Summary
Tregs являются мощными супрессоры иммунной системы. Существует недостаток уникальных маркеров поверхности, чтобы определить их, следовательно, определения Tregs в первую очередь функциональны. Здесь мы опишем оптимизированы
Abstract
Регуляторных Т-клеток (Tregs) являются важнейшими медиаторами иммунной толерантности к самостоятельной антигенов. Кроме того, они играют решающую роль регуляторов иммунного ответа следующие инфекции. Несмотря на усилия по выявлению уникальных маркеров на поверхности Tregs, только уникальная особенность заключается в их способности подавлять пролиферацию и функцию эффекторных Т-клеток. Хотя очевидно, что только в лабораторных анализов могут быть использованы в оценке человеческой функции Treg, это становится проблематичным при оценке результатов из перекрестных исследований, в которых здоровые клетки и клетки, выделенные из пациентов с аутоиммунными заболеваниями (например, диабетом типа 1-СД1) нуждаются в для сравнения. Существует большая вариабельность лабораторий в количестве и типе ответчик Т-клеток, характера и силы раздражения, Treg: ответчик соотношения и количества и типа антиген-представляющих клеток (АПК), используемых в человека в пробирке тесты подавления. Эта изменчивость делает сравнение между исследованиями измерения Treg функции трудно. Treg поле должно стандартизированного анализа подавления, что будет хорошо работать с обоими здоровых людей и людей с аутоиммунными заболеваниями. Мы разработали в пробирке подавления анализ показывает, что очень мало внутри-анализ изменчивости стимуляции Т-клеток, выделенных из здоровых добровольцев по сравнению с людьми с сопутствующими аутоиммунными разрушение поджелудочной β-клеток. Основной целью этой части является описание в пробирке человеческих анализа подавления, что позволяет провести сравнение между различными группами тему. Кроме того, этот анализ имеет потенциал, чтобы очертить небольшой потерей в nTreg функции и предвидеть дальнейшую потерю в будущем, таким образом, определение субъектов, которые могут извлечь пользу из профилактическую терапию иммуномодулирующими 1. Ниже мы приводим подробное описание этапов этой процедуры. Мы надеемся внести свой вклад в стандартизацию в пробирке подавления анализа, используемые для измерения Treg функции. Кроме того, мы предлагаем этот анализ в качестве инструмента для признать ранней стадии иммунного дисбаланса и потенциал функциональных биомаркером СД1.
Protocol
1. Перед настройкой подавления анализа, необходимо, чтобы покрыть tosylactivated бусин с анти-CD3 человека (клон UCHT1, окончательный 1μg/ml концентрация) для стимуляции клеток и потом проверить бисер эффективно покрытием путем создания в пробирке анализ распространения с использованием человеческих Т-клетки
- Возьмите 1 мл М-450 tosylactivated бусы из оригинального флакона, помещают в магнитное стоять и держать, пока все бусины присоединившимся к стороне трубки. Удалить буфер, пока трубка находится все еще в магнитных стенда. Возьмите трубку из магнитных стоять и добавить 1 мл buffer1, место трубки в магнитное снова встать и снять buffer1 в то время как трубка в магнитном стенде; ресуспендирования бисером в 1 мл buffer1 и добавить 40μl анти-CD3 человека, агитировать при 37 ° С в течение 15 минут, добавьте 0,1% м / о BSA и продолжают агитировать за следующие 16 часов.
- Вымойте бусины buffer2 два раза в течение 5 минут при температуре 2-8 ° С и один раз в buffer3 в течение 5 минут при температуре 2-8 ° С с использованием магнитных стоять, как описано выше, удалите буфер и ресуспендируйте бисером в 1 мл buffer2; бисер 4x10 8 / мл конечной концентрации и готов к использованию.
