Summary
在一个活的动物研究干细胞分化的一个有吸引力的模式是涡虫扁虫。再生是由简单的截肢手术，很容易在一个基本的实验室进行的实验研究和药理学和基因（适合
Abstract
自由生活涡虫扁虫有一个历史悠久的实验使用，因为他们非凡的再生能力 1 。从这些动物切除的小片断，改革原体计划，缺少的车身结构的再生。例如，如果一个“主干”的片段是从一个完整的蠕虫切割，一个新的“头”将再生前方一个“尾巴”后方将重新恢复了原有的“头部到尾部的车身结构的极性截肢前（图1A）。
涡虫被称为“neoblasts'〜30种不同类型的细胞分化，在正常的身体动态平衡和执行组织再生的干细胞，是由再生。这种再生过程是可靠和容易证明。由于几个创业实验室，许多工具和功能基因的方法的奉献精神，现在已经为这个模型系统进行了优化。因此，相当最近已经取得了进展，在理解和操作基础 2-9涡虫的发育可塑性的分子事件。
涡模型系统将会以一个科学家的广泛利益。神经学家，模型给予机会研究整个神经系统的再生，而不是简单的再生/修复单个神经细胞的过程中，通常是在许多已建立的模型研究的重点。涡虫表达的神经递质10过多，代表的一项重要制度，为研究中枢神经系统的11，12的演变，行为甄别潜在的13，14 。
再生的结果是经得起药理和遗传apparoaches操纵。例如，可以进行筛选药物对再生的影响，只需放置在身体片段的药物含截肢后在不同时间点的解决方案。使用击倒方法（ 在体内的RNAi），这可以实现，通过显微注射周期或喂食细菌表达双链RNA的结构8，9，15，可以研究单个基因的作用。这两种方法都可以产生高外显率，例如，双极动物16-21再生的视觉冲击的表型。为了便于采用这种模式和实施这种方法，我们将展示使用涡虫日本三角涡虫的药理学和基因检测（在体内RNAi技术通过喂食）的视频在这条协议。
Protocol
1。中继片段再生实验
- 再生实验前至少5天停喂的蠕虫病毒的队列，以确保动物废物和摄取食物（30〜完整的蠕虫，每个蠕虫〜8-10毫米长的饥饿后）的。
- 在检测的一天，冲洗与水预先冷冻的平整的冰盘，并用保鲜膜覆盖平的冰面。使用镊子，一个滤纸上的保鲜膜。
- 几滴泉水浸湿的滤纸。转移到过滤器使用的移液管（<20％过滤蠕虫）涡虫。蠕虫过滤器，如果有必要可以重新定位，通过与更多的泉水repipetting。删除多余的液体。
- 使用手术刀，截肢动物的前尖，咽（ 图1A）前结束之间约中途一个单切头。
- 使用手术刀，截去尾部区域，由一个单一的削减约中间动物的尾部和后咽（ 图 1A）结束。删除多余的粘液，用手术刀切割后蘸用70％乙醇的纸巾。用手术刀多余的乙醇。
- 转移到培养皿中（100 x 25毫米深）通过含有泉水钳过滤器。等待〜3分钟（伤口缝合，观察一个捏和伤口变黑）。
- 冲洗干净，滤纸的Petri菜含有所需再生法和转移到恒温培养箱（24℃）介质的主干片段。
- 分数再生表型〜1周后，当再生结构识别（ 图 1A） 。
2。吡喹酮诱导再生：两极药理操纵
- 准备溶药物在DMSO（62.4mg 1ML PZQ 200MM股票）吡喹酮（PZQ）的股票。当天使用。
- 设为50毫升含药溶液中缓冲Montjuch盐（PZQ 90微米）。涡〜1分钟，以确保分散。
- 执行主干片段[＃1]，露出的树干碎片队列的最后一步[1.7] PZQ协议的详细以上的再生法。
- 24-48小时后，交换PZQ含有温泉水的媒体，洗衣机蠕虫（> 3）次。
- 返回蠕虫孵化器。分数两极（两个头， 图1B）切割后的一周。
3。再生的基因操作：在体内RNAi的喂养协议
- 检测前，准备鸡肝匀浆。丢弃从foodstock脂肪，黄颜色的部分，菜泥其余肝。过滤菜泥通过滤网和存储等分悬浮液（1.5ml离心管，-20℃）。
- 检测之前，准备aliquoting到1ML样品供应，储存于-20 ° C牛的红血细胞（红细胞）
- 选择用于RNAi的蠕虫病毒。三个同伙：感兴趣的基因，阳性对照组（基因与已知的RNA干扰表型;图1C，D和 E）和负控制（无RNAi的表型的基因，也有用的评估击倒水平相比，实验队列）。对于每个队列，使用〜250的蠕虫（〜8-10毫米长至少5天的饥饿后）。存放在塑料桶泉水。
- 对于每个RNAi的队列中，大肠杆菌表达dsRNA的目标感兴趣的基因大肠杆菌解冻股票[8]，随着鸡肝匀浆管[3.1]和红细胞管[3.2]。
- 佩莱细菌（13000克，1分钟）。移除上清液2xYT媒体（〜700μl）和重新悬浮颗粒。 Recentrifuge，在冰上，丢弃上清液，沉淀的地方。
