Summary
Tregsのは、免疫系の強力な抑制因子である。それ故に、それらを定義するためにユニークな表面マーカーの欠如が存在する、Tregsのの定義は、主に機能的です。ここでは、最適化を説明
Abstract
制御性T細胞（Treg）は自己抗原に対する免疫寛容の重要なメディエーターである。さらに、彼らは感染後の免疫応答の重要な調節因子である。 Tregsの上でユニークな表面マーカーを同定するための努力にもかかわらず、唯一のユニークな特徴は、エフェクターT細胞の増殖や機能を抑制する能力です。それが唯一のin vitroアッセイにおいてヒトTregの機能を評価に使用される場合があることは明らかですが健康な細胞と細胞（1型糖尿- T1Dのような）自己免疫疾患を有する被験者から分離された横断的研究からの結果を評価する際に、これは問題となる必 要があります。比較する。応答者の比率とのin vitro抑制アッセイにおけるヒトで使用されている抗原提示細胞（APC）の数と種類：レスポンダーT細胞、刺激の性質と強さ、Tregの数と種類の研究所の間で大きなばらつきがあります。この変動は、困難なTregの機能を測定する研究間の比較を行います。 Tregのフィールドには、健常者と自己免疫疾患患者の両方でうまく動作する標準化された抑制アッセイを必要とします。我々は、膵β細胞の自己免疫破壊の根底にあるの被験者に比べて健康なボランティアから単離したT細胞の刺激ではほとんどのイントラアッセイのばらつきを示すin vitroでの抑制アッセイで開発した。この作品の主な目的は、異なる被験者グループ間の比較を可能にするin vitroでヒトの抑制アッセイで記述することです。さらに、このアッセイは、このように予防的免疫療法の1から利益を得ることができる科目を識別する、機能をnTregに小さな損失を描くと、将来のさらなる損失を予測する可能性を秘めています。以下、我々は、この手順に必要な手順の徹底的な説明を提供しています。我々はTregの機能を測定するために使用されるin vitroでの抑制アッセイの標準化に貢献したいと考えています。さらに、我々は免疫不均衡の初期の状態とT1Dのための潜在的な機能のバイオマーカーを認識するツールとして、このアッセイを提供する。
Protocol
1。抑制アッセイを設定する前に、その後の細胞の刺激とするための抗ヒトCD3（クローンUCHT1、最終濃度1μg/mlの）でコーティングtosylactivatedビーズへの1つのニーズは、ビーズが効率的に人間を用いた in vitro増殖アッセイで設定することによって被覆されているかどうかを確認するT細胞
- オリジナルバイアル、磁気スタンドの場所からM - 450 tosylactivatedビーズを1mlを取り、すべてのビーズがチューブの側面に付着するまで押し続けます。チューブは、磁気スタンドに入れたままでバッファを削除します。 37、撹拌機を再懸濁しますビーズをbuffer1の1mlの抗ヒトCD3の40μlのを追加°、磁気スタンドからチューブを取り、buffer1の1mlを追加、再び磁気スタンドにチューブを配置し、チューブを磁気スタンドにある間buffer1を削除するC 15分間、0.1％w / vのBSAを追加し、次の16時間攪拌を続行。
- バッファを削除するとbuffer2の1mlのビーズを再懸濁さ;ビーズがある℃、一回5分間buffer3で2〜8℃上記で説明したように磁気スタンドを使用して2〜8℃で5分間二回buffer2でビーズを洗浄4 × 10 8 / mlの最終濃度、使用できるようになります。
- 分注し50,000 25000 PBMC /ウェル、96ウェルプレートでトリプリケートでとCD3でコーティングされたビーズの数が可変（4 × 10 8ビーズ/ mlと、CD31μg/mlの、例えば1、2、3、4、5ビーズ/細胞追加）細胞当たりのビーズの最適数を決定するために。文化の中で72時間後、1μCi[3 H]チミジンを追加し、37℃でインキュベートし、次の16時間継続する。マルチスクリーン収穫プレート（ミリポア）で収穫細胞は、シンチレーション液を追加し、トップカウントNXT（パッカード、CT）を使用しても/分当たりのカウント（cpm）をお読みください。抑制機能を失う可能性が制御性T、の過剰刺激を避けるために、ビーズ/インプレッション単価が5000を超えている細胞の比率が15000未満を使用してください。通常、3ビーズ/細胞の比は、これまでに1から4までテストしたすべての被験者群でのレスポンダとTreg細胞の両方を刺激する。
