Summary
מאמר זה מתאר שיטה להשיג תלת ממדי (3D) מבנה של מולקולות התאספו helically באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים cryo-. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים אסיפות HIV-1 capsid כדי להמחיש את הליך שחזור מפורט 3D להשגת מפת צפיפות לפי שיטת איטרטיבי אמת בחלל הסליל מחדש.
Abstract
במיקרוסקופ אלקטרונים cryo-(cryo-EM), בשילוב עם עיבוד תמונה, היא כלי רב עוצמה יותר ויותר להגדרה של מבנה חלבון מתחמי macromolecular והרכבות. למעשה, חלקיק יחיד מיקרוסקופית אלקטרונים 1 ו דו ממדי (2D) קריסטלוגרפיה אלקטרון 2 הפכו מתודולוגיות שגרתי יחסית מספר גדול של מבנים נפתרו באמצעות שיטות אלה. במקביל, עיבוד תמונה תלת מימדי (3D) שחזור של אובייקטים הסליל התפתחה במהירות, בעיקר, איטרטיבי הסליל מרחב אמת שחזור (IHRSR) שיטה 3, אשר משתמשת יחיד כלי ניתוח החלקיקים בשיתוף עם סימטריה הסליל. גורמים ביולוגיים רבים לתפקד בצורות פילמנטיות או הסליל, ובהם סיבי אקטין 4, 5 microtubules, סיבי עמילואיד 6, 7 פסיפס טבק וירוסים, חיידקים שוטונים 8, וכן, כי מפת צפיפות 3D של ישות הסליל ניתן להשיג מ - הקרנה אחת התמונה, לעומת תמונות רבות נדרש שחזור 3D של אובייקט שאינו הסליל, עם שיטת IHRSR, ניתוח מבניות של אסיפות כאלה הסליל גמישה סדר היום השגה.
במאמר זה וידאו, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים לקבלת מפת צפיפות 3D של הרכבה חלבון הסליל (HIV-1 הוא capsid 9 בדוגמה שלנו), כולל פרוטוקולים להכנת cryo-EM הדגימה, איסוף נתונים על ידי מינון נמוך cryo-EM, אינדוקס דפוסי עקיפה הסליל, ועיבוד תמונה ושיקום באמצעות 3D IHRSR. לעומת טכניקות אחרות, cryo-EM מציע לשימור הדגימה האופטימלי בתנאים יליד הקרוב. דוגמאות המוטבעות בשכבה דקה של קרח זגוגי, על ידי הקפאה מהירה, צילמו ב המיקרוסקופים האלקטרונים בטמפרטורת חנקן נוזלי, בתנאים במינון נמוך כדי למזער את נזק הקרינה. תמונות לדוגמה מתקבלים בתנאים יליד ליד על חשבון אות נמוך ניגודיות נמוכה ב micrographs מוקלט. למרבה המזל, בתהליך של שיקום הסליל יש במידה רבה אוטומטיות, למעט לאינדקס דפוס עקיפה הסליל. כאן אנו מתארים גישה מבנה הסליל מדד ולקבוע הסימטריות הסליל (הסליל פרמטרים) מתוך micrographs דיגיטציה, צעד חיוני עבור 3D הסליל מחדש. בקצרה, אנו מקבלים המפה הראשונית צפיפות 3D באמצעות יישום שיטת IHRSR. מפה זו היא ראשונית ולאחר מכן מזוקק iteratively ידי החדרת אילוצים עבור הפרמטרים יישור של כל פלח, ובכך השליטה שלהם מעלות של חופש. שיפור נוסף מושג על ידי תיקון לתפקוד לעומת העברה (CTF) של מיקרוסקופ אלקטרונים (תיקון המשרעת והפאזה) וכן על ידי אופטימיזציה של סימטריה הסליל של האסיפה.
