Farmakologiska och funktionella genetiska analyser för att manipulera Regenerering av Planarian Dugesia japonica Published: August 31, 2011 doi: 10.3791/3058

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

John D. Chan¹, Jonathan S. Marchant¹

¹Department of Pharmacology and The Stem Cell Institute, University of Minnesota Medical School

Summary

En attraktiv modell för att studera differentiering stamceller i ett levande djur är planarian plattmask. Regenerering studeras med enkla amputation experiment som enkelt kan utföras i ett grundläggande laboratorium och kan bli föremål för farmakologiska och genetiska (

Abstract

Fritt levande planarian Plattmaskar har en lång historia av experimentell användning på grund av deras märkliga regenerativ förmåga ^1. Små fragment censurerade från dessa djur reformera den ursprungliga kroppen planen, efter förnyelse av saknade kroppens strukturer. Till exempel om en "stam" fragment är gjord av ett intakt mask, en ny "chef" kommer regenerera anteriorly och en "svans" att regenerera posteriort återställa den ursprungliga "head-to-tail" polaritet av kroppens strukturer före amputation (Figur 1A).

Regenerering styrs av planarian stamceller, så kallade "neoblasts" som differentieras till ~ 30 olika celltyper under normal kropp homeostas och verkställas vävnadsregenerering. Detta regenerativ process är robust och lätt att demonstrera. På grund av invigningen av flera banbrytande Labs, många verktyg och funktionella genetiska metoder har nu optimerats för denna modell system. Därför har avsevärda senaste framsteg gjorts i att förstå och manipulera de molekylära händelser som ligger till grund planarian utvecklande plasticitet ^2-9.

Det planarian Modellen systemet kommer att vara av intresse för ett brett spektrum av forskare. För neuroforskare, ger modellen möjlighet att studera förnyelse av hela nervsystemet, snarare än bara återväxt / reparation av enstaka nervceller process som vanligtvis står i fokus för studien i många etablerade modeller. Planarians uttrycka en uppsjö av signalsubstanser ^10, utgör ett viktigt system för att studera utvecklingen av det centrala nervsystemet ^{11, 12} och har beteendestörningar screening potential ^{13, 14.}

Regenerativ utfall kan bli föremål för manipulation av farmakologiska och genetiska apparoaches. Till exempel kan läkemedel screenas för effekter på förnyelse genom att helt enkelt placera kroppen fragment i läkemedelsutveckling lösningar som innehåller vid olika tidpunkter efter amputation. Den roll enskilda gener kan studeras med ÖVERVÄLDIGANDE metoder (in vivo RNAi), vilket kan uppnås antingen genom cykler av mikroinjektion eller utfodras bacterially-uttryckta dsRNA konstruerar ^{8, 9, 15.} Båda metoderna kan producera visuellt slående fenotyper vid hög penetrans, till exempel upprustning av bipolär djur ^16-21. För att underlätta införandet av denna modell och genomförandet av sådana metoder, visa vi i detta protokoll videon artikeln för farmakologiska och genetiska tester (in vivo RNAi genom att mata) med planarian Dugesia japonica.

Protocol

1. Trunk fragment förnyelse analys

1. Sluta mata en kohort av maskar i minst 5 dagar innan regenerativ analysen för att se till djuren är fria från avfall och intagen föda (~ 30 intakta maskar, varje mask ~ 8-10 mm långa post-svält).
2. På dagen för analysen, skölj en pre-frusen planat is skål med vatten och täcka de fasta iced ytan med plastfolie. Använd pincett, placera ett filterpapper på plastfolie.
3. Fukta filtret papper med några droppar källvatten. Överför planarians på filter (<20 maskar per filter) med hjälp av en pipett. Maskar kan flyttas på filtret, om nödvändigt, genom repipetting mer källvatten. Ta bort överflödig vätska.
4. Med hjälp av en skalpell, amputera huvudet med ett enda snitt görs ungefär halvvägs mellan den främre spetsen av djuret och den främre änden av svalget (Figur 1A).
5. Med hjälp av en skalpell, amputera svansen regionen genom ett enda snitt görs ungefär halvvägs mellan svansen slutet av djuret och bakre änden av svalget (Figur 1A). Ta bort överflödigt slem på skalpellen med en pappershandduk fuktad med 70% etanol efter kapning. Torka överskott etanol från skalpell.
6. Överför filtret via pincett i en petriskål (100 x 25mm djup) som innehåller källvatten. Vänta ~ 3 minuter (för tillslutning av sår, observeras av en klämmande och mörkfärgning av såret).
7. Skölj trunk fragment från filterpapper i petriskål som innehåller önskat medium för regenerativ analysen och överföring till thermostatted inkubator (24 ° C).
8. Betyg regenerativ fenotypen efter ~ 1 vecka, då regenereras strukturer kan identifieras (Figur 1A).

