Kvantifiering Kognitiva Minskar orsakas av Kranial Strålbehandling

Summary

Kognitiv nedsättning till följd av radioterapeutiska hantering av hjärntumörer representerar ett kliniskt svårbehandlad tillstånd som negativt påverkar livskvaliteten. Förmågan att kritiskt utvärdera potentiella interventioner för att lindra strålningsinducerade kognitiva minskningar beror ytterst på förmågan att göra noggranna kvantitativa bedömningar av kognition.

Abstract

Med undantag för överlevnad, är kognitiv försämring som härrör från den kliniska hanteringen av cancer en viktig faktor dikterar terapeutiska resultat. För många patienter lider av CNS och icke-CNS maligniteter, strålbehandling och kemoterapi ger de bästa alternativen för sjukdomsbekämpning. Dessa behandlingar kommer dock till en kostnad, och nästan alla överlevt cancer (~ 11 miljoner enbart i USA från och med 2006) medföra en viss risk för att utveckla kognitiv dysfunktion, med de mest allvarliga fallen finns patienter som utsatts för kranial strålbehandling (~ 200.000 / år ) för kontroll av primära och metastatiska hjärntumörer ^1. Särskilt problematiskt är barn fall, vars långsiktiga överlevnad plågas med tydliga kognitiva minskningar resulterar i betydande samhällsekonomiska bördorna ^2. Hittills finns det fortfarande inga tillfredsställande lösningar på detta betydande kliniskt problem.

Vi har tagit upp detta allvarliga hälsoproblem med transplanterade stamceller ceLLS för att bekämpa strålningsinducerad kognitiv försämring i atymiska råttor som utsatts för strålbehandling av kraniet ^3. Detaljer om stereotaxisk bestrålning och in vitro odling och transplantation av mänskliga neurala stamceller (hNSCs) finns i vår följeslagare papper (Acharya et al., Jové referens). Efter bestrålning och transplantation, är råttorna sedan utvärderas för förändringar i kognition, ympad cellöverlevnad och uttryck av differentiering-specifika markörer 1 och 4-månader efter bestrålning. Att kritiskt utvärdera framgång eller misslyckande eventuella intervention för att förbättra strålningsinducerad kognitiv sviter, en rigorös rad kvantitativa kognitiva uppgifter måste utföras. För att uppnå detta, utsätter vi våra djur till en svit av kognitiva tester paradigm inklusive nya plats erkännande, vatten labyrint, förhöjda plus labyrint och rädsla konditionering, i syfte att kvantifiera hippocampus och icke-hippocampus inlärning och minne. Vi har visat användbarheten avdessa tester för att kvantifiera vissa typer av kognitiva försämringar i bestrålade djur och använde dem för att visa att djur engrafted med hNSCs uppvisar signifikanta förbättringar i kognitiv funktion ^3.

De kognitiva fördelarna ympade mänskliga stamceller tyder på att liknande strategier kan en dag ge välbehövlig klinisk anlita cancer överlevande lider av nedsatt kognition. Därför har vi lämnat skriftligt och visuell dokumentation av de kritiska steg som används i våra kognitiva tester paradigm för att underlätta översättningen av våra lovande resultat i kliniken.

Protocol

Våra kognitiva tester paradigmer schematiskt schematiskt i figur 1. Kognitiv testning initieras en månad efter bestrålning och kirurgiska ingrepp utförs.

Genomföra om nya Placera Recognition (NPR) Uppgift

1. Romanen Placera Recognition (NPR) uppgift är baserad på procedurer som beskrivs av Mumby och kollegor (2002), och är en rumslig erkännande minne uppgift som bygger på hippocampus ^4.
2. Råttor först förtrogen med test sammanhang genom att placera dem i testningen arenor (skräddarsydda, vit, akryl, öppna boxar, 70cm x 70cm x 40cm höga) i 20 minuter en gång per dag i tre dagar. Objekt som inte kommer att användas för senare testning placeras i arenorna under dessa tillvänjning sessioner.
3. För tillvänjning fasen bör manuella observationer av utforskande beteende noteras under inspelning och spårning av beteende inte är nödvändiga.
4. För alla faser av NPR uppgiften är arenor rengöras grundligt mellan djur med 70% etanol för att minimera störande lukt ledtrådar. För alla försök till experimenterar placera djur i mitten av tester arenor på ett konsekvent orientering minimerar risken för att djuren helt enkelt kommer att undersöka det block som de råkar placeras intill.
5. Den förtrogenhet fas och 5-minuters testfas administreras på den fjärde dagen.
6. För förtrogenhet fas två identiska plastblock (8cm x 3 cm x 10 cm hög) som har noggrant rengöras med 70% etanol placeras på specifika positioner inom testning arenor. Ett djur placeras i varje arena för 5 minuter och fick utforska fritt.
7. Undersökning av de två lika välbekanta rumsliga positioner värderade med hjälp av automatiserade system för spårning. För alla faser är prospektering definieras som ett djurs näsa punkt ligger inom en 4 cm radie och riktas mot blocken.
8. Following den förtrogenhetsutbildning fasen djuren placeras i en liten anläggning bur för en 5-minuters fördröjning intervall. Under denna tid, är testning arenor rengörs med 70% etanol, och identiska kopior av blocken sättes, en i en identisk rumslig position som under förtrogenhet fasen, och en i en ny rumslig läge. Om en råtta minns den rumsliga arrangemanget av block från förtrogenhet fasen kommer det att spendera mer tid att utforska blocket ligger i romanen rumsliga platsen.
9. Efter 5-minuters fördröjning intervall djuren tillbaka till testning arenor för 5-minuters testfas. De utforskar fritt under 3 minuter.
10. 24 timmar efter slutet av förtrogenhet fasen djuren tillbaka till testning arenor igen för 24-timmars testfas. För denna fas är ett kvarter i samma läge som under förtrogenhet och 5-minuters faser test, och det andra blocket placeras i en ny, ny rumslig position. Återigen, om en råtta remedlemmar rumsliga arrangemanget av block från förtrogenhet fasen dagen innan, kommer han spendera mer tid att utforska blocket ligger i romanen rumsliga platsen.
11. Nu är den tid spenderas utforska block i olika rumsliga positioner samlas in med hjälp av automatiserade spårning programmet och kan analyseras statistiskt för skillnader mellan experimentella grupper.
12. För förtrogenhet fas tillbringade total tid utforska både rumsliga platser i hela rättegången beräknas. Det bör inte finnas någon skillnad i tid utforska två rumsliga platser under denna fas som de är lika bekanta / obekanta för djuren (fig. 2A). Vidare, signifikanta skillnader i den totala prospektering mellan de experimentella grupperna kan tyda grupp variationer i motivation att utforska eller nivåer ångest och bör beaktas vid tolkning av rumsliga resultat erkännande minne från de två testfaser.
13. För både5-minuters och 24-timmars faser test, är ett prospekteringsbolag förhållande beräknas enligt följande: tid att utforska nya läge - tid att utforska bekanta ställning / total tid att utforska (Figur 2B). På detta sätt, är individuell variabilitet i motivation att utforska föremålen beaktas. Normala djur tillbringar betydligt mer tid att utforska den nya rumsliga position än väntat av en slump (anges av den streckade linjen) efter 5-minuters och 24-timmars fördröjning intervall (Fig. 2B).
14. Prospektering förhållande är normalt beräknas för de första 60 sekunderna av de 5-minuters och 24-timmars test ^4. Detta beror på att, efterhand som proven försök framsteg blir det nya rumsliga positionen mer bekant för djuren. Således ger den första minuten av testet prövningar den mest exakta bedömningen av rumsliga erkännande minne.

