Summary
В настоящем докладе содержится подробное описание методологии и результатов одновременных эндокарда и эпикарда оптических отображение электрического возбуждения в интактном левое предсердие из Langendorff-перфузии овец сердца во время стретч-индуцированной фибрилляции предсердий.
Protocol
1. Удаление сердца и Langendorff перфузии
Овцы весом 35-40 кг анестезируют использованием 4-6 мг / кг пропофола и 60-100 мг / кг натрия фенобарбитала. Сердца удаляются через торакотомии и подключен к Langendorff-перфузионной системе с циркулирующим кислородом (95% O2, 5% CO2) решение Тирода с постоянной скоростью потока 240-270 мл / мин, рН 7,4 и 35.5-37.5 ° C. Состав Тирода (в мМ): NaCl 130, 4,0 KCl, MgCl2 1, CaCl2 1.8, NaHCO3 24, NaH2PO4 1,2, глюкоза 5,6, и альбумин 0,04 г / л Blebbistatin 10 мкМ (Энцо Life Science International, Inc Плимут Митинг, штат Пенсильвания, США) используется для уменьшения сократительной силы.
2. Стретч-индуцированной фибрилляции предсердий в Langendorff-перфузии овец сердце
Изолированные, коронарная перфузия сердца проходит предсердий транс-перегородки прокол чтобы уравниваются внутриполостного давления в обоих предсердий. Все вены отверстия затем опечатаны, кроме нижней полой вены, что является канюлированные и подключен к цифровой датчик (Biopac системы датчик-TSD104A; Biopac Systems, Inc, Goleta, Калифорния, США), а также отток канюля которого открытого состава высота над предсердиями управления внутри-предсердного давления. Затем давление увеличено до 12 см H 2 O, что приводит к ~ 30%-ное увеличение предсердий относительного объема к объему в 6 см H 2 O. Давление сохраняется стабильным на протяжении всего эксперимента. До уплотнение вен тетраполярная катетеры электрода (Torq, Medtronic Инк / Миннеаполис / MN / США) размещаются в каждой из легочных вен для записи биполярных сигналов от двух дистальных электродов (частота дискретизации, 1,0 кГц) с использованием усилителя Biopac системы (DA100C; Biopac Systems, Inc, Goleta, Калифорния, США). Два дополнительных custum производства биполярных электродов расположены на крыше левого предсердия придатка (LAA) и верхней части правого предсердия придаток.
3. Оптическое отображение создана
- Эпикардиальных отображение в левом предсердии придаток. Болюсной инъекции от 5 до 10 мл ди-4-ANEPPS (10 мг / мл) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури, США) и загрузки течение 10 минут необходимо для получен напряжение чувствительных к флуоресценции при возбуждении лазерным (532 нм) эпикардиальных поверхности. Излучаемого флуоресценции затем передается через 600 нм фильтра и спроецированы LittleJoe CCD видеокамеры (80x80 пикселей, SciMeasure Аналитический Systems, Inc Декатур, штат Джорджия, США) и приобретенных на скорости 800 кадров в секунду (см. схематическое изображение на рисунке 1а). Пять второй фильмы получаются при 2 минутные интервалы во время автофокусировки. Области отображается эпикардиальных поверхность ~ 14 см 2.
- Эндокарда оптическим отображением НОАК интактного сердца. Второй LittleJoe CCD камера (80x80 пикселей) синхронизируется с эпикарда камеры. Диаметром 10 мм двухканальной жесткой бороскоп (Everest VIT, Inc Фландрии, штат Нью-Джерси, США) с 90-градусный угол обзора вводится через переднюю стенку левого желудочка, через митральный клапан и сосредоточился на поверхности эндокарда Народно-освободительной армии. Оптически отображается область НОАК ~ 4 см 2, что позволяет визуализировать четыре легочные вены и предсердий септо-легочной расслоения (рис. 1А, Б). Бороскоп с-смонтирован на ПЗС-камеры через заказные окуляр адаптер. Лазерный свет 532 нм, затем доставлены в возбуждении канал бороскоп через жидкость светло-гид (0,2 в ядро).
