Summary
Um
Abstract
Para analisar a morfologia axonal e dendríticas dos neurônios, é essencial para obter a rotulagem exacta de estruturas neuronais. Preparação de amostras bem rotulados com pouco ou nenhum dano tecidual nos permite analisar a morfologia das células e comparar amostras individuais entre si, permitindo assim a identificação de anomalias mutantes.
No método de dissecação demonstrou o sistema nervoso permanece na maior parte dentro da mosca adulta. Através de uma incisão dorsal, abdome e tórax são abertas ea maioria dos órgãos internos são removidos. Apenas o lado dorsal da medula nervosa ventral (VNC) e do conjuntivo cervical (CVC), que contém os axônios das fibras grandes gigantes (FG) 1 estão expostos, enquanto o cérebro com o corpo celular e dendritos GF 2 permanece na cabeça intacta . Nesta preparação mais nervos do VNC deve permanecer solidários com os seus músculos.
Após a dissecção, o preenchimento intracelular da fibra gigante (GF) com um corante fluorescente é demonstrada. Na CVC os axônios GF estão localizados na superfície dorsal e, portanto, podem ser facilmente visualizadas em um microscópio com contraste de interferência diferencial (DIC) óptica. Isto permite a injeção de axônios GF com corante neste site para rotular o GF inteiro, incluindo os axônios e os terminais na VNC. Este método resulta em coloração confiável e forte da FG permitindo que os neurônios a ser trabalhada imediatamente após o enchimento com um microscópio de epifluorescência. Alternativamente, o sinal fluorescente pode ser melhorada através de procedimentos imuno-histoquímica padrão de 3 adequado para microscopia confocal de alta resolução.
Protocol
1. Dissecção do cordão nervoso ventral
Dissecção e corante preenchimento da GF pode ser realizada à temperatura ambiente. Para todas as etapas de dissecção fria (4 ° C) solução salina deve ser usado para desacelerar o metabolismo celular e manter os neurônios vivos por mais tempo.
- Anestesiar moscas adultas (4 dias ou mais) com CO 2 ou chill-los no gelo até que eles são imobilizados. Anestesiando com gelo vai exigir mais tempo (até 30 min), mas irá manter as moscas imobilizada por mais tempo.
- Coloque uma mosca em uma placa de Petri Sylgard revestido. Esta dissecção requer o uso de uma ampliação alta (80-100X) estereomicroscópio dissecção.
- Com uma tesoura Vannas, remova as pernas, tromba, e asas.
- Use uma pinça grossa e fina pinos de insetos (pinos minutien) para orientar o lado dorsal voar até no prato Sylgard. Pin do abdômen e depois alongar um pouco o animal, colocando dois pinos em cada lado do pescoço, atrás da cabeça, de modo que o pescoço é ligeiramente alongado e acessível (ver figura 2).
- Submergir a voar na nova solução salina Drosophila, frio. Salinas mais comumente usado Drosophila são suficientes para a dissecação, no entanto aqui usamos uma solução salina descrito no Gu e O'Dowd, 2006 4. Uma bolha de ar, cercarão a voar. Retire o ar com uma seringa.
- Faça uma incisão, curto laterais na extremidade dorsal do abdômen. A partir de incisão, faça uma rasa, corte reto no dorso do abdômen para o tórax. Em seguida, continuar o corte raso longitudinal no tórax tão precisamente quanto possível ao longo da linha mediana em direção ao conjuntivo. É fundamental para fazer os cortes rasos para não danificar o VNC (Figura 1).
- Use dois pinos de insetos fina com cuidado abrir o tórax. Espalhe metades do corpo para além usando os pinos e colocar os pinos através dos músculos de vôo (Figura 2). O tórax não deve ser aberta ainda, conforme ilustrado na Figura 2 para evitar rasgar da cutícula. Para garantir uma orientação reta da VNC os pinos devem ser colocados na posição anterior mesmo posterior de cada lado.
- Acesso ao VNC para injeção de corantes e imagem adequada pode ser obstruída por órgãos internos. Portanto, utilize uma pinça e tesouras para remover o estômago, intestino, coração e órgãos reprodutivos. Retirar as glândulas salivares deitado em ambos os lados do VNC. Lavar a dissecção cuidadosa com solução salina fresca para remover o tecido flutuante e gordura.
- Remover a gordura corporal debaixo do conjuntivo cervical (CVC). A gordura corporal é mais visível em uma ampliação alta. Use uma pinça fina para compreender cuidadosamente o tecido do lado e puxe-o para fora.
