Summary
वृद्धि कारक है और प्रोटीन की एक किस्म करने के लिए कोशिकाओं के विकास के दौरान विभिन्न सेल भाग्य पर लेने के लिए प्रेरित बातचीत. यहाँ हम ओवो तैयारी में उपयोग E2.5 लड़की भ्रूण पर मोती रखकर विकास में विभिन्न प्रोटीन के बीच बातचीत संभव पते प्रदर्शित करता है.
Abstract
न्यूरल ट्यूब विकास के दौरान विशिष्ट spatiotemporal पैटर्न में कई प्रोटीन व्यक्त करता है. ये प्रोटीन सेल भाग्य दृढ़ संकल्प, सेल प्रवास, और तंत्रिका सर्किट के गठन के लिए महत्वपूर्ण हो दिखाया गया है. Neuronal प्रेरण और patterning हड्डी morphogenetic प्रोटीन (BMP), ध्वनि हाथी (श), fibroblast वृद्धि कारक (FGF), दूसरों के बीच में शामिल है. विशेष रूप से, Fgf8 की अभिव्यक्ति पैटर्न BMP4 और श व्यक्त क्षेत्रों के लिए करीब निकटता में है. इस अभिव्यक्ति पैटर्न विकास कि बातचीत telencephalon में patterning की सुविधा के साथ संगत है.
यहाँ हम एक विधि है जिसमें एक ओवो तैयारी में अग्रमस्तिष्क के गठन में Fgfs के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक दृश्य प्रदर्शन प्रदान करते हैं. मोती प्रोटीन के साथ लेपित हैं और विकासशील न्यूरल ट्यूब में रखा निरंतर जोखिम प्रदान करते हैं. क्योंकि प्रक्रिया छोटे, ध्यान रखा मनकों का उपयोग करता है, यह न्यूनतम इनवेसिव है और इसके कई मोतियों एक एकल न्यूरल ट्यूब के भीतर रखा जा की अनुमति देता है है. इसके अलावा, विधि निरंतर विकास के लिए इतना है कि भ्रूण की अनुमति देता है है एक अधिक परिपक्व स्तर पर विश्लेषण किया जा सकता है है शरीर रचना विज्ञान और तंत्रिका patterning में परिवर्तन का पता लगाने. इस सरल लेकिन उपयोगी प्रोटोकॉल वास्तविक समय इमेजिंग के लिए अनुमति देता है. यह एक spatially और अस्थायी अंतर्जात प्रोटीन के स्तर तक ही सीमित परिवर्तन बनाने का मतलब है प्रदान करता है.
Protocol
1. इनक्यूबेटर से अंडे निकालें
E2-2.5 कम (~ 17 एचएच सेंट), अंडे को हटाने और उन्हें तदनुसार तैयार. वे पर काम किया जा सकता है है तुरंत या एक दो घंटे के लिए इनक्यूबेटर को लौट. अंडे कमरे के तापमान पर रखा जा सकता है है सुरक्षित रूप से एक घंटे से अधिक समय के लिए. अंडे जोड़तोड़ की अवधि के लिए रह सकते हैं. कभी कभी ये एक घंटे या अधिक ले जा सकते हैं.
नोट: अब वे कमरे के तापमान पर बैठते हैं, कम होने की संभावना है कि वे जीवित हैं.
2. भारत स्याही की तैयारी
- 4% बाँझ पीबीएस में भारत इंक का एक ताजा समाधान तैयार है.
- समाधान के साथ एक 3 एमएल सिरिंज भरें.
- एक 27 गेज सिरिंज, आधा इंच सुई रखें.
- Hemostats की एक जोड़ी का उपयोग एक 90 डिग्री के कोण करने के लिए सुई मोड़.
3. भारत स्याही के अंडे और इंजेक्शन को खोलना
- संदंश की एक जोड़ी का उपयोग, और वापस टेप छील विंडो खोलने, यह अंडे के पीछे की ओर पर टेप के रिवर्स साइड का उपयोग करके हासिल.
- Angled सुई गाइड जब तक यह भ्रूण के नीचे सिर्फ झूठ. अस्थायी डिस्क के तहत सुई रखकर सुनिश्चित करता है कि स्याही है, जो भ्रूण को विषाक्त है सीधे संपर्क में नहीं आ जाएगा.