4. Предсердной фибрилляции протокола
При непрерывном предсердий растянуть AF индуцирована с помощью взрыва стимуляции (12 Гц, 5 мс импульсов, 2x диастолический порог) путем стимуляции электрод расположен в верхней части LAA. АФ будет продолжаться в течение 50 минут и 5-ти секунд оптические фильмы приобретаются на двух отрезках мин. Биполярное записи собираются непрерывно. Приобретение оптических фильмов вызывает одновременное приобретение 5-сек сегментов записи биполярным.
5. Частотный анализ
Частотный анализ позволяет идентифицировать регионы с высокой скоростью при активации AF, наряду с частотой градиенты между левым и правым предсердием. Доминирующие частоты (DF) карты получаются друг из оптических фильм после применения алгоритма быстрого преобразования Фурье (БПФ) для временных рядов сигнала флуоресценции регистрироваться при каждом пикселе. 7 БПФ применяется также к 5 секунд сигналы биполярные (ВЧ-фильтром с частотой 3 Гц и низкочастотный фильтруется при 35 Гц) синхронизированы с оптическим фильмов.
6. Предсердной фибрилляции динамики
- Генерация фазы карт. Анализ динамики AF использует фазы фильмов, создаваемой при помощи преобразования Гильберта 14. Короче говоря, мгновенная фаза потенциала действия отражаются по каждому пикселю определяется путем преобразования оригинального временного ряда сигналов, таких, что каждая спектральная компонента смещается на соответствующий цикл квартале 15. послевоенныеDS, мгновенная фаза сигнала получается из арктангенс отношения преобразованный сигнал к оригинальному сигналу. Фазового угла в диапазоне от-π и π радиан представлена как непрерывный цветовой схемы для построения карты фазы, в которой непрерывное пространственное изменение фазы отражает процесс возбуждения, реполяризации и восстановление 14.
- Характеристика активации узоры. Различные классы активации шаблоны могут быть определены с помощью фазы фильмов (рис. 2), в том числе следующие:
- Ротора определяется наличие всех этапах сходящихся в точке сингулярности продолжительностью более одного оборота (рис. 2А).
- Прорыв определяется как волновой фронт появляться в поле зрения и распространяющихся наружу (рис. 2Б) в целевой узор.
- Spatiotemporally организованы периодические волны определяются как минимум четыре последовательных периодических волн, выходящих из того же пункта в поле зрения, с аналогичными направлении, и среди волн интервал (рис. 2С).
Дальнейшее количественное позволяет пространственной корреляции высоких частот областей с наиболее распространенными картина активации полученных из данного региона. Последний подчеркивает ключевую роль картирования поверхности эндокарда НОАК, так как он обычно представляет регион, где высокая частота областей расположены во время острой AF.
7. Представитель Результаты:
Доминирующие частоты (DF) градиенты от НОАК в САР LAA и присутствуют во время острой стретч-индуцированной ФП. Высокий DF области локализован либо в или около одного из легочных вен или где-то в НОАК. 11 эпизод представитель AF показано на рисунке 3, в котором высокая DF локализуется на PLA (правой нижней легочной вены). Результаты подтверждают наличие высокой частоты источников в НОАК вождения AF соответствуют слева направо градиенты DF наблюдается в абляционного процедур при пароксизмальной человека Ф. 16.
Количественная оценка структуры активации с применением фильмы фазы карта показывает, что наибольшее число роторов находится на НОАК и соединения между НОАК и LAA. 8 Время от времени можно выделить длительный роторов, центр вращения (Singularity точки) локализует с самой высокой частотной области. С 10 предсердной ткани представляет собой трехмерную структуру, выявляя роторов на отображается эндокарда поверхности НОАК предполагает, что центр вращения роторов те (нити) в конечном счете, перпендикулярной к поверхности отображение области . Рисунок 4 показывает такие ротора записан с эндокарда Народно-освободительной армии с одновременным фибриллирующий проводимости к LAA, которая также коррелирует с частотой градиент между НОАК и LAA (9 и 6,4 Гц соответственно). Число роторов всегда выше на НОАК, чем LAA, что свидетельствует о существенной роли спускаемого на НОАК для поддержания аритмии в этой модели.
В целом, результаты подтверждают теорию, что стабильный и быстрый роторов в левом предсердии могут приводить острый стретч-индуцированной ФП и исходящие волны испытывают сложные, пространственно распределенных моделей проводниковая анестезия, как они голову в сторону правого предсердия, проявляющиеся как фибриллирующий проводимости и постепенного снижения доминирующей частоты.