2。地元の輸血センターから健康なドナーからのまたは人間leukopacksまたはバフィーコート（BC）からの全血からPBMCを分離、通常健康なボランティアから採取し、無料で利用できる（図1）
- BC（〜50ml）にPBS 1:6を（250ミリリットルを追加する）希釈してください。今すぐ300ミリリットルの合計体積があります。徐々に15ミリリットルをFicoll - Paqueの上に希薄化後のBCの25ミリリットル層PLUSは、層を乱すことなく、50ミリリットルのファルコンチューブに加えた。 4℃で30分間800xg（スイングバケットローターSH - 3000とソーバル遠心機で1400rpm）で遠心° C、ブレーキをオフにした。
- 慎重にPBMC層（中間相）を収集し、新鮮な50ミリリットルファルコンチューブに移す。 DPBSで50ミリリットルにチューブが満杯になってPBMCを洗ってください。つのチューブに2細胞ペレットを収集する。で10分間4℃で400xgで遠心分離、二回一本のチューブに2細胞ペレットを組み合わせたたびに洗浄ステップを繰り返します。シングル50ミリリットルチューブにすべての細胞ペレットを組み合わせる。
- トリパンブルー排除試験を用いてPBMCを数えます。染色トリパンブルーの180μlにPBMCの20μlのを追加してトリパンブルーで1:10希釈液を加えます。よく混和して、直ちに血球計でカウントする20μlのかかります。二つの四角いブロック16より小さい正方形を含むそれぞれの内にあるすべての未染色とのみ青色に染色された細胞数を数える。両方の数値の平均を取ると10を掛けます。 PBMC / mlの数を得るために100でこの数を分け。生存細胞の割合として計算する[1 - （全細胞の青色のセル/数の数）× 100]。生存率が≥95％の場合進みます。
3。 CD4 T細胞のMACS事前ソート
- 先に進む前に、新しいチューブにPBMCの1mlを転送する、5000rad - これらは、抗原提示細胞（APC）になると照射のために細胞を調製するためにメディアの4ミリリットル加える。
- 4℃で10分間PBS/2mM EDTA/0.5％BSAバッファー中で250xgでの細胞の残りを遠心分離℃にPBS/2mM EDTA/0.5％BSAバッファーの4ミリリットルで上清、再懸濁します細胞を捨て。
- MACS抗CD4マイクロビーズ200μlのを追加し、4℃でインキュベート℃で20分間。
- 4℃で10分間250xgでPBS/2mM EDTA/0.5％BSAバッファーと遠心の40ミリリットルを追加することで、洗う℃に脱気、室温PBS/2mM EDTA/0.5％BSAバッファーの8ミリリットルの上清と再懸を捨て。
- LSカラム上にロードする前に、プレセパレーションフィルターを使用してフィルタ - 別々の細胞懸濁液。
- キャリブレーションLSカラムに各細胞懸濁液および層の4ミリリットルを分割（deggassed PBS/2mM EDTA/0.5％BSAバッファーの3ミリリットルを持つ）。 LSカラムはMidiMACSセパレータに固定されています。細胞懸濁液は、再実行のフロースルー、不足またはdeggassed室温PBS/2mM EDTA/0.5％BSAバッファーの3ミリリットルを加えるとバッファがから実行できるようにする前に。それが出て明らかになるまでより多くのバッファを追加。
- LSのカラムにピペット5ミリリットルdeggassedバッファ、〜1.0ミリリットルを介して実行させる新しい滅菌15ミリリットルコレクションチューブにMidiMACSセパレータと場所からLSカラムを削除します。列にプランジャーを入れて、ゆっくりと残りの部分を押してくださいボリュームから。
- 両方のLSの列でも同じことが二CD4 +分画を組み合わせる。 50ミリリットルPBSとカウントセルを追加します。予想される収量は、5 × 10 8細胞までです。 2ミリリットルPBS/2mM EDTA/0.5％BSAバッファー中でも10分、懸濁し、細胞のために400xgで遠心分離します。
4。蛍光活性化細胞選別（FACS）の分離（図2）
