Summary
Tregs는 면역 시스템의 강력한 진압하고 있습니다. 그들을 정의하는 독특한 표면 마커의 부족이있다, 그러므로, Tregs의 정의는 주로 기능입니다. 여기서 우리는 최적화된 설명을
Abstract
규제 T 세포 (Tregs)는 자기 항원에 면역 관용의 중요한 중재자입니다. 또한, 그들은 다음과 같은 감염 면역 반응의 중요한 규제하고 있습니다. Tregs의 독특한 표면 마커를 식별할 수 있도록 노력에도 불구하고, 유일한 고유 기능은 효과기 T 세포의 증식과 기능을 억제하는 능력이다. 그것은 체외의 assays 인간의 Treg의 기능을 평가에서 사용할 수있는 것이 분명이지만 건강한 세포와 세포가자가 면역 질환 (제 1 형 당뇨병 - T1D 등) 필요로하는 과목에서 격리 교차 단면 연구의 결과를 평가하면,이 문제가됩니다 비교합니다. 응답 비율과 항원 제시 세포의 수와 유형 (APC)는 체외 억제의 assays 인간의 사용 : 응답 T 세포, 자극의 자연과 강도, Treg의 수와 유형 실험실 사이 큰 변화가있다. 이 변화는 Treg 함수가 어려운 측정 연구 사이의 비교를합니다. Treg 필드는 건강한 과목과 면역 질환있는 사람 모두 잘 작동하는 표준 억제 분석이 필요합니다. 우리는 췌장 β - 세포의 면역 파괴를 기본과 과목에 비해 건강한 지원자에서 격리 T 세포의 자극에 아주 작은 내부 분석 변화를 보여줍니다 체외 억제 분석에을 개발했습니다. 이 작품의 주요 목표는 서로 다른 주제 그룹 간의 비교를 허용 체외 인간 억제 분석에 대해 설명하는 것입니다. 또한이 분석은 기능을 nTreg의 작은 손실을 윤곽을 그리다하고 앞으로 손실, 예방 immunomodulatory 치료 1에서 혜택을 누릴 수 있으므로 식별 과목을 예상할 수있는 잠재력이있다. 아래, 우리는이 절차에 관련된 단계 철저한 설명을 제공합니다. 우리는 Treg 기능을 측정하는 데 사용되는 체외 억제 분석에의 표준화에 기여할 수 있도록 최선을 다하겠습니다. 또한, 우리는 면역 불균형의 초기 상태와 T1D에 대한 잠재적인 biomarker 기능을 인식하는 도구로 분석을 제공합니다.
Protocol
1. 억압의 분석을 설정하기 전에, 이후 세포 자극과에 대한 안티 인간 인 경우에는 3 번 CD (복제 UCHT1, 최종 농도 1μg/ml)로 코팅 tosylactivated 구슬 하나 필요는 비즈가 효율적으로 인간을 사용하여 체외 확산 분석에를 설정하여 코팅 여부 확인 T 세포
- 원래 유리병, 자기 스탠드의 장소에서 M - 450 tosylactivated 구슬의 1ml을 가지고 모든 구슬이 튜브의 측면을 준수 때까지 기다려. 튜브는 자기 서서 아직도있는 동안 버퍼를 제거합니다. 37, 선동을 resuspend 비즈를 buffer1의 1ml 및 안티 인간 인 경우에는 3 번 CD의 40μl를 추가 °, 마그네틱 스탠드 밖으로 튜브를 타고 buffer1의 1ml을 추가, 다시 자기 스탠드에 튜브를 삽입하고 튜브는 자기 스탠드에있는 동안 buffer1를 제거 C 15 분, 0.1 % W / V BSA를 추가하고 다음 16시간에 대한 agitating 계속합니다.
- 버퍼를 제거하고 buffer2의 1ml에있는 구슬을 resuspend,, 비즈가 ° C 한번 5 분 buffer3에서 2-8에서 ° C 이상의 설명으로 자기 스탠드를 사용하여 2-8에서 5 분 동안 두 번 buffer2에 비즈 와시 4x10 8 / ML 최종 농도 및 사용을위한 준비.