Protocol
1. Frozen-EM hydrated הכנת הדגימה
בגלל HIV-1 חלבון capsid (CA) מכלולים 9 יציבים רק מלח חיץ גבוה (1M NaCl), אשר תורמת רעש רקע חזק cryo-EM תמונות, אנו משתמשים דילול מהירה וחזרה בצד שיטה סופג transiently כדי להפחית את המלח הריכוז בעת הכנת רשת קפוא hydrated EM.
- פריקה זוהר הצד הפחמן של R2-200 רשת / 1 רשתות נחושת Quantifoil תחת 25mA עבור 25 שניות.
- השתמש nebulizer להביא את הלחות בחדר הסביבה, תוצרת בית הכבידה הבוכנה ידנית, עד 80%.
- ב Vitrobot פיי הבוכנה דיואר, אתאן נוזלי מגניב באמצעות חנקן נוזלי. הר לצלול מקפיא דיואר על הבוכנה את חומרת ידנית.
- החל 2.5 μl של פתרון CA preassembled על הצד פחמן של הרשת, שהוא רכוב על מלקחיים, ו לטעון את מלקחיים על הבוכנה עם הצד פחמן של הרשת מול ממך.
- הוסף 3 μl של חיץ דילול נמוך מלח (100 mM NaCl) לצד האחורי של הרשת ומיד למחוק את הצד האחורי של הרשת עם פיסת נייר הסינון. המשטח האחורי שלם של הרשת צריך להיות בקשר הדוק עם נייר סינון במשך כ 6 שניות, לפני הסרת הנייר הסינון. מיד לצלול לתוך הרשת אתאן נוזלי לאחר הסרת נייר הסינון.
- הסר את מלקחיים מן הבוכנה ובמהירות להעביר את הרשת לתוך קופסת אחסון רשת.
2. Cryo-אלקטרונים מיקרוסקופית של CA צינורי אסיפות
- טען את רשת קפוא hydrated תוך הפעלה Polara פיי מיקרוסקופ אלקטרונים G2 ב 200kv מצויד במצלמת CCD 4Kx4K Gatan.
- תחת מצב במינון נמוך, חיפוש, בהגדלה של ~ 200x עם מנה <0.001e - / 2, מסך כל רשת עבור אזורים עם קרח מתאים ולהציל את עמדות באזורים אלה בקובץ הבמה.
- נזכיר את העמדות נשמר מסך נוסף באזורים אלו בהגדלה של 3900 x במצב במינון נמוך החיפוש. בחר את האזורים בשכבה, אחידה דקה של קרח המכיל היטב מופרדים, צינורות ארוכים יותר חורים, לצורך איסוף נתונים. שמור את מיקומם של אזורים אלה בקובץ השלב השני.
- מעבר למצב חשיפה בהגדלה של 59,000 x, הבלעה 100 מיקרומטר אובייקטיבי הצמצם, ולהתאים את stigmatism אובייקטיבי עוצמת קרן מנה של ~ 15 דואר - A / 2 לכל חשיפה.
- לחזרה למצב במינון נמוך, חיפוש, לעבור מעמדה הציל ולזהות מרכז שפופרת טוב באמצעות מצלמה CCD. מעבר למצב המוקד, להתאים את להתמקד, להגדיר ערך defocus, בדרך כלל בין 0.5-2.5 מיקרומטר. מעבר למצב את החשיפה, להגדיר זמן החשיפה של 0.3-0.5 שניות, במינון של ה 15 - / 2, ולאסוף תמונה. התמונות נאספות על המצלמה צלחת, והסרטים צריך להיות מותר להתיישב למשך 10 שניות לפני החשיפה היא נלקחה.
- העברה לתפקיד הציל הבא וחזור על שלב 5 כדי לאסוף תמונות ועוד.
- הסרטים מפותחים במלוא העוצמה D19 במשך 12 דקות דיגיטציה באמצעות סופר coolscan סורק ניקון 9000 ED בגודל פיקסל של 6.35 מיקרומטר. הפורמט של קבצי התמונה TIFF.