- 、抗ヒトCD8 - FITC（クローンRPA - T8）、抗ヒトCD14 - FITC（クローンM5E2の20μlを、20μlの次の細胞表面マーカー（光から保護保持）にCDのマーカーに対する抗体のカクテルを作るLPS受容体）、抗ヒトCD32 - FITC（クローンFLI8.26の20μlを、FcγRのタイプII）と抗ヒトCD116 - FITC（クローンM5D126μlの、GM -CSFRαチェーン）とは、代わりに、40μlの抗を追加ヒトCD4 - APCCy7（クローンRPA - T4）。
- 5μlのは、2ミリリットルの細胞懸濁液を取り出し、汚れカクテルの2μlのと染色、これは、しきい値（蛍光色素マイナスOne - FMO）5を決定するためのチューブです。
- 染色カクテルに、そして4℃で30分で細胞懸濁液とインキュベートするカクテルを追加し、抗ヒトCD25 - PE（IL -2RαクローンM - A251）の50μlを追加。 PBS緩衝液、10分および10 7 / mlの細胞濃度に懸濁し、細胞のための400xgで遠心分離で細胞を洗浄。
- 未染色の細胞と細胞またはFACSアリア（BD Biosciences社、サンノゼ、ニュージャージー州）での細胞選別のために補償制御として使用する単一の蛍光色素で染色されたビーズを準備します。
- ユーザーは、CD25 + T細胞（図2a）のソートのしきい値を設定できるようになりますFMOチューブに細胞を取得する。単球、マクロファージおよび他のすべてのCD4 + -非T細胞（図2b）からなるFITC陽性細胞を除外するためにFITC -陰性細胞の周りのゲートを設定します。
- 別のプロットでは、CD25 -、CD25lowとCD25high T細胞- Tregsの（CD25の最大数を発現する細胞の上位1％）（図2c）のためにゲートを描きます。細胞サブセットは一般的に高純度（図2d、2eと2fを）示しています。
- 10分間400xgで細胞を用いたコレクションチューブを遠心し、メッキまで氷上で保管して下さい。
5。 200μl/wellで96穴プレート（表1として添付する方式）で細胞培養を設定する
- CD3でコーティングされたビーズのアリコート50μlの（1μg/ mlの）は3ビーズ/ U -底部では10％プールしたヒトAB血清で完全なメディアに再懸濁してウェル内のレスポンダのセル、96ウェルプレートになるように計算。 （たとえば、CD3でコーティングした2ミリリットルのメディアを作るために、CD3でコーティングされたの株式ビーズ-最終濃度4 × 10 8 / mlから7.5μl取るとメディアの2ミリリットルで希釈し、すべての50μlのは75,000 beads-3beads/cellが含まれます）。
- 5 × 10 5 / mlの細胞濃度と、"唯一のTregsの"というラベルの井戸を含む、以前に追加した刺激、との各ウェルに（2.5 × 10 4細胞を含む）50μlずつを追加し、"APCだけ"と、表の"メディアのみ"に照射APCを薄める1。
- 表1の設計は、次の連で2.5 × 10 4 /ウェルCD4CD25 -またはCD4CD25low T細胞を追加。
- 比1:10（2,500 Treg細胞）の共培養（列B、表1）にし、"唯一のTregsの"というラベルのウェルにTregsのを追加し、5％CO 2とCO 2インキュベーターで37℃プレート℃でインキュベートする、72時間飽和湿度インチ
- パルス1μCi[3 H]チミジンをウェルの中とは° C次の16時間37℃でインキュベーションを続ける。
6。収穫とカウント
- パッカードfiltermate収穫機または別のシステムを使用してマルチスクリーン収穫プレート上に細胞を回収。
- シンチレーション液（Microscint 20）追加、最後のステップの準備のために透明なプラスチックカバーでプレートを収穫するカバー。
- 分当たりのカウント数（cpm）を読んで/ウェルトップカウントNXT（パッカード、CT）または別のシステムを使用して。
7。抑制のコンピューティングの割合
- 細胞は三連で培養したように、平均を各条件ごとに計算されます。変動係数が> 30％の場合、外れ値が排除され、2つの井戸からのみCPMは平均化されます。抑制の割合は、共培養の単文化とc = CPMの計算[（SC）/秒] × 100％、S = CPMすることによって得られる。
