Summary
Un essai de formation de tube est utilisé pour évaluer l'activité vasculaire des cellules tumorales.
Abstract
Au cours des dernières décennies, un essai de formation de tube en utilisant le facteur de croissance réduite Matrigel a été typiquement employées pour démontrer l'activité angiogénique des cellules endothéliales vasculaires in vitro, 1-5. Toutefois, les preuves de plus en plus récemment, a montré que ce test n'est pas limité à tester le comportement des cellules endothéliales vasculaires. Au lieu de cela, il a également été utilisé pour tester la capacité d'un certain nombre de cellules tumorales pour développer un phénotype vasculaire 6-8. Cette capacité est compatible avec leur comportement vasculogenic identifiés chez des animaux xenotransplanted, un processus connu sous le nom vasculogenic mimétisme (VM) 9. Il ya une multitude de preuves démontrant que des cellules tumorales à médiation VM joue un rôle vital dans le développement tumoral, indépendant de l'angiogénèse des cellules endothéliales 6, 10-13. Par exemple, les cellules tumorales ont été trouvés à participer dans le sang perfusé, la formation de canaux vasculaires dans des échantillons de tissus provenant de patients atteints de mélanome et le glioblastome 8, 10, 11. Ici, nous avons décrit ce test réseau tubulaire comme un outil utile dans l'évaluation de l'activité vasculogenic des cellules tumorales. Nous avons constaté que certaines lignées cellulaires tumorales, comme le mélanome B16F1 cellules, les cellules de glioblastome U87, et le cancer du sein MDA-MB-435 cellules sont capables de former des tubules vasculaires, mais certains n'ont pas, comme le cancer du côlon cellules HCT116. Par ailleurs, ce phénotype vasculaire est dépendante du nombre de cellules plaquées sur le Matrigel. Par conséquent, ce test peut servir utilitaire puissant pour dépister le potentiel vasculaire d'une variété de types cellulaires incluant les cellules vasculaires, les cellules tumorales ainsi que d'autres cellules.
Protocol
1. Un test basé sur Matrigel Tube Formation d'évaluer l'activité Vasculogenic de cellules tumorales
- Préparation des cellules tumorales et les cellules endothéliales microvasculaires: les cellules tumorales du cerveau telles que les cellules U87, les cellules de mélanome B16F1, le cancer du sein MDA-MB-435, et les cellules du côlon HCT116 ont été cultivées dans du DMEM supplémenté avec 10% de FBS et pénicilline / streptomycine (tous d'Invitrogen ). Cellules endothéliales microvasculaires humaines en ligne les cellules endothéliales (HMVECs) ont été cultivées dans EBM2 moyennes (Lonza) supplémenté avec 1 ug / ml d'hydrocortisone et 1 ng / ml de facteur de croissance épidermique, 10% de FBS et pénicilline / streptomycine. Les cellules ont été lavées avec du PBS à trois reprises et détaché avec 0,05% de trypsine / EDTA (Invitrogen). Après centrifugation à 2000 rpm pendant 5 min, culots de cellules ont été lavées à nouveau avec du PBS. Ensuite, le culot cellulaire ont été comptés avec un hémocytomètre.
- Préparation de Matrigel: Une aliquote de facteur de croissance réduite de Matrigel (BD Bioscience) a été réchauffé à la température ambiante. Avant de complètement dégelé, il a été transféré sur la glace et son liquide a été maintenu sur la glace pendant au moins 10 min. Ensuite, 50 ul de Matrigel a été plaqué au plaques de 96 puits à un niveau horizontal qui permet le Matrigel à répartir uniformément, et incubées pendant 30 min à 37 ° C.
- La formation du tube: Cellules (1-2 x 10 4) ont été re-suspendu avec DMEM sans sérum pour les cellules tumorales ou EBM-2 pour les cellules endothéliales, et chargé sur le haut de la Matrigel. Si ce test a été utilisé pour mesurer les effets de certains agents sur le développement des tubules, ces agents (stimulateurs ou inhibiteurs) ont été ajoutés dans le milieu sans sérum. Chaque groupe conditionnelle contenue 4-6 puits.
- Image et analyse de données: Après incubation à 37 ° C pendant la nuit, chaque puits a été analysée directement sous un microscope. Si les tubules étaient nécessaires pour la fixation, 100 ul de formol à 10% de solution saline solution a été ajoutée en douceur et dix minutes plus tard, il était prêt pour l'analyse. Sous un microscope à contraste de phase 10x, tubules dans chaque domaine ont été imagées et une moyenne de 3 à 5 tubules champs aléatoires dans chaque puits a été compté.
