Summary
Een aantrekkelijk model voor het bestuderen van stamcellen differentiatie binnen een levend dier is de planarian platworm. Regeneratie wordt bestudeerd door eenvoudige amputatie experimenten die gemakkelijk worden uitgevoerd in een basic laboratorium en zijn vatbaar voor farmacologische en genetische (
Abstract
Vrijlevende planarian platwormen hebben een lange geschiedenis van de experimentele gebruik door hun opmerkelijke regeneratieve capaciteiten 1. Kleine fragmenten uitgesneden uit deze dieren de hervorming van het oorspronkelijke bouwplan na herstel van het missen van het lichaam structuren. Bijvoorbeeld als een 'stam' fragment is gesneden uit een intact worm, een nieuw 'hoofd' naar voren zal regenereren en een 'staart' zal achterzijde regenereren het herstellen van de oorspronkelijke 'head-to-tail' polariteit van het lichaam structuren voorafgaand aan de amputatie (figuur 1A).
Regeneratie wordt gedreven door planarian stamcellen, bekend als 'neoblasts' die in ~ 30 verschillende celtypes differentiëren tijdens de normale lichaam homeostase en gehandhaafd weefselregeneratie. Deze regeneratieve proces is robuust en gemakkelijk aan te tonen. Door de inzet van een aantal baanbrekende laboratoria, vele tools en functionele genetische methoden zijn nu geoptimaliseerd voor dit model systeem. Derhalve heeft de laatste tijd veel vooruitgang geboekt in het begrijpen en manipuleren van de moleculaire gebeurtenissen die ten grondslag liggen aan planarian ontwikkelingsplasticiteit 2-9.
Het planarian modelsysteem zal van belang zijn voor een breed scala aan wetenschappers. Voor neurowetenschappers, het model biedt de mogelijkheid om de herontwikkeling van een hele zenuwstelsel bestuderen, in plaats van simpelweg de hergroei / reparatie van enkele zenuwcel proces dat meestal de focus van onderzoek in tal van bestaande modellen. Planarians drukken een overvloed aan neurotransmitters 10, vormen een belangrijk systeem voor het bestuderen van de evolutie van het centrale zenuwstelsel 11, 12 en hebben gedragsproblemen screening van potentiële 13, 14.
Regeneratieve uitkomsten vatbaar zijn voor manipulatie door farmacologische en genetische apparoaches. Kan bijvoorbeeld drugs worden gescreend voor de effecten op regeneratie simpelweg door het plaatsen van het lichaam fragmenten in drug-bevattende oplossingen op verschillende tijdstippen na amputatie. De rol van individuele genen kan worden bestudeerd met behulp van knock-down methoden (in vivo RNAi), die kan worden bereikt door cycli van micro-injectie of door het voeren van bacterieel-uiting dsRNA constructies 8, 9, 15. Beide benaderingen kunnen produceren opvallende fenotypes bij hoge penetrantie, bijvoorbeeld, de regeneratie van bipolaire dieren 16-21. Ter bevordering van de goedkeuring van dit model en de implementatie van dergelijke methoden, hebben we laten zien in deze video artikel protocollen voor farmacologische en genetische testen (in vivo RNAi door het voeren van) het gebruik van de planarian Dugesia japonica.
Protocol
1. Trunk fragment regeneratie-test
- Stop met het voeden van een cohort van wormen voor ten minste 5 dagen voor de regeneratieve test om ervoor te zorgen de dieren vrij zijn van afval en ingenomen voedsel (~ 30 intacte wormen, elke worm ~ 8-10 mm lang na de honger).
- Op de dag van de test, spoel een pre-bevroren genivelleerd ijs schotel met water en dek de vlakke bevroren oppervlak met plastic wrap. Met behulp van een tang, plaats een filter papier op de plastic verpakking.
- Bevochtig het filtreerpapier met een paar druppels bronwater. Overdracht planarians op filter (<20 wormen per filter) met behulp van een overdracht pipet. Wormen kunnen worden verplaatst op de filter, indien nodig, door repipetting met meer bronwater. Verwijder overtollige vloeistof.