- Алиготе 50000 и 25000 РВМС / лунку в трем образцам в 96-луночного планшета и добавить переменное количество CD3 покрытием шариков (4x10 8 бусин / мл, CD3 1μg/ml, например 1, 2, 3, 4, 5 бусин / элемент ), с тем чтобы определить оптимальное количество бусин на ячейку. После 72 часов в культуре, добавить 1μCi [3 H] тимидина и продолжают инкубацию при 37 ° С в течение следующих 16 часов. Урожай клеток в Multiscreen пластины урожая (Millipore), добавить жидкие сцинтилляционные и читать импульсов в минуту (CPM) / также использованием Top Граф NXT (Packard, штат Коннектикут). Использование бусин / элемент отношения, когда CPMS выше 5000, но менее 15000, чтобы избежать перевозбуждения из Tregs, которые могут потерять подавляющую функцию. Как правило, соотношение 3 бисер / клетка стимулирует как ответчик и Treg клетки во всех предметных группах испытания до сих пор 1-4.
2. РВМС изоляции от цельной крови здоровых доноров или от человека leukopacks или лейкомассы (BC) обычно берут от здоровых добровольцев и предоставляется бесплатно от местных центров переливания крови (рис. 1)
- Развести до н.э. (~ 50 мл) с 1:06 PBS (добавить 250 мл). Теперь есть 300 мл общего объема. Медленно слой 25 мл разбавленной до нашей эры на вершине 15 мл Ficoll-Paque PLUS добавлены 50 мл Сокол трубы, не нарушая слоев. Центрифуга на 800xg (1400rpm в центрифуге Sorvall с качающимися ведро ротор SH-3000) в течение 30 минут при температуре 4 ° С, с тормозами выключен.
- Осторожно собрать слой РВМС (промежуточные фазы) и передать его на свежий 50мл Сокол труб. Вымойте РВМС, заполняя трубы до 50 мл с DPBS. Сбор 2 гранулы ячейки в одну трубу. Центрифуга на 400xg в течение 10 мин при 4 ° C. Повторите промывание войти дважды, каждый раз сочетание 2 гранулы клетки в одной трубе. Смешайте все ячейки шариков в одном 50 мл трубки.
- Граф РВМС использованием Голубой Трипан исключения тест. Сделать 1:10 растворение в Голубой Трипан путем добавления 20 мкл РВМС на 180μl из Голубой Трипан пятно. Хорошо перемешать и принимать 20 мкл рассчитывать в hemacytometer немедленно. Граф номера всех неокрашенных и только синий окрашенных клеток, расположенных в два квадратных блоков каждый из которых содержит 16 малых квадратов. Возьмите среднего числа и умножить на 10. Разделите это число на 100, чтобы получить число РВМС / мл. Процент жизнеспособных клеток рассчитывать, что и [1 - (количество синих клеток / общее количество клеток) x100]. Приступить в случае жизнеспособность ≥ 95%.
3. MACS предварительной сортировки клеток CD4 Т-клеток
- Прежде чем продолжить, передача 1 мл РВМС в новую пробирку, добавляют 4 мл среды для подготовки клетки при облучении 5000rad-они будут антиген-представляющих клеток (АПК).
- Центрифуга остальные клетки на 250xg в PBS/2mM EDTA/0.5% буфера BSA в течение 10 минут при 4 ° C. Слейте надосадочную и ресуспендирования клеток в 4 мл PBS/2mM EDTA/0.5% буфера BSA.
- Добавить 200 мкл MACS анти-CD4 микрошарики и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 20 минут.
- Вымойте, добавив 40 мл PBS/2mM EDTA/0.5% BSA буфера и центрифуге при 250xg в течение 10 минут при 4 ° C. Слейте надосадочную и ресуспендируют в 8 мл дегазированной, комнатная температура PBS/2mM EDTA/0.5% буфера BSA.
- Фильтр-отдельной клеточной суспензии с использованием предварительно разделения фильтров, прежде чем загружать их на колонку LS.