3. הסליל לאינדקס
חפץ הסליל יכול להיות באינדקס של שני פרמטרים: סדר בסל, n, קו שכבה מספר, אני. כל שורה שכבה של התמרת פורייה, המאופיינת על ידי (n, l), מתאים לקבוצה של קווים על הסריג פני השטח של האובייקט מצוין על ידי הסליל (ח, יא) המדדים, תוך שימוש בסימון של סריג 2D. עבור כל (ח, יא), שורה (n hk, אני HK) שכבת צירוף ליניארי של שני וקטורים בסיסיים (n 10, אני 10) ו - (n 01, אני 01), המהווים את n ואני ערכי שני קווי שכבת העיקרי (1, 0) ו - (0, 1). l ניתן לקבל גובה שכבת קו נמדדת לאורך ציר Z ב התמרת פורייה. הערך של n ניתן לאמוד באמצעות המשוואה הבאה 10
πRr ≈ ≈ 1.1 J n | n | -0.9 .....................( 1)
איפה J n הוא פונקציה בסל, הקובעת את עוצמת הקו שכבת ה n, r הוא רדיוס הסליל של האובייקט, ו R הוא רדיוס של משרעת המקסימלי של קו השכבה. קו השכבה מספר, אני, קשורה n על ידי כלל הבחירה 11
l = TN + אממ ....................( 2)
איפה t ו u הם קבועים של הסליל. עבור סליל נתון, ייתכן שיש יחידות u בדיוק בדיוק (או מאוד מקרוב) לא גomplete פונה.
- תיבת החוצה צינור ישר יחסית ארוך בקוטר אחיד באמצעות 12 תוכנית של אימאן helixboxer ולשמור את התמונה בפורמט MRC.
- קבע את המרחק לחזור על הסליל, ג, באמצעות תוכנית צולבות המתאם מבוסס, כגון 'imgccf ", בחבילה MRC 13.
- חשב את התמרת פורייה עם אורך תיבה חדשה אינטגרלי המרחק חוזר, ג.
- בחר שתי שורות שכבת העיקרי להגדיר שני בסיסי סריג משטח וקטורים (1,0) ו (0,1).
- מדוד את הרדיוס של הצינורית, r, ואת גובה רדיוס של שני הקווים השכבה העיקרית התמרת, אני 10, R 10, אני 01 R 01, בהתאמה (איור 1).
- חישוב n 10 ו n 01 לפי משוואה (1).
- מאז ערכי n הם רק הערכה, שילובים כמה n 10 ו n 01 נבדקים צעדים מאוחר יותר (ראה שלב 4.2) כדי למצוא את הסימטריה הנכונה הסליל באמצעות IHRSR חבילת התוכנית.
- חשב את הסימטריה הבורג המתואר על ידי שני מספרים ממשיים: הרוטציה בין יחידות משנה (Δφ) ועליית צירית (Δz) של הסליל כוכב אחד (n = 1). בהתחשב l 10, אני 01, 10 n, ו n 01 ערכים, u ו t ניתן להשיג על ידי בדיקות טווח ערכים מ (למשל, -50 <מ <50) על פי חוק הבחירה. לבסוף, Δφ ו Δz מחושבים באמצעות Δφ t = 360 / u ו Δz = c / u.
4. שחזור תלת ממדי
- החלקיקים פילוח
- פתח מיקרוסקופ המכיל חלקיקים הסליל, באמצעות תוכנית בוקסר גרפי, שהיא תוכנית בחבילה נאמן.
- חותכים את החלקיקים הסליל למקטעים חופפים. בלוח הבקרה של בוקסר, לבחור מצב הסליל וכן להגדיר את הפרמטרים עבור אגרוף: גודל התיבה צריך להיות גדול יותר מאשר קוטר של החלקיקים ואת הערך עבור "OLAP" יש ~ 90% של גודל התיבה.
- לאחר השמאלי לחיצה על הקצוות של החלקיקים הסליל, בוקסר באופן אוטומטי ליצור סדרה של תיבות החלקיקים לאורך סליל.
- שמור קטעי התאגרף, כמו גם את הקואורדינטות שלהן.