- Met behulp van een scalpel, amputeren het hoofd door een enkele snede ongeveer halverwege tussen het voorste punt van het dier en de voorste einde van de keelholte (figuur 1a).
- Met behulp van een scalpel, amputeren van de staart regio door een snede gemaakt ongeveer halverwege tussen de staart van het dier en achterste einde van de keelholte (figuur 1a). Verwijder overtollig slijm op de scalpel met behulp van een papieren doekje bevochtigd met 70% ethanol na het snijden. Veeg overtollige ethanol uit scalpel.
- Transfer filter via pincet in een petrischaal (100 x 25mm diep) met bronwater. Wacht ~ 3 minuten (voor wondsluiting, waarneembaar door een te knijpen en donker worden van de wond).
- Spoel stam fragmenten uit filtreerpapier in petrischaal met gewenste medium voor regeneratieve assay en transfer naar thermostatted incubator (24 ° C).
- Score regeneratieve fenotype na ~ 1 week, wanneer geregenereerd structuren te identificeren (Figuur 1A).
2. Farmacologische manipulatie van regeneratie: bipolariteit geïnduceerd door praziquantel
- Bereid praziquantel (PZQ) voorraad door de oplossende medicijn in DMSO (62.4mg PZQ in 1 ml voor 200mm voorraad). Gebruik op dezelfde dag.
- Maak 50ml van geneesmiddel-bevattende oplossing (90 uM PZQ) in een gebufferde Montjuch zouten. Vortex voor ~ 1 minuut dispersie te garanderen.
- Voer kofferbak fragment regeneratieve assay zoals hierboven beschreven [protocol # 1], het blootstellen van een cohort van de romp fragmenten PZQ bij de laatste stap [1,7].
- Na 24-48 uur, wisselen PZQ-bevattende media voor bronwater, wassen wormen meerdere (> 3) keer.
- Keer terug naar wormen incubator. Score bipolariteit (twee koppen, Figuur 1B) een week na het snijden.
3. Genetische manipulatie van regeneratie: in vivo RNAi voeden protocol
- Voorafgaand aan de test, voor te bereiden kip leverhomogenaat. Gooi vettige, geel gekleurde delen van foodstock, en pureer de resterende lever. Filter puree door de mesh zeef en de hoeveelheid suspensie voor opslag (1,5 ml buizen, -20 ° C).
- Voorafgaand aan de test, voor te bereiden van runderen rode bloedcellen (RBC's) door aliquoting het aanbod in 1 ml monsters, bewaard bij -20 ° C.
- Selecteer de wormen voor de RNAi. Drie cohorten worden gebruikt: gen van belang, de positieve controle (gen waarvan bekend is RNAi fenotype, figuur 1C, D & E) en de negatieve controle (gen zonder RNAi fenotype, ook nuttig voor de beoordeling van knockdown niveaus ten opzichte van experimentele cohort). Voor elke cohort, gebruik ~ 250 wormen (~ 8-10 mm lang na honger voor ten minste 5 dagen). Bewaren in bronwater in plastic kuip.
- Voor elke RNAi cohort, ontdooien voorraad van E. coli te drukken dsRNA richten gen van belang [8], samen met een buis van kippenlever homogenaat [3,1] en een buis van RBC's [3,2].
- Pellet bacteriën (13.000 g, 1 minuut). Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 2xYT media (~ 700μl). Recentrifuge, gooi supernatans, plaats pellet op ijs.
- Maak een grote diameter P200 pipetpunt door het afsnijden van het einde van de tip. Grondig resuspendeer de bacteriële pellet in een mengsel van kippenlever homogenaat (150 pi) en RBC (50 ul) om RNAi voeden mix te maken. Verwijder luchtbellen door middel van centrifugeren.
- Voor het voeden, verwijder het grootste deel van het water uit de plastic kuip met wormen (laat ~ 1 inch diepte). Swirl bad om wormen te concentreren in het centrum van deze container, en pipet RNAi voeden mix in een cirkel in bedwang wormen. Gebruik een transfer pipet voorzichtig terug te coax ontsnapte op de RNAi voeden mix zonder verstoren andere gasten!
