analys

1. Lös exosome pelleten i RNA lyseringsbuffert val och utföra RNA-extraktion. Olika RNA isolering kit kan användas beroende på efterföljande experiment, men kolumnen metoder ger prov med ett bredare spektrum av RNA. Vi använder för närvarande miRCURY RNA Isolation Kit med Exiqon, men andra kit kan vara lämpliga beroende på fmientific fråga till hands.
2. När du utför RNA isolering är det viktigt att arbeta i en RNase miljö. Därför använder nukleinsyra och nukleas fria pipettspetsar och torka både bänk och utrustning fri från föroreningar och RNaser.
3. För RNA-isolering, genom att använda miRCURY RNA Isolation Kit, lös upp exosome pelleten i 350 ìl lyseringslösning och utföra Vortex-blandning i 15 sekunder.
4. Tillsätt 200 ìl av 95% etanol och Vortex-blandning i 10 sekunder.
5. Placera en kolumn i ett provrör och överföra lyseras exosomes till kolonnen och centrifugera 1 minut vid 14 000 x g.
6. Tvätta tre gånger genom att tillsätta 400 l tvättlösning till kolumnen som innehåller exosomal RNA och centrifugera i 1 minut vid 14 000 x g.
7. Centrifugera kolumnen för 2 minuter vid 14 000 xg för att se till att kolumnen är torr och placera den torra kolumn i en RNase-fri Eppendorf-rör.
8. Tillsätt 50 l Elution buffert i kolonnen och centrifugera 2 minuter vid 200 xg, följt av 1 minut vid 14 000 x g.
9. Fortsätt med den isolerade RNA eller förvara den i -80 ° C.

För detektion och analys av det totala extraherade exosomal RNA, använd en Agilent 2100 Bioanalyzer med RNA-6000 Nano eller RNA 6000 Pico Kit. Analysen visar exosomal RNA avkastning och storleksfördelning.

6. Representativa resultat

Exosomes är för små för att upptäckas av tillgängliga metoder flödescytometri, och är därför knutna till antikroppsförsedda pärlor innan de analyseras (figur 1). Som exosome-pärla komplex kan samla flödescytometri punktdiagram kan innehålla olika populationer av enkel-, dubbel och trippel pärlor (Figur 2A). Pilen visar den enskilda pärlorna att ytterligare analyseras. En CD63 positiva enda pärla-exosome befolkningen jämfört med dess isotypisk kontroll visas i figur 2B.

e_content "> På grund av den begränsade storleken på exosomes, kan de bara direkt visualiseras med elektronmikroskopi, och inte genom ljusmikroskop. Typiska morfologiska egenskaper exosomes är rund och 30-100 nm stora membran blåsor. I 3 figur, elektronmikroskopi Fotografierna visar exosomes immunostained (A) med guld märkt antikropp för CD63 (som pilen visar) och icke-immunostained exosomes (B).

Att fastställa att den isolerade blåsor verkligen exosomes och att ytterligare karakterisera exosomal proteiner, är Western blot används ofta. Figur 4 visar avsaknad av calnexin, en endoplasmatiska nätmagen markör. Detta indikerar liten förorening av blåsor från endoplasmatiska retiklet. Dessutom visar Figur 4 förekomster av CD81 i exosomes, vilket är en tetraspanin ofta anrikas i exosomes.

Cellulärt RNA innehåller huvudsakligens ribosomalt RNA (rRNA), ses som två framstående toppar för 18S och 28S rRNA subenheter i en Bioanalyzer analys (Figur 5A). Men exosomal RNA skiljer sig åt i profil som exosomes saknar två rRNA toppar (18S och 28S) och anrikas i korta RNA som mRNA och miRNA (Figur 5B).

Figur 1. På grund av den begränsade storleken på exosomes (30-100 nm), de kan inte skilja från brus och bakgrunden när analyseras med flödescytometri. Därför är det nödvändigt att bifoga dem till antikroppsförsedda pärlor innan exosomes analyseras, som sedan kan visualiseras med laser.

Figur 2. Den exosome-pärlor komplex kan aggregera med varandra och bildar dubbel och trippel pärlor (A). Pilen visar den enda pärla-exo viss befolkning som är gated och användas för vidare analys. Denna population kommer att vara direkt jämföras med en isotypisk kontroll (fylld grå topp) för att fastställa förekomsten av membran molekyler av exosomes. CD63 positiva exosomes (svart öppen topp) visas i figur B.

Figur 3. Elektron micrographs av exosomes med den typiska morfologi och storlek (40-80 nm) (A och B). Pilen i figur A visar den gyllene partiklar av sekundär antikropp, kontrollera att detta exosome har CD63 på membranets yta.

Figur 4. Western blot resultat som visar att avsaknaden av endoplasmatiska retiklet protein calnexin men förekomsten av proteinet ofta anrikas i exosomes, tetraspanin CD81.

ve_content ">
Figur 5. Bioanalyzer resultat som visar närvaro RNA i cellerna (A) och exosomes (B). Pilar visar 18S och 28S rRNA subenheter finns i celler. Som exosomal RNA manligt innehåller små RNA ingen eller liten rRNA identifieras i exosomes.