- 나누어지는 50000 및 25000 PBMC / 잘 96 - 웰 플레이트에 triplicates에서 인 경우에는 3 번 CD - 코팅 구슬의 변수 번호 (4x10 8 구슬 / ML, 인 경우에는 3 번 CD에 들어 1μg/ml, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 구슬 / 셀 추가 ) 셀 당 구슬의 최적의 수를 결정하기 위해서. 문화 72 시간 후, 1μCi [3 H] thymidine을 추가하고 37 ° C 잠복기를으로 16 시간 동안 계속합니다. Multiscreen 수확 플레이트 (Millipore)에 수확 세포는 섬광 액체를 추가하고 위로 카운트 NXT (팩커드, CT)를 사용하여 잘 / 분 당 카운트 (CPM)을 참조하십시오. 진압 기능을 잃을지도 모른다고 Tregs의 overstimulation을 피하기 위해 비즈 / 노출당 비용은 5,000 위 아르 셀 비율이지만 미만 15,000을 사용합니다. 보통, 3 구슬 / 세포의 비율은 지금까지 테스트 1-4 전체 제목 그룹에서 응답하고 Treg 세포 모두를 자극.
2. 건강한 기증자 또는 인간 leukopacks 또는 일반적으로 지역 수혈 센터에서 무료로 건강 자원 봉사자 이용할에서 가져온 버피 코트 (BC) (그림 1)에서 전체 혈액에서 PBMC 절연
- BC을 (~ 50ml) 1시 6분 PBS로 (추가 250ml) 희석. 지금은 300ml 총 볼륨이 있습니다. 천천히 15ml Ficoll - Paque 위에 희석 BC의 25ml 계층 Plus는 레이어를 방해하지 않고, 50ml 팰컨 튜브에 추가됩니다. 4 30 분 ° C, 브레이크에 대한 800xg에서 원심 분리기는 (스윙 양동이 로터 SH - 3000와 Sorvall 원심 분리기에서 1400rpm) 해제.
- 조심스럽게 PBMC 층 (중간 단계)를 수집하고 신선한 50ml 팰컨 튜브로 전송할 수 있습니다. DPBS와 50ml로 튜브를 작성하여 PBMC 씻으십시오. 한 튜브에이 세포 알약을 수집합니다. 4 10 분 400xg에서 원심 분리기 ° C. 때마다 하나의 튜브로이 세포 알약을 결합하여, 두 번 세척 단계를 반복합니다. 단일 50ml 튜브로 모든 세포 알약을 결합합니다.
- Trypan 블루 제외 테스트를 사용하여 PBMC를 계산합니다. Trypan 블루 180μl 얼룩 PBMC의 20μl를 추가하여 Trypan 블루에서 1시 10분 희석하십시오. 잘 믹스 즉시 hemacytometer에서 셀 20μl 가져가라. 두 블럭 16 작은 사각형을 포함하는 각에 위치한 모든 흠없는 오직 푸른 스테인드 세포의 숫자를 계산합니다. 두 숫자의 평균을 10으로 곱하면됩니다. PBMC / ML의 번호를 100으로이 번호를 나눕니다. 가능한 세포의 비율로 계산 [1 - (총 세포의 세포 블루 / 숫자 번호) x100의]. 생존 능력은 ≥ 95% 경우 진행합니다.
3. CD4 T 세포의 맥 사전 정렬
- 계속하기 전에, 새로운 튜브로 PBMC의 1ml을 전송 5000rad - 다음과 방사선에 대한 세포를 준비하는 미디어 4ml를 추가 항원 제시 세포 (APC)가 될것이다.
- 4 10 분 대한 PBS/2mM EDTA/0.5 % BSA의 버퍼에 250xg에있는 세포의 나머지 부분을 원심 ° C. PBS/2mM EDTA/0.5 % BSA 버퍼의 4ml에 뜨는하고, resuspend 세포를 하거라.