A dissecção pode ser realizada dentro de 5 a 10 minutos. Usando solução salina fria e fresca a dissecados, sistema nervoso intacto permanecerá vivo por pelo menos uma hora.
2. Intracelular GF preencher
É recomendado para executar o corante enchimento o mais rapidamente possível após a dissecação.
- Coloque o prato Sylgard com a mosca dissecadas sob um microscópio vertical com um palco fixo (Figura 3) e um objetivo de ar 10x. Centro da amostra com a extremidade posterior da mosca posicionado em direção ao suporte do eletrodo corante preencher. Use o diferencial de interferência de contraste de modo (DIC) e concentrar-se na CVC. Os axônios grande do FG devem ser claramente visíveis na superfície dorsal da CVC.
- Diluir Lucifer Yellow CH sal dilithium em H2O deionizada a uma concentração de 1%. Puxar um eletrodo de vidro borosilicato com filamento a uma resistência de aprox. 60-80 mohms. A ponta do eletrodo de vidro deve ser longo e afiado. Encha a ponta do eletrodo com 1% de solução Lucifer Yellow colocando o eletrodo com a extremidade oposta a ponta do eletrodo na solução Lucifer Yellow por aprox. 30-60 segundos. Em seguida, o eletrodo de aterramento com LiCl 3M, utilizando uma seringa Hamilton deixando uma bolha de ar entre o corante e LiCl. Conecte o eletrodo corante de preenchimento para o palco cabeça.
- Inserir um cloreto de prata revestido eletrodo terra fio no soro fisiológico e colocar o eletrodo corante encher acima do paralelo voar para o VNC usando um micromanipulador 3D hidráulico. O eletrodo de corante de preenchimento deve ser conectado a um amplificador que permite a passagem de corrente a fim de liberar negativa ou positivamente carregada corantes do eletrodo, passando hiper ou despolarizantes atual, respectivamente.
- Mudar para uma lente 40x de imersão em água e menor a ponta do eletrodo corante preencher em uma das GFs. Os axônios GF ficava perto da superfície dorsal da CVC. Use um movimento (em direção à cabeça) para a frente para inserir o eléctrodo na GF.
- Alterar a sua fonte de luz para iluminar epifluorescência e mudar para um filtro de Lucifer Yellow. Aplicar uma corrente hiperpolarizante ao eletrodo corante preencher com o amplificador para injetar o Yellow Lucifer no GF. A quantidade de corante injetado pode ser controlada por diaquantidade de corrente e passados, bem como a duração da corrente é passado. Para evitar que a tinta se espalhe para fora do local da injeção ou danificar o GF, recomenda-se injetar com uma corrente baixa (cerca de 3-5 nA) mais 1-5 minutos.
- Aplicar atual até o terminal GF na VNC pode ser visto claramente (Figura 4A). Para trans-sináptica dos neurônios pós-sinápticos coloração, continuar a passar corrente em até dye também pode ser visto nos neurônios pós-sinápticos. Desligue a corrente e retire o eletrodo corante preencher.
3. Resultados representativos:
Um corante representante de preenchimento para uma GF com Lucifer Yellow é mostrado na Figura 4A. A imagem foi adquirida como uma pilha de imagens no software Nikon Elements usando uma câmera montada no local no microscópio. Neste atual amostra foi passada através do eletrodo por cerca de 2 minutos. O GF é completamente preenchido eo terminal GF grande no tórax é bem marcada (Figura 4A, elipse). Não neurônios pós-sinápticos são visíveis neste caso, embora Lucifer Yellow é suficientemente pequeno para passar através junções. Se o corante não é injetado o tempo suficiente para a GF, em seguida trans-sináptica enche de neurônios pós-sinápticos podem não foi visto porque o sinal é muito fraco para ser detectado. Neurônios pós-sinápticos para o FG (Figura 4B, cabeças de seta) podem ser visualizados de forma mais confiável usando ainda menor traçadores neuronais, como Neurobiotin. Injeção de um Neurobiotin 7% em dois solução de acetato de potássio M com uma corrente despolarizante por 2 minutos é suficiente para rotular neurônios pós-sinápticos fortemente. Neurobiotin podem ser visualizados por microscopia confocal usando Estreptavidina acoplados a corantes de diferentes comprimentos de onda. Neurobiotin porque não é um corante fluorescente, co-injeção de Dextran ou Rhodamin-hidrazonas Alexa na mesma solução, pode ser usado para monitorar uma injeção de sucesso para o GF (Figura 4C, de Boerner e Godenschwege, 2010 5).