Рисунок 1. Схематическое изображение экспериментальной установки. : Жесткие бороскоп вводится через переднюю стенку левого желудочка и митрального отверстия клапана и сосредоточился на эндокарда поверхность заднего левого предсердия (НОАК). ПЗС-камера соединяется с бороскоп и лазерной подсветки осуществляется через руководство лазерной жидкости подключен к нижней части бороскоп. Эпикардиальных отображение производится по LAA. Биполярные электроды расположены на правом предсердии и крыша левого предсердия. Дополнительные сигналы биполярной получаются из легочных вен. B: Боковой вид налево, следуя атриум открытия боковой стенке для иллюстрации. Кончик бороскоп освещает поверхность эндокарда НОАК. Электрод биполярный расположен на крыше левого предсердия. LAA: в левом предсердии придаток. Л. В.: левый желудочек. RA: правое предсердие. Р. В.: правый желудочек.
Рисунок 2. Различные виды активации определены после поколение фазы фильмов. : Последовательная выстрелов оснастки левого предсердия придатка (LAA) показывают, поворотными ротора вокруг центра вращения (Singularity точки). Слева направо, один полный оборот будет завершена. B: активация образцов прорыв узор на LAA. Волна появляется на дов правом углу поля зрения и распространяется вовне. C: Четыре spatiotemporally организованы периодические волны (при 0, 182, 352 и 512 мс соответственно), идущие от региона НОАК к LAA. Изохроны построены в 10 интервалах мс. Снизу, ключ для различных фаз потенциала действия цветом.
Рисунок 3. Определение регионов с самой высокой частотой активность во время острого стретч-индуцированной ФП у Langendorff-перфузии изолированного сердца овец. : Анатомические зрения левого предсердия придатка (LAA), правого предсердия придатка (САР) и заднего левого предсердия (НОАК). НОАК изображение эндоскопического зрения отображается область с четырьмя легочных вен (PV). B: DF карты, полученные оптическим отображением на LAA и НОАК. Частота значение в САР была получена из электрограмм биполярным. Наибольшая частота область расположена в НОАК. C: Представительная власть спектров, в которых максимально соответствует DF до 12,4 Гц на область НОАК права клипов. LSPV: левой верхней легочной вены. LIPV: левой нижней легочной вены. RSPV: правой верхней легочной вены. RIPV: правой нижней легочной вены. Воспроизводится из работы 11 (Дэвид Filgueiras Рама и Хосе Jalife. Механизмов, лежащих фибрилляции предсердий. Фундаментальная наука в клинической электрофизиолога, Vol. 3 (ред. Чарльз Antzelevitch) 141-156 (Saunders, 2011).
Рисунок 4. Simultaneousphase карт (A, B) и доминирующей частоты карты (C) от задних левого предсердия (НОАК) и левого предсердия придатка (LAA). : Последовательная выстрелов оснастки из PLA показывает ротор и дрейфующих его особая точка. B: Одновременное фазы оснастку выстрелов из LAA. Модели показывают, активации распространения волн совместимы с фибриллирующий проводимости. Singularity точках, также присутствуют в корреляции с wavebreaks в фибриллирующий регионе проводимости. (См. также видео 4) C: Одновременное доминирующим карты частотой от НОАК и LAA. Быстрый область расположена в НОАК (9 Гц), что коррелирует с наличием в роторе анализ карту фазы. Высокая частота LAA составляет 6 Гц, что коррелирует с фибриллирующий проводимости. На правой стороне панели C, один пиксель оптическим активаций от НОАК и LAA показаны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Характеристики острого стретч-индуцированной ФП у изолированного сердца овец напоминают некоторые из свойств человеческой пароксизмальной ФП. Резкое увеличение внутри-предсердного давления в сердце овец позволяет поддерживать А. Ф. в течение длительных периодов времени, похожие на более высокий риск AF наблюдается у больных с мерцательной дилатации. 1 присутствия слева-направо градиенты DF в овец предсердий является также похожие на тех, кто зарегистрирован в человеческой электрофизиологических исследований. 16 Таким образом, понимание механизмов поддержания ФП в этой острой модель может улучшить терапевтические стратегии в настоящее время используется в человеческой пароксизмальной ФП. Некоторые из ограничений существующего подхода: во-первых, трудность воспроизведения влияния вегетативной нервной системы на аритмия в изолированных сердца, что исключает возможность экстраполяции результатов в естественных условиях. А во-вторых, модель ориентирована на острые стретч-индуцированной А.Ф., и, следовательно, выводы не следует распространять на структурно перестроен сердца, в котором фиброза и изменения в электрические свойства могут повлиять на модели активации на НОАК и LAA. Наконец, следует отметить, что из-за оптических ограничений, а также токсичность напряжение чувствительных красителей и движения расцепления соединения, оптические методы отображение в настоящее время не представляется возможным в живых предметов.