- 맥스 안티 - CD4의 microbeads의 200μl를 추가하고 4 품어 ° C를 20 분.
- 4 10 분 대한 250xg에 PBS/2mM EDTA/0.5 % BSA 버퍼와 원심 분리기의 40ml를 추가하여 씻어 ° C. degassed, 실온 PBS/2mM EDTA/0.5 % BSA 버퍼의 8ml에 뜨는 및 resuspend을 하거라.
- LS 칼럼 그들을 로딩하기 전에 사전 분리 필터를 사용하여 필터 - 별도의 세포 현탁액.
- 세포 현탁액 및 레이어 4ml 각 이상의 보정 LS 칼럼 (deggassed PBS/2mM EDTA/0.5 % BSA 버퍼의 3ml)를 분할. LS 칼럼은 MidiMACS 구분 기호에서 해결되었습니다. 세포 현탁액은 다시 실행 flowthrough 중 하나를 실행하거나 PBS/2mM EDTA/0.5 % BSA 버퍼를 deggassed 실내 온도의 3ml 추가하고 버퍼를 통해 실행하게하기 전에. 그것이 밖으로 명확 올 때까지 더 많은 버퍼를 추가합니다.
- LS 칼럼에 피펫 5ml deggassed 버퍼를 통해 ~ 1.0ml 실행시키는 새로운 살균 15ml 수집 관에 MidiMACS 분리 및 장소에서 LS 열을 제거하십시오. 칼럼로 플런저를 넣고 천천히 나머지를 밀어볼륨보세요.
- 두 LS 컬럼과 동일한 작업을 수행하고 두 CD4 + 분수를 결합. 50ml PBS와 수를 셀 개까지 추가할 수 있습니다. 예상 수확량은 5x10 8 세포에 달려있다. 2ml PBS/2mM EDTA/0.5 % BSA 버퍼에 잘 10 분, resuspend 전지 400xg에서 원심 분리기.
4. 형광 활성 세포 정렬 (외과) 격리 (그림 2)
- 다음과 같은 세포 표면 마커 (빛으로부터 보호 유지)로 CD 마커에 항체의 칵테일 만들기 : 안티 - 인간의 CD8 - FITC (클론 RPA - T8), 안티 - 인간 CD14 - FITC (클론 M5E2 20 μl 20 μl; LPS 수용체), 안티 - 인간 CD32 - FITC (클론 FLI8.26 20 μl, FcγR 타입 II) 및 안티 인간 CD116 - FITC (클론 M5D12 6 μl, GM - CSFRα 체인) 및, 또는, 40μl 안티를 추가 인간 CD4 - APCCy7 (클론 RPA - T4).
- 2ml 세포 현탁액에서 5μl을 가지고 얼룩 칵테일의 2μl와 얼룩,이 임계값 (Fluorochrome 빼기 1 - FMO) 5를 결정하기위한 튜브입니다.
- 얼룩 칵테일로, 4 ° C 삼십분에 세포 현탁액과 부화 칵테일을 추가, 안티 - 인간 CD25 - PE (IL - 2Rα 복제 M - A251) 50 μl를 추가합니다. 10 7 / ML의 세포 농도로 10 분, resuspend 전지 400xg에서 PBS 버퍼, 원심 분리기에서 세포를 씻으십시오.
- 흠없는 세포와 세포 또는 외과 아리아 (BD Biosciences, 산호세, NJ)에서 셀 정렬에 대한 보상 제어로 사용할 하나의 fluorochrome 물들일 구슬을 준비합니다.
- 사용자가 CD25 + T 세포 (그림 2A)의 정렬에 대한 임계값을 설정할 수 FMO 튜브에 세포를 취득. monocytes, macrophages 및 기타 모든 CD4 + - 비 - T 세포 (그림 2B)로 구성된 FITC - 양성 세포를 제외 FITC - 부정적인 세포 주위에 게이트를 설정합니다.