- Разделение суспензии клеток и слой 4мл каждого за калиброванный LS колонке (с 3 мл deggassed PBS/2mM EDTA/0.5% буфера BSA). Л. С. колонки фиксируется в сепаратор MidiMACS. Перед суспензии клеток заканчивается, либо повторно запустить flowthrough или добавить 3 мл deggassed комнатной температуре PBS/2mM EDTA/0.5% BSA буфера и пусть проходят через буфер. Добавить больше буфер, пока он выйдет ясно.
- Внесите 5 мл deggassed буфера на LS колонки, удалить LS столбца из сепаратора MidiMACS и поместить в новые стерильные 15 мл трубки коллекция позволяя ~ 1,0 мл пробегать. Поместите поршень в колонне и медленно толкать остальнойручки громкости.
- Сделайте то же самое и с Л. С. колонн и объединить два CD4 + фракций. Добавить до 50 мл PBS и считать клетки. Ожидаемая доходность до 5х10 8 клеток. Центрифуга на 400xg в течение 10 минут и ресуспендируют клетки также в 2 мл PBS/2mM EDTA/0.5% буфера BSA.
4. Флуоресцентные Активированный сортировки клеток (FACS) изоляции (рис. 2)
- Сделайте коктейль из антител к CD маркеров для следующих поверхности клеток маркеры (хранить в защищенном от света): 20 мкл анти-человеческий CD8-FITC (клон РПА-T8), 20 мкл анти-человеческий CD14-FITC (клон M5E2; LPS рецептор), 20 мкл анти-человеческий CD32-FITC (клон FLI8.26; FcγR типа II) и 6 мкл анти-человеческого CD116-FITC (клон M5D12; GM-CSFRα цепи) и, наоборот, добавить 40μl анти -человеческий CD4-APCCy7 (клон РПА-T4).
- Возьмите 5 мкл из 2 мл клеточной суспензии и пятна с 2μl пятен коктейль, это трубка для определения порога (флуорохромами минус один-FMO) 5.
- Добавить 50 мкл анти-человеческий CD25-PE (клон M-A251, Ил-2Rα), чтобы пятно коктейль, а также добавить коктейль для клеточной суспензии и инкубировать при температуре 4 ° С 30 минут. Вымойте клеток в PBS буфера, центрифуге при 400xg в течение 10 минут и ресуспендируют клетки к клетке концентрация 10 7 / мл.
- Подготовка неокрашенные клетки и клетки, окрашенные или шарики с одним флуорохромом для использования в качестве компенсации управления для сортировки клеток на FACS Ария (BD Biosciences, Сан-Хосе, штат Нью-Джерси).
- Приобретать клеток в трубке FMO, которая позволит пользователю установить порог для сортировки CD25 + Т-клеток (рис. 2а). Установить ворота вокруг FITC-негативные клетки, чтобы исключить FITC-положительных клеток включающий моноцитов, макрофагов и других лимфоцитов CD4 +-не-Т-клетки (рис. 2б).
- В отдельном участке, сделать ворота для CD25-, CD25low и CD25high Т-клетки-Tregs (верхний 1% клеток, экспрессирующих наибольшее количество CD25) (рис. 2в). Сотовые подмножества правило, свидетельствуют о высокой чистоты (Рис. 2d, 2e и 2е).
- Центрифуга коллекции трубки с клетками 400xg в течение 10 минут и держать их на льду до обшивки.
5. Настройка клеточных культур в 96-луночного планшета (схема приводится в табл.1) в 200μl/well
- Алиготе 50 мкл CD3 покрытием бисером (1 мкг / мл), рассчитанный в 3 бисер / ответчик ячейки хорошо, ресуспендируют в полной среде с 10% объединенных человека АВ сыворотки в U-дно 96-луночных планшетах. (Например, чтобы сделать 2 мл среды с CD3, покрытые оболочкой, принимают 7.5μl из запаса CD3 покрытием бисером финал 4x10 концентрации 8 / мл и разбавить в 2 мл среды, каждый 50 мкл будет содержать 75000 beads-3beads/cell).