Тем не менее, использование оптических отображение и, в частности эндокарда отображение НОАК, как показано в этом протоколе достижений нашего механистического понимания AF путем выявления наибольшее число роторов в быстрые области частот. Последний предположить, что повторный может быть необходима для поддержания аритмии. Таким образом, различные фармакологические стратегии сосредоточены на прекращении спускаемого могут быть изучены с использованием этой модели, что делает его подходящим для соответствующего поступательного исследований.
Технологические усовершенствования в оптической подход отображение постоянно изыскиваются после. Хотя широким полем зрения и высоким пространственным и временным разрешением, полученные с оптическим отображением позволяет идентифицировать длительный роторов на 2D отображаются поверхности, очень часто те, роторы отойти от поля зрения. Таким образом, более панорамный оптический подход отображение позволит лучше отслеживать дрейфующих роторов и аритмии в целом. Новые красители, которые обеспечивают более глубоко проникают сигналы и новый математический анализ мог бы также позволяет отслеживать роторов и их нитях внутри 3D структура НОАК стене. Последний также позволит лучше понять модели активации ранее описан как поверхность прорывов, которые могли бы представлять очной повторно деятельности. Дополнительные улучшения проводимой включают: снижение токсичности напряжение чувствительных красителей, оптические зонды для дальнейших физиологических параметров, таких как внутриклеточная концентрация кальция, улучшение соединений и методы движения сокращения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
При частичной поддержке грантов NHLBI P01-HL039707 и P01-HL087226 и Leducq Foundation (JJ, О. Б.), по испанским обществом кардиологов стипендий, Фонд Педро Барри де ла Маса и Фонд Альфонсо Мартина Эскудеро (DFR), Федерацией Французским Cardiologie (RPM), от общества ритма сердца общение премии, стипендии Японии Heart Foundation / Японского общества Электрокардиография (МГ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Propofol | Abbott Laboratories | 5206-04-03 | |
| Pentobarbital | Lundbeck Inc | NDC 67386-501-55 | |
| Introducer 18 Gauge | Terumo Medical Corp. | SS*FF1832 | |
| Cuffed endotracheal tube (9 mm) | DRE Veterinary | #9440 | |
| Fiber Optic Laryngoscope Case | DRE Veterinary | #991 | |
| Fiber Optic Blade | DRE Veterinary | #984 | |
| Operating Scissors | DRE Veterinary | #9702#1944 | |
| Scalpel Handle #3 Solid 4" | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9843 | |
| Sterile Scalpel Blades | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9801-10 | |
| Ventilation bag | Westmed | 562013 | |
| Sims Scissors Curved Sharp/Blunt | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7035 | |
| Tissue Forceps (×2) | DRE Veterinary | #1895 | |
| KANTROWITZ Thoracic Forceps, 11" | Biomedical Research Instruments | 34-1980 | |
| Finochietto Large Chest Spreader | Kapp Surgical Instrument Inc. | KS-7301 | |
| Thoracotomy shears | Rostfrei Solingen | ||
| Plastic tray | Nalge Nunc international | Fischer | |
| Bonn Scissors (×2) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5840SC | |
| Surgical silk | Fisher Scientific | 50-900-04214 | |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5130 | |
| Tetrapolar electrode catheters (Torq) (×4) | Medtronic Inc. | 05580SP | |
| Digital sensor. Biopac Systems transducer | Biopac Systems, Inc. | RX104A | |
| Biopac Systems amplifier | Biopac Systems, Inc. | DA-100C | |
| Di-4-ANEPPS | Sigma-Aldrich | D8604-5mg | |