- Na het voeren (~ 1 uur), te identificeren planarians dat gevoed goed. Deze wormen vertonen een dieprode kleur van de ingenomen RBC. Gooi anderen.
- Plaats voorzichtig het voeden met een fris bronwater, het minimaliseren van verstoring van egestion van voedsel te voorkomen. Om dit te doen, voorzichtig lokaliseren van de wormen aan een kant van de buis met behulp van een transferpipet, uitgieten troebel water, en voorzichtig met vers water naar binnen giet de tegenoverliggende wand van het bad te vervangen. Resubmerge planarians snel als langdurige blootstelling aan lucht resulteert ook in voedsel egestion.
- Losjes seal deksel en terug te keren naar incubator (24 ° C)
- Herhaal RNAi voeden protocol over meerdere cycli (~ 2-3 dagen uit elkaar), afgewisseld met regeneratieve cycli [protocol # 1] om het scherm voor de RNAi fenotypes. Een standaard protocol voor het voeden en regeneratie effectief voor veel genen is weergegeven in figuur 2, die ~ 1 maand duurt in totaal duur.
Wijzig deze regeling voor de verschillende genen, zoals een optimale protocol zal afhangen van factoren zoals de mRNA stabiliteit, weefsel lokalisatie, proteïne perdurance, of de ontwikkeling van een fenotype dat meerdere voeden cycli sluit na regeneratie. Beoordeel knockdown niveaus door simpelweg screening op penetrantie van het fenotype (indien zichtbaar), of door qPCR benaderingen om gerichte mRNA niveaus te vergelijken met negatieve controle cohort.
4. Representatieve resultaten:
De stam fragment regeneratie test is robuust zodanig dat alle wormen te regenereren met een normaal anterior-posterior ("kop tot staart ') polariteit. Dit kan zodra de vijf dagen na het snijden, gefaciliteerd door de opkomst van de voorste oogvlekken (asterixed, Figuur 1A) worden gescoord. Echter, complete morfologische herstel van verloren structuren optreedt na een week. Farmacologische manipulatie van romp fragment wedergeboorte door PZQ tot twee-hoofdige wormen yield (Figuur 1B) is ook robuust (EG 50 = 87 (+ -) 11% bipolaire fragmenten, 70μM PZQ voor 48 uur en 20). Bipolariteit vindt plaats via een regeneratieve cyclus. Een lagere werkzaamheid bij deze testen gaat waarschijnlijk problemen met drugs oplosbaarheid en / of opslag of het gebruik van een andere soort platworm waar PZQ is ineffectief. Voor geneesmiddelen met een lagere penetrantie, is een anteriorization index vaak gebruikt om opzij scoren intermediaire fenotypen van volledige bipolariteit 22. Fenotypes als gevolg van RNAi van de positieve controle constructen zijn weergegeven in Figuur 1: RNAi van Dugesia japonica zes-1 (D j-zes-1) resulteert in een eyeless fenotype 23 (figuur 1C), RNAi van Dugesia japonica PC2 (Dj-PC2) resulteert in een verlies van de lichtschuwheid respons 24 (figuur 1D) en RNAi van Dugesia japonica βcatenin-1 (Dj-βcatenin-1) resulteert in een twee-hoofdige fenotype 16-19, 21 op de kofferbak van fragmenten (figuur 1E). Deze fenotypes kan worden bereikt met behulp van de volgende eenvoudige RNAi protocollen: Dj-zes-1 (FFxFx), Dj-PC2 (FFFx), Dj-βcatenin-1 (FFxFx), waarbij F = voeden cyclus en x = regeneratieve cyclus respectievelijk.