- आप केवल पर्याप्त के लिए एक आरामदायक इसके विपरीत बनाने के लिए स्याही इंजेक्षन की जरूरत है. यह आम तौर पर कम से कम ¼ एमएल.
4. न्यूरल ट्यूब खोलना
- ठीक विच्छेदन कैंची की एक जोड़ी ले लो और पतली झिल्ली है कि शीर्ष पर है या कभी कभी, चारों ओर, भ्रूण में कटौती.
- 55 संदंश या एक टंगस्टन जांच की एक जोड़ी ले लो और न्यूरल ट्यूब को खोलने के पीछे से पूर्वकाल के लिए. सुनिश्चित करें कि खोलने काफी बड़े में एक मनका जगह है.
नोट: उम्र पर निर्भर करता है, एक ठीक टंगस्टन जांच एक ही बात करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
5. एक लेपित हेपरिन ऐक्रेलिक मनका पुनर्प्राप्ति
- 55 संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना, समाधान में एक अक्षुण्ण मनका मिल. मनका ही टिप देते हैं, धीरे धीरे संदंश करीब है.
- समाधान से मनका निकालें और यह अंडे के शीर्ष पर लाने के.
- एक बार मनका इसके समाधान के बाहर है, यह संभावना बंद नहीं आया जब तक यह albumin में रखा गया है.
6. मनका रखकर
- एक बार मनका लक्षित क्षेत्र के शीर्ष पर रखा गया है, एक टंगस्टन जांच का उपयोग करें यह अग्रमस्तिष्क की ओर गाइड या hindbrain में यह ठीक है.
- पीबीएस की कुछ बूँदें एक 10 μL विंदुक का उपयोग जोड़ें.
7. अंडे बंद
- टेप की पतली टुकड़ा का उपयोग कर खिड़की बंद करने के लिए अंडे बंद करें.
- Prepping प्रोटोकॉल के अनुसार, अंडे पर उपलब्ध सील http://jove.com/index/Details.stp?ID=306 .
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Discussion
प्रोटीन आप उपयोग करना चाहते हैं हैं पर निर्भर करता है, वहाँ कैसे तैयार करने के लिए मनकों पर अलग प्रोटोकॉल रहे हैं. इन प्रयोगों में, हम हेपरिन ऐक्रेलिक मोती का उपयोग करें, लेकिन Affi - जेल मोती भी इस्तेमाल किया जा सकता है. हमने पाया है कि हेपरिन ऐक्रेलिक मोती albumin अंडे के जलीय वातावरण में हेरफेर करने के लिए आसान कर रहे हैं. मोती प्रोटीन के 5 एल में भिगो कर रहे हैं रात डिग्री सेल्सियस 4 नियंत्रण मोती बाँझ पीबीएस में नियुक्ति के समय तक रखा जाता है. ओवो तैयारी में एक का उपयोग करने में लाभ यह है कि भ्रूण अभी भी जीवित है और के लिए एक सामान्य रूप से विकसित करने के लिए स्वतंत्र है. हालांकि वातावरण में एक explant रखा है विशेष चर के लिए नियंत्रित किया जा सकता है है, जीना भ्रूण विकास के पैटर्न पर एक प्रोटीन 2-3 के असर का सही प्रतिनिधित्व के लिए अनुमति देता है. सभी assays कि आप एक explant पर प्रदर्शन कर सकते हैं, आप एक भ्रूण के साथ कर सकते हैं.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Fertilized, E2-2.5 (~ St. 17 HH) | ||
| Incubator | Profi-I | Lyon | ||
| India Ink | Tool | Higgins | Prepare a 4% solution in sterile PBS. | |
| Sterile PBS | Alternatively, an antibody cocktail can be used | |||
| 1ml syringe | ||||
| 27G 1/2 needles | Tool | BD Biosciences | 305109 | Angled at 90 degrees |
| Forceps | Tool | World Precision Instruments, Inc. | size 55 | |
| Hemostats | ||||
| Dissection scissors | Tool | World Precision Instruments, Inc. | 500086 | vannas, 8.5cm |
| Parafilm tape | to seal eggs | |||
| Tungsten Probe | Tool | Electron Microscopy Sciences | 62091 | Tool #24. Handle optional. |
References
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies. Jounal of Visualized Experiments. 8, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306 (2007).
- Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles. Neuroscience. 108, 183-206 (2001).
- Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity. Development . 133, 2905-2913 (2006).