- ナイーブ（CD25 -）とin vivoで活性化（CD25low） にエフェクターT細胞は、レスポンダーT細胞として播種され、これらのサブセットの各々を抑制する制御性Tの能力の差が前提に基づいて潜在的な機能的な予後の指標として取り込まれ、使用されているようにその活性化細胞では抑制が困難です。
8。代表的な結果：
方法に大きなばらつきが使用され、in vitroでヒトの抑制アッセイから得られた結果は、私たちはアッセイ1に影響を与える条件の総合的な研究を実行するためのプロンプトが表示。我々は以前の6に決定Teffs（1:10）、：私達はTregsの間に低比を考慮するだけでなく、Tregの機能をテストする検定だけでなく、その純度を開発している。さらに、Tregsのは目に異なる免疫バランスが侵害された場合T1D開発するためにリスクのある被験者のように成功し、ナイーブと、図3に、より顕著になる私たちの以前の研究2,4に示すように、さらに健常者の in vivo活性化T細胞における抑制するEIRの能力。アッセイは、LS（最近発症（RO）T1Dと長年、私たちは健康な制御との間でそれらの機能を比較することが、我々は自然（nTregs）の抑制機能を比較して研究、誘導（iTregs） と in vitro拡張のnTregs で非常にうまくいった）T1D科目。我々はRO T1D被験者はLS T1Dと健常者7に比べて機能的iTregs両方と拡張nTregsを生成するのより良い能力を持っていたと結論づけた。したがって、このアッセイは免疫不均衡の初期および後期の状態の両方の認識に優れたツールとして使用することができます。
in vitroでの抑制アッセイのために必要な手順のスキーム1回路図のプレゼンテーション
図1写真を提示in vitroでの抑制アッセイのステップ
FACS細胞の分離2。ゲーティング戦略図 。 ）CD25 +しきい値は、FITC -陰性細胞は（さらにゲートしたとCD + CD25 -、CD + CD25lowとCD + CD25highとして収集された）細胞は、C FITC陰性としてゲーティングした）蛍光色素マイナスワン（FMO）、Bに応じて調整された割合、dで示すように、Tregsのは））、電子、ソート後にTregsのをソートFACS）ソート後にソートされたCD + CD25lowをFACS、およびf）ソート後にソートされたCD4 + CD25 - T細胞をFACS
図3。健常者の代表の結果）関連するすべての細胞サブセットのための単一文化として提示健常者（ナイーブ- CD25 -、in vivoで活性化- CD25low で 、抗原提示細胞- APCの毎分のカウントの代表的な結果（CPM）がと各CD25 -と自己制御性TによってCD25lowレスポンダーT細胞は健常者のために提示されている（nの抑制の制御性T細胞- Tregの）だけでなく、レスポンダーT細胞の共培養（CD25 -またはCD25low）とTregsの。B）の割合= 4）。抑制は、共培養の単文化とc = CPMで[（SC）/秒]として× 100％、S = CPMを計算した。レスポンダーT細胞を抑制する制御性Tの容量のわずかな違いが気づいていたが、それは。C（t検定P = 0.08ペア））発表は、応答側としてCD25 -とCD25lowを含め、それぞれ単一の文化のためのリスクの被験者でのcpmである有意ではなかったT細胞だけでなく、それぞれのレスポンダーT細胞サブセットは、自家で各CD25 -とCD25lowレスポンダーT細胞の抑制の制御性T（CD25-/TregsとCD25low/Tregs）。d）の割合で播種されたAPCとTregsの、そして共培養Tregsのは、リスクの被験者（N = 4）でのために提示されます。 CD25 -対CD25lowレスポンダーT細胞を抑制する制御性Tの能力の差は有意であった（t検定P = 0.04をペアになった）。
表1。回路図は 、in vitro 抑制アッセイのセットアップ
| 1月3日 | 4月6日 | 7月9日 | 10月12日 | |
| A | CD4CD25 - | CD4CD25low | メディアのみ | メディアのみ |
| B | CD4CD25 - / Tregsの | CD4CD25low / Tregsの | のみTregsの | APCのみ |
| C | ||||
| D | ||||
| E | ||||
| F | ||||
| G | ||||
| H |