- Развести облученных APC до 5х10 5 / мл концентрации клеток и добавить 50 мкл (будет содержать 2,5 х 10 4 клеток) в каждую лунку с ранее добавленного стимуляции, в том числе скважин помечены как "Tregs только", "APC только" и "средства массовой информации только" в таблице 1.
- Добавить 2,5 х 10 4 / а CD4CD25 или CD4CD25low Т-клеток в следующем трем образцам дизайна в таблице 1.
- Добавить Tregs к сотрудничеству культур (строка B, таблица 1) в соотношении 1:10 (2500 Treg клетки), а также скважин помечены как "Tregs только" и инкубировать пластины при температуре 37 ° C в CO 2 инкубаторе с 5% CO 2 , в насыщенной влажности в течение 72 часов.
- Импульсный скважин с 1μCi [3 H] тимидина и продолжают инкубацию при 37 ° С в течение следующих 16 часов.
6. Сбор и подсчет
- Урожай клеток на многоэкранных пластины урожай использованием Packard filtermate комбайн или альтернативные системы.
- Добавить сцинтилляционные жидкости (Microscint 20), накрыть крышкой уборки пластины с прозрачной пластиковой крышкой в рамках подготовки к заключительному шагу.
- Прочитано импульсов в минуту (CPM) / также использованием Top Граф NXT (Packard, КТ) или альтернативные системы.
7. Вычислительная процент подавления
- Как клетки культивировали в трем образцам, среднее значение рассчитывается для каждого условия. Если коэффициент вариации составляет> 30%, выброс исключается и только копий в минуту из двух скважин усредняются. Процент подавления получается путем вычисления [(п) / с] х 100%, где S = копий в минуту в одной культуре и с = копий в минуту в совместной культуре.
- Как наивны (CD25-) и в естественных условиях активирован (CD25low) эффекторные Т-клетки высевают в качестве ответчика Т-клеток, разница в способности Tregs подавить каждом из этих подмножеств захвачен и использован в качестве потенциальных функциональных показателей прогностической основывается на предпосылке, , что активированные клетки труднее подавить.
8. Представитель Результаты:
Великий изменчивости использованных методов и результатов, полученных в пробирке человеческих анализа подавления побудило нас провести всестороннее изучение условий, влияющих на анализе 1. Мы разработали анализа, которая проверяет не только Treg функции, но и их чистота, учитывая низкое соотношение между Tregs: Teffs (1:10), который мы определили ранее 6. Кроме того, Tregs отличаются йОДП способность успешно подавить наивно и в естественных условиях активированных Т-клеток, даже у здоровых людей, как показано на рисунке 3 и в наших предыдущих исследований, 2,4, который становится более заметным, если иммунный баланс находится под угрозой, так как по предметам, на риск развития СД1 . Анализ работал очень хорошо в кабинете, где мы сравнили подавляющие функцию естественного (nTregs), индуцируемый (iTregs) и в пробирке расширен nTregs, что позволяет нам сравнить их функции между здоровыми управления, последние началом (RO) T1D и давние (LS ) T1D предметам. Мы пришли к выводу, что РО T1D испытуемые должны были лучше мощность производящего функционала и iTregs и расширена nTregs по сравнению с LS T1D и здоровой контрольной группе 7. Таким образом, этот анализ может быть использована как отличный инструмент в признании как ранние и поздние состояния иммунного дисбаланса.