- 별도의 음모에, CD25 -, CD25low 및 CD25high T 세포 - Tregs (상단 CD25 가장 높은 숫자를 표현하는 세포의 1 %) (그림 2C)의 빌 게이츠를 그립니다. 세포 하위 집합은 일반적으로 고순도 (그림 2D, 2E 및 2 층)를 보여줍니다.
- 10 분 400xg에서 전지 수집 튜브를 원심 분리기 및 도금까지 얼음에 있습니다.
5. 200μl/well에서 96 - 웰 플레이트 (계획은 Table1로 첨부)에서 세포 배양을 설정
- 인 경우에는 3 번 CD - 코팅 구슬 나누어지는의 50μl (1 μg / ML) 3 구슬 / U - 바닥에서 10 % 풀링된 인간 AB 혈청 완벽한 미디어 resuspended 우물에 응답 세포, 96 - 웰 플레이트로 계산. (예를 들어, 인 경우에는 3 번 CD - 코팅과 2ml 미디어를 만들기 위해, 인 경우에는 3 번 CD - 코팅 재고 비즈 - 최종 농도 4x10 8 / ML에서 7.5μl 가지고 미디어 2ml에 희석, 모든 50μl가 75,000 beads-3beads/cell를 포함합니다.)
- 5x10 5 / ML 세포 농도로 조사 APC를 희석하고 "오직 Tregs"로 표시 우물, "오직 APC"와 테이블에서 "미디어 전용"을 포함하여 이전에 추가 자극, 각 우물에 (2.5 X 10 4 세포를 포함) 50μl 추가 1.
- 표 1의 디자인을 다음과 triplicates 2.5 × 10 4 / 잘 CD4CD25 또는 CD4CD25low T 세포를 추가합니다.
- 비율 1시 10분 (2500 Treg 세포)의 공동 문화 (행 B, 표 1)과 "오직 Tregs"로 표시 우물에 Tregs을 추가하고 5 % CO 2와 CO 2 배양기에서 37 접시 ° C를 품어 72 시간 동안 포화 습도 인치
- 펄스 1μCi [3 H] thymidine과 우물 및 ° C으로 16 시간 동안 37 인큐베이션을 계속합니다.
6. 수확 및 계산
- 팩커드 filtermate 하베스터 또는 다른 시스템을 사용 multiscreen 수확 접시에 수확 세포.
- 섬광 액체 (Microscint 20) 추가 마지막 단계에 대비하여 투명 플라스틱 커버 플레이트를 수확 커버.
- 분 당 카운트 (CPM)을 읽기 / 잘 톱 카운트 NXT (패커드, CT) 또는 다른 시스템을 사용합니다.
7. 억압의 컴퓨팅 비율
- 세포 triplicates에서 교양 것처럼, 평균은 각 조건에 대해 계산됩니다. 변화의 계수가> 30 %면, 국외자는 평균 두 우물에서 제거되며 CPM입니다. 억제 비율은 계산에 의해 얻어진다 [(SC) / S] X 100 %, 어디서 S = 노출당 비용 (CPM) 단일 문화와 C = 공동 문화 노출당 비용 (CPM).
- 나이브 (CD25 -) 및 생체내 활성 (CD25low)에 효과기 T 세포 응답 T 세포로 도금이며, 이러한 집합의 각을 억제하는 Tregs의 능력의 차이는 전제를 기반으로 잠재적인 기능 전조 표시기로 캡처하고 사용되는 그 활성 세포 억제가 어렵습니다.