- שחזור 3D ראשוני באמצעות תוכניות IHRSR
- הפוך את החדות של התמונות cryo-EM וליישם לעבור סינון נמוך 14 (אופציונלי) לפני עיבוד עם איטרטיבי הסליל שיטת שחזור אמיתי בחלל (IHRSR).
- פתח את הממשק הגרפי של תוכנית IHRSR ידי הקלדת "מחולל". ספק את הממשק הגרפי עם כל המידע עבור מחסנית חלקיקים התאגרף, כולל שם ונתיב של מחסנית, מספר התמונות בערימה, את הערכים עבור הפרמטרים סימטריה, וכו 'לחץ על הכפתור "סיום" כדי ליצור את התסריט מחדש, b25.spi.
- השתמש גליל מוצק או חלול כנקודת התייחסות ראשונית ולאפשר את ההליך מחזור עד אין שינויים סימטריה את הבורג מוגדר, אשר מתרחשת בדרך כלל לאחר מספר מחזורים. סימטריה זכות הסליל צריך לתת שחזור ביציבות התכנסו. שחזור שנוצר במחזור האחרון ישמש כנקודת התייחסות ראשונית עבור חידוד נוסף. IHRSR מבצע שחזור 3D באמצעות תוכניות SPIDER.
- שחזור עם עידון איטרטיבי 15 שחזור 3D שנוצר על ידי IHRSR משמש כיום כנקודת התייחסות ראשונית עבור חידוד נוסף. במהלך עידון, הסימטריה הסליל הוא קבוע Δφ ו Δz, הנקבעים מההליך IHRSR.
- קבע את defocus ובהווה אסטיגמציה ב מיקרוסקופ באמצעות תוכניות CTFFIND3 ו CTFTILT 16.
- הכפל מגזרים החלקיקים ידי CTF באמצעות תוכניות SPIDER 17. המבצע FT כינה את חבילת SPIDER משמש כדי לחשב את התמרת פורייה (FFT) של התמונה 2D. לאחר מכן, FFT הוא מוכפל ערכים CTF, שנקבע על השלבים הקודמים, באמצעות פעולת המכונה MU בתוך הסוויטה SPIDER. הערך המתקבל הוא הפוך אז שינו בחזרה כדי ליצור תמונה חדשה (CTF-מתוקן) במרחב האמיתי באמצעות פעולת SPIDER, FT שוב.
- בצע התאמה השלכה על ידי השוואת התחזיות כרכים התייחסות עם CTF-תיקנה תמונות, שימוש רב התייחסות יישור. וריאציה בזווית מחוץ למטוס להטות מוגבל + / -10 ° ו שנדגמו 1 צעדים מעלות. הציגו אילוצים, כגון מקדמי מתאם גבוה, מטוס זוויות ליד 0 ° או 180 °, ו-x מוגבל משמרות, עבור הפרמטרים יישור של כל פלח. כלול בשחזור רק אלה מגזרים המקיימים את האילוצים.
- לאחר כל מחזור איטרטיבי חידוד, שחזור 3D שנוצר באמצעות השלכה לאחור מחולק סכום מעל CTF2.
- להטיל את הסימטריה הסליל כדי ליצור נפח symmetrized. עידון איטרטיבי מסתיימת כאשר אין שיפור נוסף בהחלטת השחזור 3D חדשה מתרחשת.
- עיבוד התמונה SPIDER חבילת משמש את רוב הצעדים עידון. סדרה של פעולות נשלטים על ידי סקריפטים SPIDER, אשר יצר בקרה למשתמש אצווה קבצים המכילים רצפים של פעולות ערכי פרמטרים. השיקום הסופי מחושב באמצעות תוכניות SPIDER הסוויטה.