Figura 1. Desenho esquemático de uma mosca visto lateralmente. O tórax é exibido com uma incisão longitudinal de visualizar as estruturas internas. Durante a dissecção, a dorsal músculos de vôo longitudinal (DLMS, azul) foram cortadas, sem danificar o cordão nervoso ventral (VNC, vermelho escuro), que fica ventral aos músculos de vôo. O intestino (verde) está acima do VNC.
Figura 2. Vista dorsal de uma mosca dissecados. Dois pinos são colocados atrás da cabeça para posicionar a voar. Os pinos afixada através dos músculos de vôo (DLM) mantenha o tórax aberto. Órgãos internos foram removidos para expor o cordão nervoso ventral (VNC).
Figura 3. Dye configuração de preenchimento.
Figura 4. A) Z-projeção da parte posterior da VNC mostrando uma GF preenchido com Lucifer Yellow. A imagem foi adquirida imediatamente após o preenchimento da tintura com uma câmera no local. No tipo selvagem animais, o terminal (elipse) no tórax é claramente visível. B) imagem confocal de um corante GF preencher com Neurobiotin em uma mosca do tipo selvagem. Ambos os GFs (setas) e neurônios pós-sinápticos para o FG (seta cabeças) são rotulados. Neurobiotin foi visualizado com Estreptavidina acoplado a Cy3. C) imagem confocal de tipo selvagem FG preenchido com Alexa555.
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Discussion
O sistema nervoso pode ser dissecada sem extraí-lo do corpo da mosca. Isso tem duas vantagens, primeiro, a dissecção causa pouco dano ao sistema nervoso e, segundo, a maioria dos nervos ficar ligado para os músculos e órgãos sensoriais. Realizar a dissecção, como descrito, prepara a amostra para a frente de corante rotulagem do FG. Convenientemente, os motoneurônios pós-sináptico para o FG ficar ligado para os músculos. Axônios, portanto, não estão danificados, mantendo os neurônios vivos por mais tempo. Além disso, danos ao sistema nervoso é susceptível de perturbar a função de junção gap e, portanto, é susceptível de afectar a eficácia da trans-sináptica enche.
Lucifer Yellow, Rodamina dextran, e Alexa Fluor sal de sódio hidrazida (Invitrogen) pode ser usado para visualização instantânea da morfologia GF sob um microscópio fluorescente, no entanto sinal de amplificação usando secundário anticorpos fluorescentes são recomendados para imagens de alta resolução com um microscópio confocal 5. Ambos, Lucifer Yellow, assim como rótulo Neurobiotin as células pós-sináptica através de trans-sináptica enche, com Neurobiotin sendo muito mais confiável. No entanto, Neurobiotin é não-fluorescentes e requer injeção de imuno-histoquímica seguintes, bem como a co-injeção de um corante fluorescente segundo, a fim de monitorar uma injeção de sucesso.
Esta técnica tem sido rotineiramente usado para comparar a morfologia dos terminais GF entre indivíduos do mesmo genótipo ou entre indivíduos de diferentes genótipos 5,6,7,8. Além disso, a morfologia do terminal sináptico também pode ser correlacionada com a sua função através da obtenção de gravações eletrofisiológicas do circuito antes da dissecção por procedimentos-padrão 9,10.
Finalmente, embora o nosso método de dissecação demonstrou apenas expôs o VNC para a tintura de injeção e de imagem do terminal GF, uma dissecção posterior do cérebro a partir da cápsula cefálica após a injeção de corante permitiria imagem da soma GF e dendrites no cérebro, bem .
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
O projeto descrito foi apoiada pelo Grant Número R01HD050725 do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano para TAG O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano ou a National Institutes of Health. Agradecemos a membros do laboratório Godenschwege bem como Schreader Barbara para a sua entrada para o manuscrito e vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| Dissection Microscope | AmScope | SM-2TZ | |
| Vannas Scissors Superfine | Academic Instruments | VS1023 | |
| Dumont Forceps Dumontstar 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm |
| Borosilicate Glass Electrodes | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| Vertical Pipette Puller 700c | David Kopf Instruments | Model 700C | |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | 1% in H2O |
| Fixed Stage Upright Microscope & Camera | Nikon Instruments | FN-1 & DS-U2 Camera | |
| Plan Fluor 10X Air Objective | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 10X NA 0.3 WD 16mm | |
| Fluor 40X water dipping Objective | Nikon Instruments | CFI Fluor 40X W NA 0.80 WD 2.0mm | |
| 3D hydraulic Micromanipulator | Narishige International | Model MW0-3 | |
| Amplifier | Getting Instruments, Inc. | Model 5A |
References
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