8. 대표 결과 :
방법에 큰 변화가 사용하고 체외 인간 억제 분석의에서 파생된 결과는 우리가 분석 한 영향을 미치는 조건의 종합적인 연구를 수행하라는 메시지가 나타납니다. 우리가 이전에 6 결정 Teffs (1시 10분) : 우리는 Tregs 간의 낮은 비율을 고려, Treg 기능뿐만 아니라 시험 분석뿐만 아니라, 자신의 순결을 개발했습니다. 또한, Tregs는 일에 차이가면역 균형에 문제가있다면 T1D 개발 위험이 과목에서와 같이 성공적으로 순진한와 그림 3에서 더 유명되고 우리의 이전 연구 2,4, 표시도 건강한 과목 생체내 활성화된 T 세포에 억제 EIR 능력 . 분석 우리가 건강 관리 사이에 자신의 기능을 비교할 수 있도록, 우리는 자연 (nTregs), inducible (iTregs)과 체외 확장의 nTregs에의 진압 기능을 비교 연구에서 매우 잘 작동, 최근 - 발병 (RO) T1D과 오랜 (LS ) T1D 과목. 우리는 RO T1D 과목 LS T1D 건강 관리 과목 7 비해 기능 iTregs 모두 및 확장 nTregs를 생성하는보다 능력이 있다고 결론을 내렸다. 따라서,이 분석은 면역 불균형의 초기과 늦은 상태 모두의 인식의 훌륭한 도구로 사용할 수 있습니다.
체외 억제 분석에 관련된 단계 계획 1 도식 프레 젠 테이션
그림 1. 사진과 함께 제공 체외 억제 분석의 각 단계
그림 2. 외과 세포 격리 게이팅 전략. A) CD25 + 임계값은 FITC - 부정적인 세포 (자세한 문이 있었고, CD + CD25 -, CD + CD25low과 CD + CD25high로 회수) 세포, C FITC - 부정적으로 문이되었습니다) Fluorochrome 빼기 1 (FMO), B에 따라 조정되었습니다 Tregs)가) 백분율, D로 표시 전자는 정렬 후 CD + CD25low를 정렬, 정렬 후 Tregs를 정렬 외과) 외과, 그리고 F) 정렬 후 정렬 CD4 + CD25 - T 세포를 외과
그림 3. 건강한 과목 대표 결과) 관련된 모든 셀의 하위 집합에 대해 하나의 문화로 제시 건강한 과목 (순진한 - CD25 -, 생체내 활성 - CD25low에서 항원 제시 세포 - APC의 분당 카운트 대표 결과 (CPM)을하고 각 CD25 및 autologous Tregs에 의해 CD25low 응답 T 세포가 건강한 제어 과목 제시 (N의 억압의 규제 T 세포 - Treg)뿐만 아니라 응답 T 세포의 공동 문화 (CD25 또는 CD25low)와 Tregs. B) 비율 = 4). 억제는 [(SC) / S]로 계산했습니다 X 100 %, 어디서 S = 노출당 비용 (CPM) 단일 문화와 C = 노출당 비용 (CPM) 공동 문화 인치 응답 T 세포를 억제하는 Tregs의 능력에 약간의 차이가 발견되었지만, 그것은. C (T - 테스트 P = 0.08 이점)) 발표는 응답으로 CD25 및 CD25low 포함하여 각 단일 문화에 대한 위험 과목에의 CPM 아르 중요 아니었 T 세포뿐만 아니라 각 응답 T 세포 부분 집합은 autologous 각 CD25 및 CD25low 응답 T 세포의 억제의 Tregs (CD25-/Tregs 및 CD25low/Tregs.) D) 비율과 씨앗을 품고있다 APC와 Tregs 및 공동 문화 Tregs는 위험 과목 (n은 = 4)에서 제시합니다. CD25 - 대 CD25low 응답 T 세포를 억제하는 Tregs의 용량의 차이는 상당한되었다 (T - 테스트 P는 = 0.04를 결합하여).