Figuur 1:... Stam fragment regeneratie test A Links, Afbeelding van planarian (boven) en schematisch (midden) de locatie van de romp weggesneden fragment zien Recht, tijdsverloop van de romp fragment regeneratie zien verschijnen van regenereren fragment bij bepaalde tijden (dag) B beeld van twee-hoofdige planarian geproduceerd door PZQ exposure. 'Eyeless' C worm geproduceerd door Dj-zes-een RNAi. D Verlies van lichtschuwheid respons in immobiele Dj-PC2 RNAi wormen (gekleurd rood), vergeleken met mobiele controle worm (in lood groen). E Bipolaire planarian geproduceerd door Dj-βcatenin-1 RNAi. BE in de oorspronkelijke voorste einde van de RNAi wormen is gericht aan de linkerkant.
Figuur 2: Volgorde van de voeding en snijden cycli voor typische RNAi-protocol, bestaande uit meerdere voedingen (F), en regeneratieve cycli (x) die effectief is voor knockdown van vele genen in D. japonica. Wijziging van dit protocol voor individuele genen kan nodig zijn om optimale resultaten te leveren, bijvoorbeeld met behulp van een minder (tussen haakjes) of een groter aantal voeding en regeneratieve cycli.
Discussion
De protocollen die hier beschreven detail assays voor het bestuderen en manipuleren van de regeneratie van de planarian Dugesia japonica. Ze zijn eenvoudig en vereisen geen speciale apparatuur zodanig dat zij gemakkelijk kunnen worden uitgevoerd in het laboratorium of in de klas. Testen kan individueel worden uitgevoerd, of gecombineerd (voor de chemische genetische screening van het geneesmiddel efficacies in vivo) en kan worden uitgevoerd op de kandidaat-gen niveau, of zijn aan te passen aan onpartijdige, hogere throughput screening '8. Of het nu voor het bestuderen van het intrigerende biologie van planarians in hun eigen recht, of voor het beoordelen in vivo functie van zoogdieren homologen in een alternatief model voor het bestuderen van weefselregeneratie, moeten deze benaderingen katalyseren belangstelling van een breed scala aan onderzoekers.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Werken in het lab wordt ondersteund door NSF (MCB0919933) en NIH (GM088790).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spring water | Kandiyohi. Premium Waters Inc. Minneapolis, MN | n/a | Other forms of spring water work well also. Trial first in viability assays. |
| 1 x buffered Montjuïch salts: NaCl (1.6mM), CaCl2 (1mM), MgSO4 (1mM), MgCl2 (0.1mM), KCl (0.1mM), NaHCO3 (1.2mM), HEPES (1.5mM). pH 7.4 at 24°C. | Multiple Suppliers | n/a | Artificial water for drug treatments during regenerative assays to ensure pH buffering. 5/8 Holtfreter’s solution is an alternative. |
| 2xYT Broth | Fisher Scientific | BP2467-500 | Media = 31 g/L . Autoclaved. |
| Petri Dish (100x25mm) | Fisher Scientific | 08-757-11 | Housing worms during regeneration cycles |
| Square Dish (100x100x15mm) | Fisher Scientific | 08-757-11A | Fill with water, freeze for ice tray used as worm cutting surface |
| Plastic tub: Ziploc Twist ’n Loc (16oz). | Various | n/a | Convenient water tight containers for RNAi cohorts |
| Chicken Liver | Commercial grocery | n/a | Bias towards organic supplies, owing to avoidance of antibiotics. |
| Hand Blender | Any Supplier | n/a | Use for making chicken liver puree |
| Wire 1mm Mesh strainer | Any Supplier | n/a | Use for straining chicken liver puree |
| Bovine red blood cells | Lampire Biological Laboratories | 7240807 | 100% Washed and pooled RBC suspension |
| Circular filter papers | Whatman, GE Healthcare | 1003 055 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-41 | |
| Sterile, surgical blades | Multiple Suppliers | n/a | |
| ±Praziquantel | Sigma-Aldrich | P4668 | Store powder aliquots in the dark at 4°C. Desiccate. |
| Dj-six-1 | GenBank AJ557022.1 | RNAi positive control for “eye-less” phenotype23 | |
| Dj-βcatenin-1 | GenBank AB181913.1 | RNAi positive control for two-headed phenotype17 | |
| Dj-PC2 | RNAi positive control for loss of light aversion phenotype24 |
References
- Morgan, T. H. Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata. Arch Entwm Org. 7, 364-397 Forthcoming.