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Discussion
Tregsのへの唯一のユニークな特徴として、抑制機能は、同じ内および異なる研究間の疾患の開発のさまざまな段階での被験者の間で確実にかつ均一にテストする必要があります。我々は、このアッセイの標準化への貢献として、当研究室で開発抑制アッセイの詳細を提供します。私たちの広範な最適化の研究では、我々は自然の刺激を提供するAPCとしてPBMCとの併用で抗ヒトCD3でコーティングされたビーズ（UCHT1クローン、1μg/mlの濃度で（のような市販の5μg/mlとは対照的に）とT細胞の刺激と判断したのみAncell抗体が期待される結果を与えた我々の手のように1抗ヒトCD3抗体の選択は、非常に重要である。同時抗ヒトCD3で刺激と抗がテストの被験者にもレスポンダーT細胞とTregsの両方を活性化することができるPBMCは、シグナル伝達と効率的な刺激のチャンスを増やすこと、共刺激シグナルの完全なパレットを提供しながら、ヒトCD28は、対象グループ（結果は示していない）との違いを検出するのに十分ではなかった。
このプロトコルはleukopacksと患者血液の両方で使用できます。唯一の違いは、PBMCの分離の手順でをFicoll - Paque PLUSの上にロードする必要がある血液の量です。このアッセイで使用されているメディアは、我々はアッセイには絶好のに加えであると判断さ10パーセントプールしたヒトAB血清を、含まれています。しかし、使用される前に、血清は能力sixplicateに独自の（種子のPBMCでPBMCをアクティブにし、血清と新しい血清なしで、古い血清で完全RPMIメディアを追加するためにテストする必要があります。72時間後、パルスプレート、37℃、収穫の細胞で16追加の時間をインキュベートして）cpmの測定値を得る。新しい血清で培養したPBMCの増加CPMは良い結果ではなく、新しいロット番号の血清の必要性を示唆している。
我々は、各サンプルのための新しいLSカラムに手動で行うMACSソーティングはAutomaxに比べてCD4のかなり良い利回り+ T細胞を与えることを決定した。 （回答者：加えて、Tregの純度は、CD25の発現（図2d）、in vitroでの増殖（図3a）、Tregの間の比1:10の健常者で高い抑制性の欠如によって判断、> 95％であると決定された図3AB）と分離されたT細胞サブセット（データは示さず）の中で最も高いFoxp3の発現。夾雑細胞は、次のステップ（図2b）で手続きをソートFACS中FITCダンプとして排除されます。 CD4マーカーの染色FACSが必要ではないと抗ヒトCD25と組み合わせた場合、この細胞集団がプロットにFSCを通して見ることができる、しかしそれを行うことができる。 Tregsのは、すべての被験者群におけるCD25の最高数を発現する細胞の上位1％としてソートされます。独立して疾患の状態のすべての被験者にこの厳格な手順を適用することで、テストしたすべての被験者グループにTregsのとレスポンダーT細胞（1:10）の間の唯一の1つの比率を使用することができました。さらに、同じ条件で抑制可能性をTREGの差がナイーブとそれらの間の違いに基づいて、応答者、として使用される生体活性化T細胞で 、1期待できるとの間で見られたようにうまく機能。我々はまた、細胞を選別FACS後抑制アッセイで設定される前にスピンダウンする必要があると判断した。
増殖は、トリチウムチミジンを用いて測定した。また、細胞増殖は、新たに合成されたDNAの代わりにチミジンに組み込まれている5 - ブロモ-2' - デオキシウリジン、ピリミジンアナログを、使用して測定することができます。 BrdUの検出は、ユーロピウムの解離、シグナル検出の手順で蛍光計8で測定することができます解離放出する蛍光を取得するのBrdU（抗BrdU - EU）を認識する抗体に結合したイオンに基づいています。メーカー（DELFIA）によると、このアッセイは、[3 H]チミジンに匹敵する感度です。追跡細胞増殖も使用して行うことができる、例えば、MTTまたは生産細胞の数と信号の関係は、最初に確立する必要があるATCCから入手可能なXTTアッセイのテトラゾリウム塩の誘導体は、細胞の割合の変化の分光光度定量を可能に増殖と生存率。さらにもう一つの方法は、生細胞数と生存率の蛍光定量化に基づいて、DHL細胞の生存と増殖アッセイを使用することです。他の潜在的な選択項目は、CFSE（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）とレスポンダーT細胞を染色し、培養時間の間にすべての次の部門で汚れを減らすことを監視することです。しかし、アッセイで使用されている刺激に応じて、48時間以上の長いインキュベーションはCFSE陽性細胞の区別がつかないピークを引き起こす可能性があります。このように、アッセイの各々は、いくつかの長所と短所を持っており、望ましい結果を達成するために最適化する必要があります。