Схема 1 Схема презентация этапов в анализе подавление пробирке
Рисунок 1. Шаги в анализе подавление пробирке представлены с фотографиями
Рисунок 2. Память стратегии в изоляторе СУИМ. ) CD25 + порог был скорректирован в соответствии с флуорохромами минус один (FMO), б) клетки закрытого как FITC-отрицательных, в) FITC-негативные клетки были дополнительно закрытого типа, и собранные в CD + CD25-, CD + CD25low и CD + CD25high ( Tregs), показанные с процентами, г) FACS отсортированы Tregs после сортировки, е), FACS отсортированы CD + CD25low после сортировки, и е) FACS отсортированы CD4 + CD25-Т-клетки после сортировки
Рисунок 3. Представителю результаты здоровых людей) Представитель результаты импульсов в минуту (CPM) практически здоровых людей представлены в виде одной культуры для всех клеточных подмножеств участвует (наивно-CD25-, в естественных условиях активирован-CD25low, антиген-представляющих клеток, БТР и регуляторных Т-клеток-Treg), а также со-культур ответчик Т-клеток (CD25-или CD25low) и Tregs. б) Процент подавления каждого CD25-и CD25low ответчик Т-клеток путем аутологичной Tregs представляется для здоровой контрольной группой (п = 4). Подавление был рассчитан по формуле [(п) / с] х 100%, где S = копий в минуту в одной культуре и с = копий в минуту в совместной культуре. Хотя небольшая разница в мощности Tregs подавить ответчик Т-клеток, было замечено, он не был значительным (парный Т-тест р = 0,08). В) Представлены копии в минуту, по крайней риска предметов для каждой отдельной культуры, в том числе CD25-и CD25low как ответчик Т-клетки, а также АПК и Tregs, и сотрудничество культур, где каждая ячейка ответчик Т подмножество засеяно Tregs (CD25-/Tregs и CD25low/Tregs). г) Процент подавления каждого CD25-и CD25low ответчик Т-клеток путем аутологичной Tregs представляется для риску субъектов (п = 4). Разница в мощности Tregs подавить CD25-против CD25low ответчик Т-клеток было значительным (парный Т-тест р = 0,04).
Таблица 1. Схема настройка в анализе подавление пробирке
| 1-3 | 4-6 | 7-9 | 10-12 | |
| CD4CD25- | CD4CD25low | СМИ только | СМИ только | |
| B | CD4CD25-/ Tregs | CD4CD25low / Tregs | Tregs только | APC только |
| C | ||||
| D | ||||
| E | ||||
| F | ||||
| G | ||||
| H |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как только уникальная особенность, чтобы Tregs, подавляющие функции должны быть проверены надежно и равномерно между субъектами на различных стадиях развития заболевания в пределах одного и между различными исследованиями. Мы предлагаем детали подавления анализ в нашей лаборатории, как наш вклад в стандартизацию этом анализе. В нашем обширном исследовании оптимизации, мы определили, что T стимуляции клетки с анти-CD3 человека покрытием шариков (UCHT1 клон, концентрации 1μg/ml (в отличие от имеющихся в продаже 5μg/ml) в сочетании с РВМС как APC обеспечивают естественную стимуляцию способны активировать так как ответчик Т-клеток и Tregs в проверенных субъектов 1. выборе анти-CD3 антитела человека имеет большое значение, так как в наших руках только Анселл антител дали ожидаемых результатов. Одновременная стимуляция с анти-CD3 человека и анти- CD28 человека было недостаточно, чтобы обнаружить различия между субъектом групп (результаты не показаны), в то время РВМС предлагают полную палитру костимулирующих сигналов, увеличивая риск передачи сигнала и эффективной стимуляции.
Этот протокол может быть использован как с leukopacks и пациента кровь. Единственным отличием является количество крови, которая должна быть загружена на вершине Ficoll-Paque PLUS в процедуре изоляции РВМС. Медиа, используемые в этом анализе содержится 10% объединенных человека АВ сыворотки, которую мы намерены быть отличным дополнением к анализа. Тем не менее, перед использованием, сыворотка должна быть проверена на способность активировать РВМС по себе (семя РВМС в sixplicate и добавить полную СМИ RPMI со старым сыворотке, без сыворотки и с новой сыворотки. После 72 часов импульса пластины, инкубировать 16 дополнительных часов при 37 ° С, урожай клеток и получения копий в минуту чтениях). Увеличение копий в минуту в РВМС культивировали с новой сыворотки не является хорошим результатом и говорит о необходимости для сыворотки с новым номером партии.