5. נציג תוצאות:
אחד HIV-1 CA A92E שפופרת (איור 1 א) היה מחוץ התאגרף התמרת פורייה שלה (איור 1b) היה מחושב עבור לאינדקס הסליל. עבור קווי שכבת (1, 0) ו - (0, 1), אני 10 = 28, אני 01 = 37, R 10 = 55, R 01 = 44. בהינתן רדיוס הצינור של 211.57Å, אנו מקורב 10 n =- 12, 01 n = 11 (כאן, handedness היה קבוע מראש). עם מרחק שידור חוזר של 5195.48Å, הסימטריה הבורג של הצינור נקבעה Δz = 6.8093Å, Δφ = 328.88 מעלות. Δz ו Δφ היו מעודן 7.1321Å ו 328.86 ° באמצעות IHRSR (איור 2 א) ו השיקום הראשוני מוצג באיור. 2b. שחזור הגמר (איור 3), אחרי איטרטיבי עידון, שיפרה את מפת צפיפות משמעותית מן הדגם הראשוני מחושב עם IHRSR (איור 2b).
באיור 1. Indexing של הצינור HIV-1 הסליל CA. (א) יחיד HIV-1 CA תמונה A92E צינור. סרגל קנה מידה, 30 ננומטר. (ב) להפוך פורייה של הצינור שמוצג (A). המדדים הסליל (10 n =- 12, 01 n = 11) מסומנים. ראש החץ מצביע על קו שכבת ברזולוציה 23 א.
איור 2. השחזור הראשונית באמצעות IHRSR. (א) סימטריה בורג להגדרה עבור כל מחזור איטרטיבי. Δφ ו Δz, החל הערכים ההתחלתיים, להתכנס הערכים יציבה לאחר 10 מחזורים איטרטיבי עידון. (ב) המפה הראשונית צפיפות 3D אחרי 10 מחזורים איטרטיבי.
איור 3. מפת צפיפות 3D אחרי עידון איטרטיבי. (AC) מפת צפיפות CA צינורות מוצג שלוש פרוסות אורתוגונליים: מקביל לציר הצינור קרוב לפני השטח (A), בניצב לציר הצינור (ב), ובמקביל ודרך ציר הצינור (C) . סולם ברים, 10 ננומטר. (ד) עיבוד פני השטח של מפת הצפיפות בקווי מתאר 3D ב 1.8s התוחם נפח 100%.
Discussion
אנו מציגים קבוצה של פרוטוקולים כדי לספק גישה פשוטה להשיג מבנים 3D של אובייקטים הסליל. שימוש בהליכים שתוארו, רכשנו מבנה 3D של הרכבה-HIV-1 capsid מהתמונה צינור יחיד (176 חלקים). מבנים ברזולוציה גבוהה יכולה להיות מושגת על ידי הכללת נתוני התמונה יותר.
ישנן כמה נקודות קריטיות עבור איסוף נתונים ניתוח אופטימלית: ראשית, במהלך הכנת הדגימה cryo-EM, הפתרון צריך להיות מדגם מחק משם, משאיר שכבה אחידה, דקה של הפתרון הזה הוא מעט עבה יותר גודל המדגם. ישנן דרכים שונות למחוק את המדגם. עבור תאים חיידקיים דגימות צינורי, כגון HIV-1 CA הרכבה, סופג מצד אחד, במיוחד בצד הגב, הוא המתאים ביותר.
שנית, handedness של הסליל צריך להיות נחוש, כמו זה לא יכול להיעשות על ידי אינדקס שחזור או הסליל. מנהג נפוץ הוא להשתמש להקפיא תחריט, ואחריו רוטרי הצללה 18 כדי לקבוע handedness. Handedness ניתן גם נקבע שלאחר השחזור כאשר הרזולוציה של המפה צפיפות גבוהה מספיק; הדגמים אטומי 3D של רכיבים בודדים צריכה להתאים היטב במפת צפיפות כאשר handedness נכונה ההנחה. אחרת, handedness ההפך יש להניח.