표 1. 개략도 체외 억제 분석에의 준비
| 1-3 | 4-6 | 7-9 | 10-12 | |
| CD4CD25 - | CD4CD25low | 전용 미디어 | 전용 미디어 | |
| B | CD4CD25 - / Tregs | CD4CD25low / Tregs | 단 Tregs | APC 전용 |
| C | ||||
| D | ||||
| E | ||||
| F | ||||
| G | ||||
| H |
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Discussion
Tregs 수있는 유일한 고유 기능으로, 진압 기능은 동일한 시간과 여러 연구 사이의 질병 개발의 다른 단계에서 과목 사이에 안정적으로 균일하게 테스트해야합니다. 우리는이 분석의 표준화로 우리의 기여로 저희 연구실에서 개발된 억제 분석의 세부 사항을 제공합니다. 우리의 광범위한 최적화 연구에서는, 우리는 안티 - 인간 인 경우에는 3 번 CD - 코팅 구슬 (APC로 PBMC와 함께 1μg/ml의 농도 UCHT1 복제 (같은 상용 5μg/ml 반대)와 T 세포의 자극 천연 자극을 제공하는 것으로 나타났습니다 단 Ancell 항체가 예상 결과를 준 우리 손에서와 같이 시험 과목 1 잘 응답 T 세포와 Tregs를 모두 활성화 능력. 방지 인간 인 경우에는 3 번 CD에 들어 항체의 선택은 매우 중요합니다. 방지 인간 인 경우에는 3 번 CD 및 안티과 동시 자극이 PBMC는 신호 전달과 효율적인 자극의 기회를 증가, 공동 stimulatory 신호의 전체 팔레트를 제공하면서 인간 CD28는 주제 그룹 (결과가 표시되지 않음) 사이의 차이를 감지하기에 충분되지 않았습니다.
이 프로토콜은 leukopacks와 환자의 혈액을 모두 사용할 수 있습니다. 유일한 차이점은 PBMC 분리 절차에서 Ficoll - Paque PLUS 위에 적재해야 혈액의 금액입니다. 이 분석에 사용되는 미디어는 우리가 분석에 큰 도움이 될 결정 10% 풀링된 인간 AB 혈청을 포함하고 있습니다. 그러나, 사용되기 전에, 혈청 sixplicate 자체 (씨앗 PBMC에서 PBMC 활성화하고 새로운 혈청없이 혈청과 함께, 기존의 혈청 전체 RPMI 미디어를 추가할 수있는 능력 테스트되어야한다. 72시간 펄스 후 판, 37 ° C, 수확 전지 16 추가 시간 품어 이상) CPM 수치를 구하십시오. 새로운 혈청과 교양 PBMC의 증가 노출당 비용 (CPM) 좋은 결과가 아니므로 새로운 로트 번호와 혈청에 대한 필요성을 제안합니다.
우리는 각각의 샘플에 대한 새 LS 칼럼과 수동으로 수행 정렬 맥은 Automax에 비해 CD4의 상당한 더 나은 수확량 + T 세포를주는 것으로 확인되었습니다. (조치 : 또한, Treg 순도가로 CD25 표현 (그림 2D), 체외 증식 (그림 3A), Treg 사이 비율 1시 10분에서 건강한 과목에서 높은 진압 가능성의 부족으로 판단> 95%로 결정했습니다 그림 3ab)과 분리된 T 세포 집합 (데이터가 표시되지 않음) 중에서 가장 높은 Foxp3의 표현. 오염 세포는 다음 단계 (그림 2B)의 절차를 정렬 외과 동안 FITC 덤프로 제거됩니다. CD4 마커의 얼룩 외과가 필요하지 않으며 안티 인간 CD25와 결합하면이 세포 인구가 음모에 FSC를 통해 볼 수있다, 그러나 그것은 할 수 있습니다. Tregs 모든 주제 그룹에서 CD25의 가장 높은 숫자를 표현하는 세포의 상위 1 %로 정렬됩니다. 독립적으로 질병 상태의 모든 과목이 엄격한 절차를 적용하는 것은 우리가 테스트한 모든 주제 그룹 Tregs 및 응답 T 세포 (1시 10분) 사이 한 비율을 사용할 수있었습니다. 또한, 동일한 조건 진압 가능성을 Treg의 차이가 순진하고 그들 사이의 차이에 따라 대응으로 사용 생체내 활성화된 T 세포에 1 예상 수 사이에 볼 것을 잘 작동합니다. 우리는 또한 외과 후 정렬 세포가 억제 분석에 설정되기 전에 다운 늘인 것으로 것으로 확인되었습니다.