Мы определили, что MACS сортировка производится вручную с новой колонки LS для каждого образца дает значительный урожай лучше CD4 + Т-клеток по сравнению с Automax. Кроме того, Treg чистота была определена в> 95%, если судить по выражению CD25 (Рис. 2d), отсутствие в пробирке пролиферации (рис. 3а), высокая подавляющих потенциал у здоровых людей в соотношении 1:10 между Treg: респонденты ( Рис 3AB) и высокий Foxp3 выражении среди изолированной камере подмножества T (данные не приведены). Загрязняющих клетки устраняется FITC свалки во время FACS сортировки процедуры в следующем шаге (рис. 2б). FACS окрашивания маркера CD4 не является необходимым, и это клеточной популяции можно увидеть через ФСБ в сюжет в сочетании с анти-CD25 человека, однако это может быть сделано. Tregs сортируются как топ 1% клеток, экспрессирующих наибольшее количество CD25 во всех предметных групп. Применяя этот строгий порядок на всех субъектов, независимо от статуса заболевания позволило нам использовать только одно соотношение между Tregs и ответчик Т-клетки (1:10) во всех предметных групп тестирования. Кроме того, на тех же условиях работают так хорошо, что разница в Treg подавляющих потенциал был замечен между наивным и в естественных условиях активированных Т-клеток используются в качестве реагирования, который, основываясь на различиях между ними, можно было бы ожидать 1. Мы также определили, что после сортировки FACS клетки должны быть остановлен, прежде чем создать в подавлении анализа.
Распространение измерялась с помощью тритием тимидина. Кроме того, пролиферации клеток может быть измерена с помощью 5-бром-2'-дезоксиуридина, аналоговый пиримидин, который включен во вновь синтезированной ДНК вместо тимидина. Обнаружение BrdU основан на диссоциации европий, ион связан с антителами, признавая BrdU (анти-BrdU-Eu), что в процедуре обнаружения сигналов получает диссоциированных выпуская флуоресценции, которую можно измерить в флуорометр 8. По словам производителя (Delfia) этого теста сравнима чувствительность к [3 H] тимидина. Отслеживание пролиферации клеток также может быть сделано с помощью, например, производные тетразолия соли в МТТ или XTT анализов можно получить АТСС, где отношения между числом клеток и сигнал, должна быть установлена во-первых, позволяет спектрофотометрического количественного изменения скорости клеточного пролиферацию и жизнеспособность. Еще одной альтернативой является использование DHL жизнеспособность клеток и пролиферации анализ, основанный на количественном флуориметрического живой клетки числами и жизнеспособность. Другие потенциальные выбор для окрашивания ответчик Т-клетки только с CFSE (карбоксифлуоресцеина сукцинимидил эфир) и контролировать снижение пятно с каждой следующей весовой категории на культивирование времени. Однако в зависимости от стимуляции, используемых в анализе, больше инкубацию более 48 часов может привести к неотличимы пики CFSE-положительных клеток. Таким образом, в каждом из тестов имеет свои преимущества и недостатки и должен быть оптимизирован для достижения желаемых результатов.