2. Farmakologisk manipulation av regenerering: bipolaritet framkallas av prazikvantel

1. Förbered prazikvantel (PZQ) lager av solubilizing drogen i DMSO (62.4mg PZQ i 1ml för 200mm lager). Används på samma dag.
2. Gör 50mL av läkemedel som innehåller lösning (90 mikroM PZQ) i buffrad Montjuch salter. Vortex för ~ 1 minut för att säkerställa spridning.
3. Utför stammen fragment regenerativ analys som beskrivs ovan [protokoll # 1], utsätta en kohort av stammen fragment till PZQ vid det sista steget [1,7].
4. Efter 24-48 timmar, utbyte PZQ innehåller medier för källvatten, tvätt maskar flera (> 3) gånger.
5. Återgå maskar till inkubatorn. Betyg bipolaritet (två huvuden, Figur 1B) en vecka efter kapning.

3. Genetisk manipulation av regenerering: in vivo RNAi utfodring protokoll

1. Före analysen förbereda homogenatet kycklinglever. Kasta fet, gul färgade sektioner från livsmedelslager och puré återstående levern. Filtrera puré genom maskorna sil och delprov suspension för lagring (1,5 mL rör, -20 ° C).
2. Före analysen förbereda nötkreatur röda blodkroppar (RBC) genom alikvotering utbudet till 1 mL prover, förvaras vid -20 ° C.
3. Välj maskar för RNAi. Tre kohorter används: gen, positiv kontroll (genen med kända RNAi fenotyp, Figur 1C, D & E) och negativ kontroll (genen utan RNAi fenotyp, även användbar för bedömning av ÖVERVÄLDIGANDE nivåer jämfört med experimentella kohort). För varje årskull, använd ~ 250 maskar (~ 8-10 mm långt efter att svälta i minst 5 dagar). Förvaras i källvatten i plast badkar.
4. För varje RNAi årskull, tina lager av E. coli uttrycka dsRNA riktade genen av intresse [8], tillsammans med en tub kycklinglever homogenatet [3,1] och en tub med röda blodkropparna [3,2].
5. Pellet bakterier (13.000 g, 1 minut). Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 2xYT media (~ 700μl). Recentrifuge, kassera supernatanten, placera pellets på is.
6. Skapa ett stort hål P200 pipettspetsen genom att skära bort i slutet av spetsen. Grundligt resuspendera bakteriella pelleten i en blandning av kycklinglever homogenatet (150 mikroliter) och röda blodkropparna (50 mikroliter) för att skapa RNAi utfodring mix. Avlägsna luftbubblor genom centrifugering.
7. För utfodring, ta bort merparten av vattnet från plastbalja innehåller maskar (lämna ~ 1 cm djup). Swirl badkar att koncentrera maskar i centrum för denna behållare och pipettera RNAi utfodring blanda i en cirkel corralling maskar. Använd en överföringspipett att noga lirka rymlingar tillbaka på RNAi utfodring mix, utan störande andra gästerna!
8. Efter utfodring (~ 1 timme), identifiera planarians som matas väl. Dessa maskar visar en djupröd färg från intas RBK. Släng andra.
9. Sätt försiktigt utfodring lösning med friskt källvatten, minimera störningar för att förhindra egestion av mat. För att göra detta genom att försiktigt lokalisera maskar på ena sidan av röret med hjälp av en pipett utgjuta grumligt vatten, och försiktigt ersätta med friskt vatten hälls ner den motsatta väggen i badkaret. Resubmerge planarians snabbt som långvarig exponering för luft resulterar också i livsmedel egestion.
10. Löst seal behållaren lock och återgå till inkubatorn (24 ° C)
11. Upprepa RNAi utfodring protokoll över flera cykler (~ 2-3 dagars mellanrum), varvat med regenerativ cykler [protokoll # 1] till skärmen för RNAi fenotyper. Ett standardprotokoll för utfodring och förnyelse effektivt för många gener visas i figur 2, som tar ~ 1 månad i sammanlagt minst.

Ändra detta system för olika gener, som optimal protokoll kommer att bero på faktorer såsom mRNA stabilitet, vävnad, protein perdurance eller utveckling av en fenotyp som hindrar flera utfodring cykler efter förnyelse. Bedöm ÖVERVÄLDIGANDE nivåer genom att helt enkelt screening för penetrans av fenotyp (om det uppenbara), eller genom qPCR metoder för att jämföra riktade mRNA nivåer med negativ kontroll kohorten.