- 创建大缸径P200的枪头，切断提示结束。在鸡肝匀浆（150μL）和红细胞（50μL）的混合物创建RNAi的喂养混合彻底重悬细菌沉淀。取出离心中的气泡。
- 觅食，删除包含蠕虫的塑料浴盆的水多数（离开〜1英寸深入）。涡流浴缸集中在这个容器中的中心的蠕虫，和吸管RNAi在一个网罗蠕虫圈饲养的组合。请使用移液管，仔细同轴电缆上的RNAi喂养混合逃出，没有其他食客的干扰！
- 喂奶后（约1小时），确定，美联储以及涡虫。这些蠕虫从摄入的红细胞深红色着色。丢弃他人。
- 小心地更换新鲜的泉水喂养的解决方案，最大限度地减少干扰，防止食物的排泄。要做到这一点，轻轻地本地化蠕虫使用移液管的管的一侧，倒入水混浊，并仔细地用清水取代倾盆而下的浴缸对面的墙上。长时间暴露在空气Resubmerge涡虫很快也会导致食物排泄。
- 松散SE铝容器的盖子，并返回到培养箱（24℃）
- 重复RNAi在多个周期中喂养协议（〜2-3天），穿插协议＃1]屏幕RNAi的表型再生周期。许多基因的有效供料和再生的一个标准协议显示在图2〜1个月，总工期。
修改这个计划，针对不同的基因作为最佳的协议将取决于mRNA的稳定性，组织定位，蛋白质perdurance，或排除多个喂养周期后再生一个表型的发展等因素。评估只是表型的显性筛选（明显），或定量PCR方法，有针对性的mRNA水平与阴性对照队列击倒水平。
4。代表性的成果：
主干片段再生实验是健壮的所有蠕虫应重新正常前后（“头到尾”）极性。这可以切割后的5天，前眼点（asterixed图1A）的出现，促成尽快拿下。然而，一周后完成恢复失去结构的形态发生。药理操纵主干片段再生PZQ产量双头蠕虫（ 图1B）也很强大（欧共体50 = 87（+ - ）11％的双极片段，70μM为48 小时 20 PZQ） 。两极发生在一个单一的再生周期。下在这些实验的疗效可能与药物的溶解度和/或存储，或使用不同的扁虫种PZQ是无效的问题。对于外显率较 低的药物，通常用于anteriorization指数得分从 22完整的两极的中间表型搁置。表型从积极的控制结构的RNAi， 如图1所示：RNAi 的日本三角涡虫6 - 1（D J六个- 1）的结果，在无眼表型23（ 图 1C），日本三角涡虫的PC2的RNAi（DJ - PC2）在损失厌恶的光响应24（ 图1D）和RNAi的结果， 日本三角涡虫βcatenin- 1（βcateninDJ - 1）的结果在两个为首的表型16-19日，从主干片段（ 图1E）21。这些表型，可以实现用下面这个简单的RNA干扰协议：DJ -六（FFxFx），DJ - PC2（FFFx），DJ -βcatenin- 1（FFxFx），其中F =饲养周期和x =分别再生周期。
图1：主干片段再生检测涡虫（上）和原理图（中） 左 ，形象地展现切除主干片段的位置。右键，躯干片段再生timecourse显示外观再生片段在指定的时间（天）乙PZQ曝光产生。双头涡虫的图像C“无眼”DJ -六- 1 RNA干扰，D动的DJ - PC2的RNAi蠕虫（染成红色）轻厌恶反应，亏损相比，移动控制蠕虫（染色产生的蠕虫绿色），E双极型涡虫的DJ -βcatenin1的RNAi 。在Be，原来的RNAi蠕虫前到底是面向左侧。
图2：典型RNAi的协议包括多个喂养（F）和再生周期（X）是有效的 D.许多基因敲除喂养和切割周期序列粳稻 。本议定书的个体基因可能需要修改，以产生最佳的结果，使用例如一个较少（括号）或更大数量的喂养和再生周期。
Discussion
这里描述协议详细分析，研究和操纵涡虫三角涡虫再生的粳稻。他们很简单，不需要专用设备等，他们可以很容易地在实验室或教室进行。分析可以单独进行，或合并化学药物药效在体内的基因筛查，可以在候选基因水平上进行，或适应无偏见的，高通量筛选 8 。无论是耐人寻味的涡虫的生物学研究自己的权利，或在体内功能在哺乳动物的同源性研究组织再生的替代模型的评估，这些方法应推动多元化的研究人员的兴趣。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
在实验室的工作是由NSF（MCB0919933）和国立卫生研究院（GM088790）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spring water | Kandiyohi. Premium Waters Inc. Minneapolis, MN | n/a | Other forms of spring water work well also. Trial first in viability assays. |