확산은 tritiated thymidine를 사용하여 측정되었다. 또한, 세포 증식은 새로 합성된 DNA 대신 thymidine에 통합됩니다 5 - 브로모 - 2' - deoxyuridine, pyrimidine 아날로그를 사용하여 측정할 수 있습니다. BrdU의 감지 유로퓸의 분리, 신호 검출의 프로 시저에 fluorometer 8 측정할 수 dissociated 방출 형광를 얻을 수 BrdU (안티 BrdU - 약속)을 인식 항체에 바인딩 이온을 기반으로합니다. 제조 업체에 따르면 (DELFIA)이 분석은 [3 H] thymidine과 비교 감도있다. 추적 세포 증식도 사용 할 수 예를 들어, MTT 또는 생산 휴대폰 번호 및 신호 사이의 관계가 처음 설립되어야 ATCC에서 제공 XTT의 assays에 tetrazolium 소금의 유도체는 세포의 비율의 변화 분광 부량 수있게 증식 및 생존 능력. 또 다른 대안은 살아있는 세포 숫자와 생존의 fluorimetric 부량에 따라, DHL 세포 생존과 확산 분석을 사용합니다. 다른 잠재적인 선택은 CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl 에스테르)로 응답 T 세포를 얼룩과 culturing 시간 동안 모든 옆에 본부와 얼룩의 감소 모니터하는 것입니다. 그러나, 분석에 사용되는 자극에 따라 이상 48 시간 이상 배양은 CFSE - 긍정적인 세포 분간 봉우리가 발생할 수 있습니다. 따라서 assays의 각 일부 장점과 단점을 가지고 있으며 원하는 결과를 달성하기 위해 최적화되어야합니다.
안티 - 인간 인 경우에는 3 번 CD - 코팅 테스트를위한 노출당 비용은 항상에서 수행됩니다건강 PBMC 그리고 그들은 이런 종류의 분석에 사용되는 구슬 위해 5,000 위 있지만 15,000 이상이어야합니다. 우리가 만드는 구슬 각각의 배치를 테스트를 할 때 우리는 보통 다른 구슬 / 세포 비율을 설정하고, 대부분의 경우 우리는 / 잘 25,000 전지 3 비즈 / 세포와 가장 일치하는 CPM 있습니다. 배치 시험 동안 노출당 비용은 3000 아래있다면 우리는 5,000-15,000 노출당 비용 (CPM) / 잘 도달할 때까지 우리는 일반적으로 코팅을 반복합니다. 따라서 코팅 프로세스는 여러 레벨에서 확인하고 그것이 신뢰성이 고려되었습니다. 따라서, 대상의 특정 그룹의 노출당 비용은 (T1D 개발하기 위해 위험에 자동 항체 양성 과목 등) 지속적으로 건강한 과목에 비해 낮은 때, 우리는 그 신호 전달 과정에 문제가 발생한 것 정산 이유가 있습니다. 많은 연구가 지금까지 9-12 출판 억제 assays의 조치로 순진 세포를 사용했지만, 일부는 예를 들어, APC 등 PBMC의 존재에 조치 등 매우 다양한 분석 조건 13 또는 PBMC에서 조치로 CD4 중 하나를 사용하고있다 추가 Tregs 14 진압으로 monocytes 15 싱글 및 공동 문화에서 그들을 설정합니다. 노출당 비용이 확산이 이루어집니다 대한 모든 분석 변형 및 결론에서 생성된 것입니다 비록, 우리는 순수한 균일한 셀 집합을 가지고하면 응답자가보다 구체적인 결과를 제공하고 Tregs과 조치 모두에 대한 자세한 결론을 그릴 가능성이 보유로 생각합니다. 여기를 제시 우리의 억제 분석이 조치 (CD4 + CD25 및 CD4 + CD25low)와 같은 두 개의 순수 세포 하위 집합이 포함되어 있습니다, 그것은 건강한 과목의 결과로 위험에 영향이나 과목에 비해 때 면역 항상성에 대한 귀중한 정보를 얻을 수 있습니다 면역 항상성 (T1D와 같은)의 섭동으로 인한 질병을 개발. 마찬가지로 생체내 활성화된 T 세포의 연구의 증가에 의해 표시 (CD4가 + CD25low) Tregs 16-19의 진압 효과에 감도를 장애인 보여줍니다. 그 행동에 대한 정확한 설명은 더 조사가 필요합니다. 이 이외에도, 우리와 다른 T1D과 과목 Tregs 우리가에 나타난 것처럼 T1D 개발 위험, 자동 항체 양성 과목에도 적용됩니다 기능적 결함 2,9,10을 가지고 할 것으로 나타났습니다 최근 보고서 1 6 그림. 가능성 중 하나는 모든 CD4가 신호 전달의 일반적인 결함이 적절하게 자극에 반응을 방지하고 효과기 기능에 영향을 미치는가 T1D 과목 영향과 개발 위험에 세포를 T는 것입니다. 위험 신호 전달의 결과로, 응답 T 세포는 낮은 CPM (그림 3C로 표시)와 Tregs 효율적으로 억제 않았을 생성합니다. 이것은 다른 가능성은 더욱 탐험하는 남아 있습니다. 건강과 질병에 큰 역할 Tregs 플레이에 때문에 많은 실험실 자신의 필요와 능력에 분석을 조정 Treg 기능을 측정했습니다. 따라서 분석의 많은 요소 (응답 / Treg 격리를 입력하고, APC, 응답 / Tregs, 문화, 시간뿐만 아니라 모니터링 확산의 방법 사이의 비율의 자극 종류와 숫자의 답장, 자연과 강도의 개수 다를 수 있습니다 ), Treg 기능에 영향을 미치는. 이 작품은, 그러므로, Treg 기능을 평가 다른 연구 쉽고 직접 비교를 허용하는 분석의 표준화 과정을 시작하는 목표를하고 있습니다.