За тысячу показов для тестирования анти-CD3 человека покрытием всегда выполняются наздоровый РВМС и они должны быть выше 5000, но не выше 15000 для того, чтобы бусины, которые будут использоваться в этом типе анализа. Мы обычно настроить различные бусины / элемент соотношение при тестировании каждой партии из бисера мы делаем, и в большинстве случаев мы имеем наиболее последовательных копий в минуту с 3 бисер / ячейки с 25 000 клеток / лунку. Мы обычно повторить покрытие, если CPMS во время испытания партии находятся ниже 3000, пока мы не достигнем 5,000-15,000 копий в минуту / лунку. Таким образом, процесс нанесения покрытия был проверен на нескольких уровнях, и мы считаем надежными. Поэтому, когда CPMS определенной группы субъектов (как авто-антитело-положительных субъектов на риск развития СД1) последовательно ниже по сравнению со здоровыми людьми, у нас есть основания сделать вывод, что процесс передачи сигналов может быть нарушена. , Хотя многие исследования использовали наивных клеток реагирования в подавлении анализов опубликованных до настоящего времени 9-12, некоторые, например, использовали либо CD4 как респонденты в очень разных условиях анализа 13 или РВМС как реагирования, в присутствии РВМС как APC и установить их в одно-и со-культуры с добавлением Tregs 14 или 15, моноциты супрессоров. Хотя CPMS будет создан во всех вариациях и анализа выводов по поводу распространения будет сделано, мы считаем, что наличие чистой равномерное подмножество клетки как респонденты дают более конкретные результаты и имеет потенциал, чтобы сделать дополнительные выводы об обоих Tregs и реагирования. Поскольку наше подавление анализа представленных здесь включает в себя два отдельных чистой подмножества клетки как респонденты (CD4 + CD25-и CD4 + CD25low), можно получить ценную информацию о иммунного гомеостаза, когда результаты у здоровых людей сравнивают с пострадавшим или предметов риску развивать болезней, вызванных возмущением иммунного гомеостаза (как СД1). Как показывает все большее число исследований, в естественных условиях активированных Т-клеток (CD4 + CD25low) показывают, нарушениями чувствительности к подавляющий эффект Tregs 16-19. Точное объяснение такого поведения требует дополнительного изучения. В дополнение к этому, и мы, и другие показали, что Tregs у пациентов с СД1 имеют функциональный дефект 2,9,10, что также справедливо и для авто-антитела-позитивные темы, на риск развития СД1, как мы показали в Рисунок 6 в нашем недавнем докладе 1. Одной из возможностей является то, что все CD4 Т-клеток у пациентов пострадавших и на риск развития СД1 имеют один общий недостаток в передаче сигнала позволяет им реагировать на стимуляцию адекватно и влияющих на их эффекторные функции. В результате под угрозу передачи сигнала, отвечающий Т-клеток будет генерировать нижний копий в минуту (рис. 3в) и Tregs не будут подавлять эффективно. Это и другие возможности остаться в дальнейшем изучении. Из-за большой роли Tregs играть в здоровье и болезни, многие лаборатории измеряли Treg функции настройки анализ их потребностей и способностей. Таким образом, многие факторы, в анализе может варьироваться (ответчик / Treg изоляции, тип и количество респондентов, характера и силы раздражения, тип и количество APC, соотношение между ответчиком / Tregs, время в области культуры, а также метод контроля распространения ), влияющие Treg функции. Эта работа, а следовательно, имеет целью начать процесс стандартизации анализа облегчения и прямое сравнение различных исследований, оценивающих Treg функции.
В случае принятия этого протокола позволит сравнение Treg функции между различными лабораториями для субъектов пострадавших с СД1 и других аутоиммунных заболеваний. Этот протокол имеет широкое применение и могут быть использованы для оценки Treg функция любого субъекта, независимо от болезни, хотя его прогностическое значение относится только болезни, которые являются результатом возмущения иммунного гомеостаза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Макс Макги Национального исследовательского центра по делам несовершеннолетних Diabetesat Медицинского колледжа Висконсина и детской научно-исследовательского института штата Висконсин. Спонсоры не участвовал в дизайн исследования, сбор и анализ данных, или подготовке рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | Amersham | 17-1440-03 | |
| DPBS-1X | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| anti-CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| Pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| Anti-human CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) | BD Biosciences | 557852 | |
| Anti-human CD25-PE (clone M-A251; IL-2Rα) | BD Biosciences | 555432 | |
| Anti-human CD8-FITC (clone RPA-T8) | BD Biosciences | 555366 | |
| Anti-human CD14-FITC (clone M5E2; LPS receptor) | BD Biosciences | 555397 | |
| Anti-human CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR-type II) | BD Biosciences | 555448 | |
| Anti-human CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα chain) | BD Biosciences | 554532 | |
| Dynalbeads M-450 tosylactivated | Invitrogen | 140-13 | |
| Anti-human CD3 | Ancell | 144-024 | |
| Buffer1 | Home made | 0.1M Na2B4O7 pH7.6 | |
| Buffer2 | Home made | PBS/2mM EDTA/ 0.1% BSA pH7.4 | |
| Buffer3 | Home made | 0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5 | |
| Complete RPMI media | Home made | RPMI 1640 media 2 mM L-glutamine 5 mM HEPES 100 U/μg/ml peni/strept 0.5 mM sodium pyruvate | |
| [3H] thymidine | PerkinElmer, Inc. | NET027Z005MC | |
| human pooled AB serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
| Multiscreen harvest plate | EMD Millipore | MAHFC1H60 | |
| Microscint 20 | PerkinElmer, Inc. | 6013621 |
References
- Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).
- Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R. Application of arsenazo III in the preparation and characterization of an albumin-linked, gadolinium-based macromolecular magnetic resonance contrast agent. J. Neurosci. Methods. 157, 238-245 (2006).
- Supkowski, R. M., Horrocks, W. D. On the determination of the number of water molecules, q, coordinated to europium(III) ions in solution from luminescence decay lifetimes. Inorg. Chim. Acta. 340, 44-48 (2002).
- Menjoge, A. R., Kannan, R. M., Tomalia, D. A. Dendrimer-based drug and imaging conjugates: design considerations for nanomedical applications. Drug Discovery Today. 15, 171-185 (2010).
- Que, E. L., Chang, C. J. Responsive magnetic resonance imaging contrast agents as chemical sensors for metals in biology and medicine. Chem. Soc. Rev. 39, 51-60 (2010).
- Uppal, R., Caravan, P. Targeted probes for cardiovascular MR imaging. Future Med. Chem. 2, 451-470 (2010).
- Major, J. L., Meade, T. J. B. ioresponsive Bioresponsive, cell-penetrating, and multimeric MR contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 893-903 (2009).
- Datta, A., Raymond, K. N. Gd-hydroxypyridinone (HOPO)-based high-relaxivity magnetic resonance imaging (MRI) contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 938-947 (2009).
- Leôn-Rodríguez, L. M. D., Lubag, A. J. M., Malloy, C. R., Martinez, G. V., Gillies, R. J., Sherry, A. D. Responsive MRI agents for sensing metabolism in vivo. Acc. Chem. Res. 42, 948-957 (2009).
- Castelli, D. D., Gianolio, E., Crich, S. G., Terreno, E., Aime, S. Metal containing nanosized systems for MR-molecular imaging applications. Coord. Chem. Rev. 252, 2424-2443 (2008).
- Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99, 2293-2352 (1999).
- Lauffer, R. B. Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design. Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).
- Yoo, B., Pagel, An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging. Front. Biosci. 13, 1733-1752 (2008).
- Pandya, S., Yu, J., Parker, D. Engineering emissive europium and terbium complexes for molecular imaging and sensing. Dalton Trans. 23, 2757-2766 (2006).
- Nwe, K., Xu, H., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Ileva, L., Riffle, L., Wong, K. J., Brechbiel, M. W. A new approach in the preparation of dendrimer-based bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid MR contrast agent derivatives. Bioconjugate Chem. 20, 1412-1418 (2009).
- Nwe, K., Bernardo, M., Regino, C. A. S., Williams, M., Brechbiel, M. W. Comparison of MRI properties between derivatized DTPA and DOTA gadolinium-dendrimer conjugates. Bioorg. Med. Chem. 18, 5925-5931 (2010).
- Caravan, P., Das, B., Deng, Q., Dumas, S., Jacques, V., Koerner, S. K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -C., Zhang, Z. A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents. Chem. Commun. , 430-432 (2009).
- Leôn-Rodríguez, L. M. D., Kovacs, Z. The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates. Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).
- Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin αVβ3-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).