| 1 x buffered Montjuïch salts: NaCl (1.6mM), CaCl2 (1mM), MgSO4 (1mM), MgCl2 (0.1mM), KCl (0.1mM), NaHCO3 (1.2mM), HEPES (1.5mM). pH 7.4 at 24°C. | Multiple Suppliers | n/a | Artificial water for drug treatments during regenerative assays to ensure pH buffering. 5/8 Holtfreter’s solution is an alternative. |
| 2xYT Broth | Fisher Scientific | BP2467-500 | Media = 31 g/L . Autoclaved. |
| Petri Dish (100x25mm) | Fisher Scientific | 08-757-11 | Housing worms during regeneration cycles |
| Square Dish (100x100x15mm) | Fisher Scientific | 08-757-11A | Fill with water, freeze for ice tray used as worm cutting surface |
| Plastic tub: Ziploc Twist ’n Loc (16oz). | Various | n/a | Convenient water tight containers for RNAi cohorts |
| Chicken Liver | Commercial grocery | n/a | Bias towards organic supplies, owing to avoidance of antibiotics. |
| Hand Blender | Any Supplier | n/a | Use for making chicken liver puree |
| Wire 1mm Mesh strainer | Any Supplier | n/a | Use for straining chicken liver puree |
| Bovine red blood cells | Lampire Biological Laboratories | 7240807 | 100% Washed and pooled RBC suspension |
| Circular filter papers | Whatman, GE Healthcare | 1003 055 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-41 | |
| Sterile, surgical blades | Multiple Suppliers | n/a | |
| ±Praziquantel | Sigma-Aldrich | P4668 | Store powder aliquots in the dark at 4°C. Desiccate. |
| Dj-six-1 | GenBank AJ557022.1 | RNAi positive control for “eye-less” phenotype23 | |
| Dj-βcatenin-1 | GenBank AB181913.1 | RNAi positive control for two-headed phenotype17 | |
| Dj-PC2 | RNAi positive control for loss of light aversion phenotype24 |
References
- Morgan, T. H. Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata. Arch Entwm Org. 7, 364-397 Forthcoming.