- Robb, S. M., Ross, E., Sánchez Alvarado, A. SmedGD: the Schmidtea mediterranea genome database. Nucleic Acids Res. 36, 599-606 (2008).
- Forsthoefel, D. J., Newmark, P. A.
- Adell, T., Cebrià, F., Saló, E. Gradients in Planarian Regeneration and Homeostasis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
- Agata, K., Watanabe, K. Molecular and cellular aspects of planarian regeneration. Semin Cell Dev Biol. 10, 377-383 (1999).
- Newmark, P. A. &, Sánchez-Alvarado, A. Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics. Nat Rev Genet. 3, 210-219 (2002).
- Reddien, P. W., Sánchez-Alvarado, A.
- Reddien, P. W., Bermange, A. L., Murfitt, K. J., Jennings, J. R., Sánchez-Alvarado, A. Identification of genes needed for regeneration, stem cell function, and tissue homeostasis by systematic gene perturbation in planaria. Dev Cell. 8, 635-649 (2005).
- Newmark, P. A., Reddien, P. W., Cebria, F. &, Sánchez-Alvarado, A. Ingestion of bacterially expressed double-stranded RNA inhibits gene expression in planarians. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 11861-11865 (2003).
- Collins, J. J. Genome-Wide Analyses Reveal a Role for Peptide Hormones in Planarian Germline Development. PLoS Biology. 8, e10000509-e10000509 (2010).
- Cebrià, F. Regenerating the central nervous system: how easy for planarians! Dev Genes Evol. , 733-748 (2007).
- Mineta, K. Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7666-7671 (2003).
- Oviedo, N. J., Nicolas, C. L., Adams, D. S., Levin, M.
- Buttarelli, F. R., Pellicano, C., Pontieri, F. E. Neuropharmacology and behavior in planarians: translations to mammals. Comp Biochem Physiol. 147, 399-408 (2008).
- Sánchez-Alvarado, A., Newmark, P. A. Double-stranded RNA specifically disrupts gene expression during planarian regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 5049-5054 (1999).
- Gurley, K. A., Rink, J. C., Sánchez-Alvarado, A. Beta-catenin defines head versus tail identity during planarian regeneration and homeostasis. Science. 319, 323-327 (2008).
- Yazawa, S., Umesono, Y., Hayashi, T., Tarui, H., Agata, K. Planarian Hedgehog/Patched establishes anterior-posterior polarity by regulating Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 22329-22334 (2009).
- Petersen, C. P., Reddien, P. W. Smed-betacatenin-1 is required for anteroposterior blastema polarity in planarian regeneration. Science. 319, 327-330 (2008).
- Iglesias, M., Gomez-Skarmeta, J. L., Saló, E., Adell, T. Silencing of Smed-betacatenin1 generates radial-like hypercephalized planarians. Development. 135, 1215-1221 (2008).
- Nogi, T., Zhang, D., Chan, J. D., Marchant, J. S., S, J. A novel biological activity of praziquantel requiring voltage-operated Ca2+ channel beta subunits: subversion of flatworm regenerative polarity. PLoS Negl Trop Dis. 3, e464-e464 (2009).
- Oviedo, N. J. Long-range neural and gap junction protein-mediated cues control polarity during planarian regeneration. Dev Biol. 339, 188-199 (2010).
- Nogi, T., Levin, M. Characterization of innexin gene expression and functional roles of gap-junctional communication in planarian regeneration. Dev Biol. 287, 314-335 (2005).
- Mannini, L. Djeyes absent (Djeya) controls prototypic planarian eye regeneration by cooperating with the transcription factor Djsix-1. Dev Biol. 269, 346-359 (2004).
- Agata, K. Structure of the planarian central nervous system (CNS) revealed by neuronal cell markers. Zoolog Sci. 15, 433-440 (1998).
