Summary
Abstract
免疫组织化学(IHC)是一个有价值的技术,利用本地化/可视化在安装组织部分使用特异性抗体蛋白表达。有两种方法:直接和间接的方法。在这个实验中,我们只描述使用间接免疫组化染色。间接免疫组化染色采用高度特异性的小学和中学生物素标记的抗体。主要是利用抗体绑定到特定的抗原表位,谨慎识别感兴趣的蛋白质,而二级抗体减去非特异性背景染色和放大,形成抗体复合物的主信号。幻灯片可以生成从冰冻切片,或石蜡包埋切片装在载玻片上。在这个协议中,我们讨论准备石蜡包埋切片,脱蜡,酒精梯度水化,热诱导的抗原修复,并阻断内源性过氧化物酶的活性和非特异性结合位点。部分路段,然后与CD8 + T细胞标记的特定抗体染色,有的则是酪氨酸羟化酶染色。随后与适当的结合,以生物素的抗体治疗的幻灯片,然后开发利用与Diaminiobenzidine(“民建联”)为底物的抗生物素蛋白结合的辣根过氧化物酶(HRP)。发展,幻灯片counterstained的对比,并根据与permount盖玻片上。充分干燥后,这些幻灯片,然后成像。
Protocol
石蜡切片的染色
- 脱蜡二甲苯(费舍尔X3的小号 -4),每次5分钟3倍幻灯片每个月使用情况(变化二甲苯,二甲苯是有毒的) 。费舍尔文献08 - 812 - 1A和机架的20张幻灯片中使用的菜肴和涵盖,以适应这些菜。菜每200毫升液体。
- 水合物通过酒精梯度如下(变化梯度,每2周):
- 100%的乙醇(费舍尔#A406 - 20)的2倍,每次2分钟
- 在95%的乙醇2倍,每次2分钟
- 1X在70%乙醇为2分钟
- 1X在50%乙醇2分钟
- 1X在30%乙醇2分钟
- 1X DDH 2 O为2分钟
- 在DPBS浸泡5分钟(DPBS =贝科的修改后的磷酸盐缓冲生理盐水与Ca 2 +和Mg 2 + )。
抗原恢复:
- 预热柠檬酸钠缓冲液(10毫米,pH值6.5)中的微波。
- 库克在微波15分钟的幻灯片。幻灯片应永不干涸,所以检查每分钟,并添加柠檬酸钠必要时。
- 在室温放凉。
- 座内源性过氧化物酶的活性,用1%H 2 O 2(1.5毫升30%的股票在20分钟DPBS适马50毫升DPBS的H - 1009) 。
- 浸泡在DPBS 3 × 5分钟。
- 座在4 ° C的DPBS + 5%的牛血清白蛋白(BSA)的0.1%钠叠氮化物+ 5%血清过夜孵育的非特定网站。
注:血清抗体染色品种的选择将取决于。块的二次抗体(共轭生物素)是物种的血清。如果这是不可用,使用从一个物种的不同,是其中主要AB的血清。
- 座生物素与亲和素/生物素阻断试剂盒(矢量实验室目录#SP - 2001)网站:
- 与亲和素ð孵育15分钟。 DPBS冲洗简要。
- 孵育15分钟的生物素的解决方案。
- 在小学AB孵育2小时,在室温下,在DPBS + 2%BSA + NaAzide 0.1%+ 2%血清(作为阻塞步骤相同)。
- 浸泡在PBS 3 × 5分钟。
- 孵育二级AB为1小时,用生物素共轭室温在DPBS + 2%BSA + 0.1%叠氮钠+ 2%血清(阻塞步骤一样使用)。
- 同时准备在ABC试剂,因为它已经开发使用前至少30分钟! (见材料)
- 准备在50毫升的锥形管。在15毫升DPBS(无血清,无叠氮),添加试剂3滴,混合,并添加3滴试剂B和组合。避免挤压的瓶子,而等待的下降,形成自己的。 ABC试剂盒Vectastain PK - 6100从Vector实验室。
- 浸泡在DPBS 3 × 5分钟。
- 与ABC试剂孵育在室温为30-45分钟。
- 浸泡在DPBS 3 × 5分钟。
- 民建联过氧化物酶底物(矢量实验室#SK - 4100)准备于5 ml DDH 2 O 使用前在一个玻璃小瓶(见材料)
- 缓冲库存溶液2滴,混合
- 民建联4滴,混合(应成为淡棕色)
- 2滴H 2 O 2的混合
- 拖放幻灯片上的民建联基板和观察为棕黄色染色。
- 成冰浸幻灯片+自来水停止反应。
- 冷的自来水下冲洗5分钟。
- 苏木素复染液(20秒,费舍尔CS401 - D)和自来水冲洗,直到水出来。
- 通过酒精梯度高达100%的乙醇(2分钟)在30%乙醇脱水。
- 浸泡在二甲苯3 × 5分钟。
- 山与Permount(费舍尔#SP15 - 100):把上述一些幻灯片上的部分慢慢地按到盖玻片部分无气泡。不要移动,直到完全干燥的盖玻片,约需24小时。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Change xylene every month depending on use. Xylene is TOXIC. |
100% ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Use to make EtOH gradient. |
DPBS | Dulbecco’s modified Phosphate Buffered Saline WITH Ca2+ and Mg2+ | ||
Na-Citrate buffer | 10 mM, pH 6.5 | ||
H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 | 30% stock => Dilute to 1% in DPBS |
Blocking solution | DPBS + 5% bovine serum albumin (BSA) + 0.1% Na Azide + 5% serum. | ||
BSA | |||
Sodium Azide | NaAzide | ||
avidin/biotin blocking kit | Vector Laboratories | SP-2001 | |
Ab buffer | DPBS + 2% BSA + 0.1% Na Azide + 2% serum (same as used for the blocking step) | ||
ABC kit Vectastain PK-6100 | Vector Laboratories | ||
DAB peroxidase substrate | Vector Laboratories | SK-4100 | |
ddH2O | |||
Hematoxylin | Fisher Scientific | CS401-D | counterstain |
Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
Slides and cover-slips | glass |