抗ヒトCD3でコーティングをテストするためのCPMは、常に上で実行されます健康PBMCと、彼らはこのタイプのアッセイで使用するビーズために5000上記ではなく、15000以上である必要があります。私たちが作るビーズの各バッチをテストするときに我々は通常、異なるビーズ/細胞の比を設定し、そしてほとんどの場合、我々は、25,000細胞/ウェルで3ビーズ/細胞で最も一貫したCPMを持っている。バッチテスト中にインプレッション単価が3,000未満であれば我々は5,000-15,000 CPM /ウェルになるまで、我々は通常、コーティングを繰り返す。このように、コーティングプロセスは、複数のレベルでチェックし、我々はそれが信頼できることを検討されています。したがって、被験者の特定のグループ（T1D開発する危険性がある自動抗体陽性の被験者のような）のインプレッション単価が一貫して健常者に比べて低くなっているときに、我々はそのシグナル伝達プロセスを締結する理由が漏洩した可能性があります。 、多くの研究がこれまでに9月12日発表された抑制アッセイでのレスポンダとしてナイーブ細胞を使用しているものの、いくつかは、例えば、APCなどのPBMCの存在下で、応答者としては非常に異なるアッセイ条件13またはPBMCにおけるレスポンダーとしてCD4のいずれかを使用している追加Tregsの14または抑制などの単球15にシングルと共培養でそれらを設定します。 CPMの増殖に関するすべてのアッセイの変動との結論に生成されますが行われるにもかかわらず、我々は、応答者としての純粋な均一な細胞のサブセットを持つことがより具体的な結果を与え、Tregsのとレスポンダの両方についての結論を導き出すために潜在的な保持している。思うここで紹介する私たちの抑制アッセイは、レスポンダ（CD4 + CD25 -およびCD4 + CD25low）のように2つの独立した純粋な細胞のサブセットが含まれているとして、それは健康な被験者からの結果がへのリスク、影響を受けるかの被験者と比較すると免疫恒常性に関する貴重な情報を得ることが可能です。免疫恒常性（T1Dのような）の摂動に起因する疾患を発症する。としての研究の増加によって示される、 生体内で活性化したT細胞は、（CD4 + CD25low）Tregsの16から19の抑制効果に障害感受性を示す。その行動のための正確な説明は、より多くの調査が必要です。これに加えて、我々と他の人はT1Dの被験者におけるTregsのは、我々が示したように、T1D開発する危険にさらされて、自動抗体陽性の被験者についても同様です機能的欠陥2,9,10を 、持って行うことが示されている私たちの最近の報告書1の図6。可能性の一つは、シグナル伝達における一般的な欠陥がそれらを十分に刺激に応答するための予防とそのエフェクター機能に影響を持っているT1D開発するために被験者のすべてのCD4 T細胞が影響を受けることと危険にさらされています。侵害のシグナル伝達の結果として、レスポンダーT細胞は低いCPMを生成します（図3cに示されている）とTregsのは、効率的に抑制することはない。このまたは他の可能性はさらに検討されずに残っている。健康と病気に大きな役割Tregsのプレイのおかげで、多くの研究室が自分のニーズと能力にアッセイを調整するTregの機能を測定した。このように、アッセイの多くの要因は、（応答者/ Tregの分離、タイプおよびAPC、レスポンダ/ Tregsの、文化の時間だけでなく、モニタリングの増殖の方法との間の比率の刺激、種類と数のレスポンダ、性質と強さの数異なる可能性があります）、Tregの機能に影響を与える。この作品は、それゆえ、Tregの機能を評価するさまざまな研究が容易と直接比較が可能アッセイの標準化のプロセスを開始することを目的としています。