2. Les résultats représentatifs:
HMVECs ont été utilisées comme contrôle positif, étant donné que ces tubules ont été développés à partir claires corps cellulaires allongées qui se connectent au réseau sous forme de polygones. Cellules B16F1, U87, et MDA-MB-435 développé tubules vasculaires semblables à ceux formés par HMVECs, mais cellules HCT116 n'a pas (figure 1). Une cellule de formation du tube dose-dépendante a été testé dans les cellules U87. Comme le montre la figure 2, 10000 cellules formées tubules abandonnées. Une fois les cellules ont été doublés, un solide réseau vasculaire est comparable à ceux observés dans HMVECs. En revanche, les cellules de moins de 5000 a échoué à former un phénotype vasculaire.
Figure 1. Formation de tubes induite par HMVECs, U87, MDA-MB-435, et cellules B16F1, mais pas les cellules HCT116. Toutes les cellules (2 x 10 4) ont été chargés sur Matrigel et incubées pendant la nuit. Tubules ont été imagées en utilisant le contraste de phase. HMVECs ont été utilisées comme contrôle positif. Un représentant de 3-5 champs a été montré. Bar: 100 um.
Figure 2. U87 cellulaire induite par les tubules dans un certain nombre cellulaire dépendante manière. Nombres différents de cellules U87, comme indiqué dans les coins ont été utilisés pour la formation du tube. HMVECs ont été utilisés pour un contrôle positif. Bar: 100 mm.
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Discussion
Pour ce test pour réussir, la qualité de Matrigel devrait être testée en premier. Un petit échantillon peut être obtenu à partir de BD Bioscience pour pré-lancer le test en utilisant HMVECs. Produits de lots différents peuvent afficher des qualités dissemblables dans lesquelles certains lots ne fournissent pas une condition optimale pour la formation du tube. Deuxièmement, toutes les bulles doivent être évitées lors d'une aliquote de Matrigel est chargé dans des plaques 96 puits, parce que les bulles peuvent perturber la formation des tubules. Si des bulles minuscules sont trouvés dans un puits, le Matrigel peuvent être immédiatement déplacé vers le Matrigel tubes original qui doit être conservé sur la glace pendant l'expérience. En outre, les cellules testées doivent être maintenus à un taux de croissance à une phase de journal. Lorsque toutes les conditions de culture indiquant une croissance lente des cellules se produisent, elles doivent être remplacées par des cellules saines. Enfin, l'analyse des tubes sous un microscope ne devrait pas être plus d'une heure si les tubes ne sont pas fixe, car la température a diminué (température ambiante) pourraient affecter la formation de tube. Le dosage de l'ensemble devrait être achevé dans les 24 heures pour éviter la perturbation de la structure tubulaire induite par la mort cellulaire. Il est bien connu que la formation du tube est caractérisé par de multiples cellulaires activés par les processus, y compris la migration cellulaire, l'adhérence cellule-cellule, la survie et l'apoptose. Par exemple, la migration cellulaire et d'adhésion cellulaire sont perceptibles pendant le développement du tube. Après 24 heures, cependant, l'apoptose cellulaire significative a lieu que le réseau est de plus abandonnées observées. Cet événement se produit dans les deux cellules endothéliales et tumorales formation du tube de cellules dérivées.
Il est émergents que ce dosage est essentiel pour évaluer l'activité tumorale vasculogenic cellulaire in vitro, l'événement qui est indépendant de cellules endothéliales associées angiogenèse. Ici, nous avons montré que de cellules de mélanome B16F1 ligne du cancer du sein et de la ligne MDA-MB-435 développé des réseaux vasculaires sur Matrigel, cohérent avec le comportement vasculogenic de ces types de tumeurs chez l'homme ainsi que dans des modèles animaux 14-17. Bien que l'échec à développer un phénotype vasculaire par cellules HCT116 sur Matrigel est mécaniste inconnu, il est spéculé que cette propriété peut être vasculaires type de cellules tumorales dépendantes. Il serait intéressant de savoir si cellules HCT116 n'ont pas la capacité de générer des VM in vivo par rapport à B16F1 et MDA-MB-435 cellules. Par conséquent, l'établissement de ce dosage est d'une importance primordiale dans l'étude de la biologie du cancer, la biologie vasculaire ainsi que le dépistage de drogue.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le NCI R01 CA120659 (RS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD Biosciences | 47743-720 | |
| EBM2 kit | Lonza Inc. | CC-3156 | |
| Nikon ECLIPSE TS100 microscope | Nikon Instruments |
References
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