| Blebbistatin | Enzo Life Sciences | BML-E1315-0025 | |
| LittleJ– CCD video camera(×2) | SciMeasure Analytical Systems, Inc. | ||
| Dual-channel rigid borescope | Everest VIT, Inc. | R10-25-0-90 | |
| Perfusion pumps (×2) | Cole-Parmer | GK-77920-30 | |
| Temperature probe | Cole-Parmer | R-08491-02 | |
| pH meter | Fisher Scientific | 01-913-806 | |
| Digital temperature gauge | Cole-Parmer | GK89000-10 | |
| Oxygenator filters | Sorin | 05318 | |
| Silicon perfusion tubes (L/S 15) | Masterflex (Cole Palmer) | 96410-15 | |
| Laser light guides (×6) | Oriel Corp. | 77536 | |
| Liquid light-guide (0.2 in core) | Newport Corp. | 77556 | |
| Laser generator (1 watt) (×1) | Shanghai Dream Lsaer Tecchnology | SDL-532-1000T | |
| Laser generator (5 watt) (×1) | Newport Corp. | MILL 5sJ |
References
- Kannel, W. B., Wolf, P. A., Benjamin, E. J., Levy, D. Prevalence, incidence, prognosis, and predisposing conditions for atrial fibrillation: population-based estimates. Am J Cardiol. 82, (1998).
- Wolf, P. A., Abbott, R. D., Kannel, W. B. Atrial fibrillation as an independent risk factor for stroke: the Framingham Study. Stroke. 22, 983-988 (1991).
- Miyasaka, Y. Secular trends in incidence of atrial fibrillation in Olmsted County, Minnesota, 1980 to 2000, and implications on the projections for future prevalence. Circulation. 114, 119-125 (1980).
- Ravelli, F., Allessie, M. Effects of atrial dilatation on refractory period and vulnerability to atrial fibrillation in the isolated Langendorff-perfused rabbit heart. Circulation. 96, 1686-1695 (1997).
- Gray, R. A., Pertsov, A. M., Jalife, J. Spatial and temporal organization during cardiac fibrillation. Nature. 392, 75-78 (1998).
- Gray, R. A.
- Samie, F. H. Rectification of the background potassium current: a determinant of rotor dynamics in ventricular fibrillation. Circ Res. 89, 1216-1223 (2001).
- Kalifa, J. Intra-atrial pressure increases rate and organization of waves emanating from the superior pulmonary veins during atrial fibrillation. Circulation. 108, 668-671 (2003).
- Mandapati, R., Skanes, A., Chen, J., Berenfeld, O., Jalife, J. Stable microreentrant sources as a mechanism of atrial fibrillation in the isolated sheep heart. Circulation. 101, 194-199 (2000).
- Yamazaki, M. Mechanisms of stretch-induced atrial fibrillation in the presence and the absence of adrenocholinergic stimulation: interplay between rotors and focal discharges. Heart Rhythm. 6, 1009-1017 (2009).
- Rama, D. F., Jalife, J. Mechanisms Underlying Atrial Fibrillation. Basic Science for Clinical Electrophysiologist. Antzelevitch, C. 3, SAUNDERS. 141-156 (2011).
- Berenfeld, O., Zaitsev, A. V., Mironov, S. F., Pertsov, A. M., Jalife, J. Frequency-dependent breakdown of wave propagation into fibrillatory conduction across the pectinate muscle network in the isolated sheep right atrium. Circ Res. 90, 1173-1180 (2002).
- Haissaguerre, M. Spontaneous initiation of atrial fibrillation by ectopic beats originating in the pulmonary veins. N Engl J Med. 339, 659-666 (1998).
- Warren, M. Blockade of the inward rectifying potassium current terminates ventricular fibrillation in the guinea pig heart. J Cardiovasc Electrophysiol. 14, 621-631 (2003).
- Claerbout, J. F. Fundamentals of Geophysical Data Processing. , McGraw-Hill. New York. (1976).
- Atienza, F. Real-time dominant frequency mapping and ablation of dominant frequency sites in atrial fibrillation with left-to-right frequency gradients predicts long-term maintenance of sinus rhythm. Heart Rhythm. 6, 33-40 (2009).