שלישית, מסנן וינר אמור לשמש במהלך עיבוד תמונה, לשלב והן תיקון משרעת, כדי להפחית את רעש הגברה. מאז CTF מתוך תמונה אחת תמיד יש אפס המעברים, חלק מן המידע בחלל הגומלין הולך לאיבוד. לכן, זה הכרחי כדי לקבל נתונים הקרנה מרובות קובע כלל עבור 3D שיקום, כל הדמיה בערכים defocus שונים.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לד"ר Gongpu ג'או Danxia Ke לקבלת תמיכה טכנית. אנו מודים בני הזוג. אדוארד Egelman וניקו Grigorieff לשיתוף תוכנת עיבוד התמונה שלהם. אנחנו גם מכירים את הצוות התומכים לביולוגיה מבנית cryo-EM מתקן אשכול Beowulf ורשת באוניברסיטת פיטסבורג הספר לרפואה. עבודה זו נתמכה על ידי GM082251 ו GM085043.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glow-discharge device 100X | Glow-discharge device 100X | ||
| Tecnai Polara F30 microscope with a Field Emission Gun | FEI | ||
| Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan | ||
| Plunge-freezing device | Home-made manual gravity plunger | ||
| Quantifoil R2/1 200 mesh holely-carbon copper grids | Quantifoil Micro Tools | ||
| EM software EMAN | http://blake.bcm.edu/EMAN/ | ||
| EM software IHRSR | Programs available from Edward H. Egelmanhttp://people.virginia.edu/~ehe2n/ | ||
| EM software Spider | http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | ||
| MRC based helical processing software | Programs available from Koji Yonekurahttp://www.riken.jp/biostrmech/index.html | ||
| CTFFIND3/CTFTILT and Real-space helical refinement software | http://emlab.rose2.brandeis.edu/software |
References
- Frank, J., Radermacher, M. Three-dimensional reconstruction of single particles negatively stained or in vitreous ice. Ultramicroscopy. 46, 241-262 (1992).
- Henderson, R. Structure of Purple Membrane from Halobacterium-Halobium - Analysis of X-Ray-Diffraction Pattern. J Mol Biol. 93, 123-128 (1975).
- Egelman, E. H. The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers. J Struct Biol. 157, 83-94 (2007).
- Egelman, E. H., Francis, N., Derosier, D. J. F-Actin Is a Helix with a Random Variable Twist. Nature. 298, 131-135 (1982).
- Nogales, E., Whittaker, M., Milligan, R. A., Downing, K. H. High-resolution model of the microtubule. Cell. 96, 79-88 (1999).
- Jimenez, J. L. Cryo-electron microscopy structure of an SH3 amyloid fibril and model of the molecular packing. Embo J. 18, 815-821 (1999).
- Butler, P. J., Klug, A. Assembly of the particle of tobacco mosaic virus from RNA and disks of protein. Nat New Biol. 229, 47-50 (1971).
- Namba, K., Yamashita, I., Vonderviszt, F. Structure of the core and central channel of bacterial flagella. Nature. 342, 648-654 (1989).
- Byeon, I. J. L. Structural Convergence between Cryo-EM and NMR Reveals Intersubunit Interactions Critical for HIV-1 Capsid Function. Cell. 139, 780-790 (2009).
- Toyoshima, C., Unwin, N. Three-dimensional structure of the acetylcholine receptor by cryoelectron microscopy and helical image reconstruction. J Cell Biol. 111, 2623-2635 (1990).
- Toyoshima, C. Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. I. Indexing of diffraction patterns. Ultramicroscopy. 84, 1-14 (2000).
- Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions. J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).
- Yonekura, K., Toyoshima, C. Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. IV. Distortion correction and its combined application with real-space averaging and solvent flattening. Ultramicroscopy. 107, 1141-1158 (2007).
- van Heel, M. Single-particle electron cryo-microscopy: towards atomic resolution. Q Rev Biophys. 33, 307-369 (2000).
- Sachse, C. High-resolution electron microscopy of helical specimens: A fresh look at Tobacco Mosaic Virus. J Mol Biol. 371, 812-835 (2007).
- Mindell, J. A., Grigorieff, N. Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy. J Struct Biol. 142, 334-347 (2003).
- Frank, J. SPIDER and WEB: Processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).
- Zhang, P. J., Hinshaw, J. E. Three-dimensional reconstruction of dynamin in the constricted state. Nat Cell Biol. 3, 922-926 (2001).