- Robb, S. M., Ross, E., Sánchez Alvarado, A. SmedGD: the Schmidtea mediterranea genome database. Nucleic Acids Res. 36, 599-606 (2008).
- Forsthoefel, D. J., Newmark, P. A. Emerging patterns in planarian regeneration. Curr Opin Genet Dev. 19, 412-4120 (2009).
- Adell, T., Cebrià, F., Saló, E. Gradients in Planarian Regeneration and Homeostasis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
- Agata, K., Watanabe, K. Molecular and cellular aspects of planarian regeneration. Semin Cell Dev Biol. 10, 377-383 (1999).
- Newmark, P. A. &, Sánchez-Alvarado, A. Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics. Nat Rev Genet. 3, 210-219 (2002).
- Reddien, P. W., Sánchez-Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Ann Rev Cell Dev Biol. 20, 725-757 (2004).
- Reddien, P. W., Bermange, A. L., Murfitt, K. J., Jennings, J. R., Sánchez-Alvarado, A. Identification of genes needed for regeneration, stem cell function, and tissue homeostasis by systematic gene perturbation in planaria. Dev Cell. 8, 635-649 (2005).
- Newmark, P. A., Reddien, P. W., Cebria, F. &, Sánchez-Alvarado, A. Ingestion of bacterially expressed double-stranded RNA inhibits gene expression in planarians. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 11861-11865 (2003).
- Collins, J. J. Genome-Wide Analyses Reveal a Role for Peptide Hormones in Planarian Germline Development. PLoS Biology. 8, e10000509-e10000509 (2010).
- Cebrià, F. Regenerating the central nervous system: how easy for planarians! Dev Genes Evol. , 733-748 (2007).
- Mineta, K. Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7666-7671 (2003).
- Oviedo, N. J., Nicolas, C. L., Adams, D. S., Levin, M. Emerging Model Organisms. A Laboratory Manual Chapter. 8, (2009).
- Buttarelli, F. R., Pellicano, C., Pontieri, F. E. Neuropharmacology and behavior in planarians: translations to mammals. Comp Biochem Physiol. 147, 399-408 (2008).
- Sánchez-Alvarado, A., Newmark, P. A. Double-stranded RNA specifically disrupts gene expression during planarian regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 5049-5054 (1999).
- Gurley, K. A., Rink, J. C., Sánchez-Alvarado, A. Beta-catenin defines head versus tail identity during planarian regeneration and homeostasis. Science. 319, 323-327 (2008).
- Yazawa, S., Umesono, Y., Hayashi, T., Tarui, H., Agata, K. Planarian Hedgehog/Patched establishes anterior-posterior polarity by regulating Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 22329-22334 (2009).
- Petersen, C. P., Reddien, P. W. Smed-betacatenin-1 is required for anteroposterior blastema polarity in planarian regeneration. Science. 319, 327-330 (2008).
- Iglesias, M., Gomez-Skarmeta, J. L., Saló, E., Adell, T. Silencing of Smed-betacatenin1 generates radial-like hypercephalized planarians. Development. 135, 1215-1221 (2008).
- Nogi, T., Zhang, D., Chan, J. D., Marchant, J. S., S, J. A novel biological activity of praziquantel requiring voltage-operated Ca2+ channel beta subunits: subversion of flatworm regenerative polarity. PLoS Negl Trop Dis. 3, e464-e464 (2009).
- Oviedo, N. J. Long-range neural and gap junction protein-mediated cues control polarity during planarian regeneration. Dev Biol. 339, 188-199 (2010).
- Nogi, T., Levin, M. Characterization of innexin gene expression and functional roles of gap-junctional communication in planarian regeneration. Dev Biol. 287, 314-335 (2005).
- Mannini, L. Djeyes absent (Djeya) controls prototypic planarian eye regeneration by cooperating with the transcription factor Djsix-1. Dev Biol. 269, 346-359 (2004).
- Agata, K. Structure of the planarian central nervous system (CNS) revealed by neuronal cell markers. Zoolog Sci. 15, 433-440 (1998).