Discussion

När man studerar de molekylära innehåll och / eller funktion exosomes, är det viktigt att använda en hög metod kvalitet isolering som ger en lämplig avkastning och lägsta möjliga graden av kontamination. Den metod som beskrivs i detta dokument är en väletablerad metod för att isolera exosomes och att studera deras RNA-innehåll och biologisk funktion. Vidare är betydelsen av karakterisering av de isolerade exosomes, genom en kombination av olika metoder, inklusive elektronmikroskopi, flödescytometri och Western blot, markerat.

När isolera exosomes, är det första centrifugeringssteget (300 xg) som används för pellets celler som kan finnas i cellen suspension eller de studerade biologisk vätska. Den andra centrifugering vid 16 500 xg måste vara tillräckligt stark för att pellets döda celler, större skräp, apoptotiska organ och andra organeller. Därefter centrifugering, vissa protokoll innehåller en nano-filtrering steg, men vissa investigators har uteslutit detta steg. Dock betonar vi vikten av att utrota fragment och blåsor större än 200 nm, och därför rekommenderar även en filtrering steg. Om en strängare isolering behövs kan 100 nm filter användas, men observera att om viskösa vätskor eller gaser används, kan dessa filter lätt bli blockerad och exosomal material går förlorat. Dessutom kan en 100 nm filtrering påverkar morfologi exosomes och dessutom om exosomes är på större skala de kan gå förlorade. Således 200 nm filter verkar lämplig för exosome isolering. Efter filtrering är obligatoriskt ultracentrifugering vid 120.000 xg används för pellets i exosomes. Den exosomes kan ytterligare tvättas med PBS, bunden till antikropp pärlor och tvättas, eller placeras på ett sackaros lutning för att avlägsna föroreningar proteiner. Detta kan dock vara en mycket resurskrävande process som vi argumenterar inte vara nödvändig, särskilt om det börjar provvolym är liten och / eller RNA-innehåll oF exosomes är låg, som extra åtgärder kommer att avsevärt minska materialet ytterligare. Men, återigen, bör den typ av isolerade blåsor bevisas av närvaro och frånvaro av vissa proteiner.

Hittills har ingen helt unik protein som markör för exosomes identifierats för att verifiera att provet innehåller exosomes och inget annat. Som ett resultat är en kombination av metoder krävs för att karakterisera exosomes, inklusive bestämning av storlek och morfologi av exosomes genom elektronmikroskopi. Dessutom kan renhet av provet bestämmas genom elektronmikroskopi, eftersom denna metod kan ge en överblick av graden av förorening av provet, till exempel med större blåsor, som mikropartiklar, apoptotiska kroppar eller cellrester. Dessutom kan proteinhalten i den exosomes bestämmas med flödescytometri och Western blot, och kombinationen av dessa två metoder resulterar i en analys av både membranbundna (t.ex. CD63 ochCD81) och internaliserad proteiner (t.ex. Tsg101 och Alix) av exosomes. Detektion av proteiner anrikas i exosomes, såsom CD63, Tsg101 och Alix, och avsaknaden av proteiner som endoplasmatiska retiklet proteinet calnexin, är en indikation på att exosome berikade pellets är verkligen exosomes och inte förorena vesiklar från andra fack i cellen.

Profilen av RNA som upptäcks i exosomes är fundamentalt skiljer sig från RNA som finns i intakta celler. Således exosomal RNA analyseras av Bioanalyzer eller i gel-baserad RNA-analys metoder saknar två toppar för 18S och 28S rRNA subenheter, som är dominerande inom analys av cellulärt RNA. Vi hävdar därför att upptäckten av några betydande mängder rRNA i ett prov visar att den totala extraherade RNA inte är av exosomal ursprung ensam, och således att isoleringen metoden behöver förbättras och kvalitetssäkras.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Optima L-90K Ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc.	65670
Quick-seal ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter Inc.		Depending on the rotor used different tubes are needed. Ti70 (342414), Ti45 (345776)
Quick-Seal Cordless Tube Topper kit	Beckman Coulter Inc.	358312
Filtropur Syringe Filter, 0.20μm	Sarstedt Ltd	83.1826.001	For viscose fluids and/or large volumes, a Vacuum filtration system, 0.2 μm, from VWR International can be used instead (514-0600).
Formvar/carbon coated nickel grids	Ted Pella, Inc.	1GN200
Mouse-anti-human CD63	BD Biosciences	556019	Final conc: 0.05μg/μl
Isotype control; IgG1κ (MOPC 21)	Sigma-Aldrich	M9269	Final conc: 0.05μg/μl
Anti-Mouse IgG Gold Conjugate, 10 nm	Sigma-Aldrich	G7777	Final conc: 1%
LEO 912AB Omega Electron microscope	Carl Zeiss, Inc.		Or equivalent equipment.
4μm aldehyd/sulphate latex beads	Interfacial Dynamics	12-4000
Antibody for coating of the latex beads			For example anti-CD63 from BD Bioscience (556019)
Intelli-Mixer RM-2L	ELMI		Or equivalent equipment.
IgG from human serum	Sigma-Aldrich	I4506
Antibodies for detection	BD Biosciences		For example: PE anti-CD63 (556020)PE anti-CD9 (555372)PE anti-CD81 (555676) Isotype control (555749)
BD FACSAria	BD Biosciences
Transsonic T 490 DH	ELMA		Or equivalent equipment.
miRCURY RNA Isolation Kit	Exiqon A/S	300110
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939A