採用された場合、このプロトコルはT1Dと他の自己免疫疾患に罹患した被験者の異なる研究室間のTregの機能の比較のためにできるようになります。このプロトコルは、広範なアプリケーションを持っており、その予後値が免疫恒常性の摂動の結果であるだけ病気を関係するものの、病気の関係なく、任意の件名のTregの機能の評価に使用することはできません。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この研究は、ウィスコンシン州とウィスコンシン州の子どもの研究所の少年Diabetesat医科大学のマックスマギー国立研究センターによってサポートされていました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析の役割、または原稿の準備がなかった。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | Amersham | 17-1440-03 | |
| DPBS-1X | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| anti-CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| Pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| Anti-human CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) | BD Biosciences | 557852 | |
| Anti-human CD25-PE (clone M-A251; IL-2Rα) | BD Biosciences | 555432 | |
| Anti-human CD8-FITC (clone RPA-T8) | BD Biosciences | 555366 | |
| Anti-human CD14-FITC (clone M5E2; LPS receptor) | BD Biosciences | 555397 | |
| Anti-human CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR-type II) | BD Biosciences | 555448 | |
| Anti-human CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα chain) | BD Biosciences | 554532 | |
| Dynalbeads M-450 tosylactivated | Invitrogen | 140-13 | |
| Anti-human CD3 | Ancell | 144-024 | |
| Buffer1 | Home made | 0.1M Na2B4O7 pH7.6 | |
| Buffer2 | Home made | PBS/2mM EDTA/ 0.1% BSA pH7.4 | |
| Buffer3 | Home made | 0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5 | |
| Complete RPMI media | Home made | RPMI 1640 media 2 mM L-glutamine 5 mM HEPES 100 U/μg/ml peni/strept 0.5 mM sodium pyruvate | |
| [3H] thymidine | PerkinElmer, Inc. | NET027Z005MC | |
| human pooled AB serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
| Multiscreen harvest plate | EMD Millipore | MAHFC1H60 | |
| Microscint 20 | PerkinElmer, Inc. | 6013621 |
References
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