4. Representativa resultat:

Stammen fragmentet förnyelse analysen är robust så att alla maskar ska regenerera med normal anterior-posterior ("huvud till stjärt") polaritet. Detta kan görs så snart som fem dagar efter styckning, vilket underlättas av uppkomsten av den främre eyespots (asterixed, Figur 1A). Dock uppstår fullständig morfologiska restaurering av förlorade strukturer efter en vecka. Farmakologisk manipulation av bålen fragment förnyelse av PZQ att ge två-hövdade maskar (Figur 1B) är också robusta (EC ₅₀ = 87 (+ -) 11% bipolär fragment, 70μM PZQ 48 timmar ^20). Bipolaritet sker över en enda regenerativ cykel. Lägre effekt i dessa analyser handlar sannolikt problem med läkemedels löslighet och / eller lagring eller användning av en annan plattmask arter där PZQ är ineffektivt. För läkemedel med lägre penetrans, är en anteriorization index används ofta för att göra mål mellanliggande fenotyper bortsett från komplett bipolaritet ^22. Fenotyper följd av RNAi av den positiva kontrollen konstruktioner visas i figur 1: RNAi av Dugesia japonica sex-1 (D j-sex-1) resulterar i en eyeless fenotyp ²³ (Figur 1C), RNAi av Dugesia japonica PC2 (Dj-PC2) resulterar i en förlust av ljuset motvilja svar ²⁴ (figur 1D) och RNAi av Dugesia japonica βcatenin-1 (Dj-βcatenin-1) resulterar i en två-hövdad fenotyp ^{16-19, 21} från stammen fragment (Figur 1E). Dessa fenotyper kan uppnås med hjälp av följande enkla RNAi protokoll: Dj-sex-1 (FFxFx), Dj-PC2 (FFFx), Dj-βcatenin-1 (FFxFx), där F = utfodring cykel och x = regenerativa cykeln respektive.

Figur 1:... Trunk fragment förnyelse analys A Vänster, Image of planarian (överst) och schematiska (mitten) för att visa platsen för exciderad bålen fragment Höger, tidsförloppet för bål fragment förnyelse visar utseendet på regenererande fragment vid olika tider (dagar) B Bild på två huvuden planarian produceras av PZQ exponering. C eyeless "masken producerat av Dj-sex-1 RNAi. D Förlust av ljus motvilja svar i orörliga Dj-PC2 RNAi maskar (färgas röd), jämfört med mobila kontrollrum mask (målat grön). E bipolär planarian producerad av Dj-βcatenin-1 RNAi. I vara, är den ursprungliga främre änden av RNAi maskar orienterade till vänster.

Figur 2: Sekvens av utfodring och styckning cykler för typiska RNAi-protokoll som består av flera utfodringar (F), och regenerativ cykler (x) som är effektivt för ÖVERVÄLDIGANDE av många gener i D. japonica. Ändring av detta protokoll för enskilda gener kan behövas för att ge optimalt resultat, till exempel med hjälp av ett färre (parentes) eller ett större antal utfodring och regenerativ cykler.

Discussion

De protokoll som beskrivs här ingående analyser för att studera och manipulera förnyelse av planarian Dugesia japonica. De är enkla och inte kräver specialiserad utrustning så att de lätt kan utföras i laboratoriet eller i klassrummet. Analyser kan utföras individuellt eller i kombination (för kemisk genetisk screening av läkemedel effektivitet i vivo) och kan utföras på den kandidat gennivå, eller är anpassningsbara till objektiva, högre throughput screening ^8. Vare sig för att studera spännande biologi planarians i sin egen rätt, eller för att bedöma in vivo-funktionen av däggdjur homologer i en alternativ modell för att studera vävnadsregenerering, bör dessa metoder katalysera intresse från en rad olika forskare.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spring water	Kandiyohi. Premium Waters Inc. Minneapolis, MN	n/a	Other forms of spring water work well also. Trial first in viability assays.
1 x buffered Montjuïch salts: NaCl (1.6mM), CaCl2 (1mM), MgSO4 (1mM), MgCl2 (0.1mM), KCl (0.1mM), NaHCO3 (1.2mM), HEPES (1.5mM). pH 7.4 at 24°C.	Multiple Suppliers	n/a	Artificial water for drug treatments during regenerative assays to ensure pH buffering. 5/8 Holtfreter’s solution is an alternative.
2xYT Broth	Fisher Scientific	BP2467-500	Media = 31 g/L . Autoclaved.
Petri Dish (100x25mm)	Fisher Scientific	08-757-11	Housing worms during regeneration cycles
Square Dish (100x100x15mm)	Fisher Scientific	08-757-11A	Fill with water, freeze for ice tray used as worm cutting surface
Plastic tub: Ziploc Twist ’n Loc (16oz).	Various	n/a	Convenient water tight containers for RNAi cohorts
Chicken Liver	Commercial grocery	n/a	Bias towards organic supplies, owing to avoidance of antibiotics.
Hand Blender	Any Supplier	n/a	Use for making chicken liver puree
Wire 1mm Mesh strainer	Any Supplier	n/a	Use for straining chicken liver puree
Bovine red blood cells	Lampire Biological Laboratories	7240807	100% Washed and pooled RBC suspension
Circular filter papers	Whatman, GE Healthcare	1003 055
Transfer Pipette	Fisher Scientific	13-711-41
Sterile, surgical blades	Multiple Suppliers	n/a
±Praziquantel	Sigma-Aldrich	P4668	Store powder aliquots in the dark at 4°C. Desiccate.
Dj-six-1		GenBank AJ557022.1	RNAi positive control for “eye-less” phenotype23
Dj-βcatenin-1		GenBank AB181913.1	RNAi positive control for two-headed phenotype17
Dj-PC2			RNAi positive control for loss of light aversion phenotype24