채택하는 경우,이 프로토콜은 T1D 및 기타 면역 질환과 영향을받는 과목에 대해 서로 다른 실험실 사이 Treg 함수의 비교를 허용합니다. 그 전조 값이 면역 항상성의 섭동 결과 것을에만 질병을 관련이 있지만이 프로토콜은 광범위한 애플 리케이션을 보유하고있는 피사체의 Treg 기능, 질병의 상관없이의 평가에 사용될 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 위스콘신과 위스콘신의 어린이 연구소 소년 Diabetesat 메디컬 칼리지에 대한 최대 맥기 국립 연구소에 의해 지원되었다. funders는 연구 설계의 데이터 수집과 분석, 또는 원고의 준비를 전혀 역할을 없었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | Amersham | 17-1440-03 | |
| DPBS-1X | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| anti-CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| Pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| Anti-human CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) | BD Biosciences | 557852 | |
| Anti-human CD25-PE (clone M-A251; IL-2Rα) | BD Biosciences | 555432 | |
| Anti-human CD8-FITC (clone RPA-T8) | BD Biosciences | 555366 | |
| Anti-human CD14-FITC (clone M5E2; LPS receptor) | BD Biosciences | 555397 | |
| Anti-human CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR-type II) | BD Biosciences | 555448 | |
| Anti-human CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα chain) | BD Biosciences | 554532 | |
| Dynalbeads M-450 tosylactivated | Invitrogen | 140-13 | |
| Anti-human CD3 | Ancell | 144-024 | |
| Buffer1 | Home made | 0.1M Na2B4O7 pH7.6 | |
| Buffer2 | Home made | PBS/2mM EDTA/ 0.1% BSA pH7.4 | |
| Buffer3 | Home made | 0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5 | |
| Complete RPMI media | Home made | RPMI 1640 media 2 mM L-glutamine 5 mM HEPES 100 U/μg/ml peni/strept 0.5 mM sodium pyruvate | |
| [3H] thymidine | PerkinElmer, Inc. | NET027Z005MC | |
| human pooled AB serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
| Multiscreen harvest plate | EMD Millipore | MAHFC1H60 | |
| Microscint 20 | PerkinElmer, Inc. | 6013621 |
References
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