2. Genomföra förhöjda plus labyrint (EPM) Uppgift

1. Den förhöjdaPlus Maze (EPM) uppgift är baserad på rutiner från Walf och Frye, 2007 ^5.
2. EPM uppgiften används för att bedöma ångest hos gnagare. EPM apparaten är en 4-arm labyrint (45 "X 4") upp 45 "från golvnivå, med armarna arrangerade i ett plus form. Två armar är slutna och två är öppna. Anordningen som visas är tillverkad av Med Associates Inc .
3. Beteende under denna uppgift speglar en konflikt mellan råttans naturliga motivation att utforska nya miljöer (tid i öppna armar) och preferens för kvar i skyddade områden (stängda armar).
4. Den experimentella rummet är starkt upplyst med spotlights pekade på labyrinten för att säkerställa tillräcklig motivation att föredra de slutna, mer svagt upplysta armar.
5. Labyrinten rengörs ordentligt innan det första djuret testas, och mellan varje försök.
6. Djuret placeras i anordningen genom att hålla det under frambenen och placera den i den centrala delen av labyrinten, vetter den öppna armen som är borta frånförsöksledaren. Varje försök varar i 5 minuter.
7. Sökvägen djuret spåras med hjälp av automatiserade mjukvara så att antal inresor och hur lång tid som tillbringas i de öppna och slutna armar kan beräknas. Ytterligare beteenden såsom uppfödning, grooming och huvud doppar över sidan av apparaten kan övervakas. En inmatning räknas när mittpunkten hos djuret passerar in i en arm.
8. Om en råtta faller av labyrinten är det snabbt placeras tillbaka på den öppna armen som det föll, och händelsen registreras i observationen anteckningsbok. Om en råtta fryser under en längre tid, fortsätter beteendet, tillsammans med eventuella orsaker (t.ex. plötsliga, höga ljud utanför testrum) noteras, och provning så att alla försöksdjur har liknande exponeringstider.
9. Tid i de öppna kontra slutna armar används för att beräkna kvoten: tiden i öppna armar / total tid i armar. Likaså är förhållandet mellan posterna öppna armar mot den totalaarm poster beräknas. Använda automatiserade spårningsprogram, reste totalt avstånd och hastighet kan också mätas för att bedöma eventuella skillnader i motorisk funktion mellan experimentella grupper.
10. Minskad oro är associerad med en större andel av tiden tillbringas i de öppna armarna, medan ökad ångest och rädsla är förknippade med mer tid i de slutna armarna. Normala djur tillbringar betydligt mindre tid i de öppna armarna än förväntat av en slump (indikeras av den streckade linjen, Fig.. 3). Mer oroliga djur kommer att spendera proportionellt mindre tid i de öppna armar, medan mindre ängsliga djur kommer att spendera mer tid i de öppna armarna (t.ex. efter flera exponeringar mot labyrinten eller efter ångestdämpande läkemedelsbehandling).

3. Genomföra kontextuell och cued Fear Luftkonditionering (FC) Uppgift

1. Kontextuella och cued Fear Arbetsbord (FC) uppgift beskrivningar är baserade på förfaranden från Schafe et al., 1999, Winocur et al., 2006 och MacLeod et al., 2007 ^6-8.
2. The Fear Luftkonditionering (FC) uppgift är en beteendevetenskaplig paradigm där djur lär sig att frukta en tidigare neutralt stimulus (en kontext, ett ljus eller en ton, det konditionerade stimulus) genom att para ihop det med skadlig stimulus (oftast en mild fotchock, den obetingat stimulus ). Lärande är snabb, robust och långvarig, och därmed FC uppgiften används ofta för att studera neurobiologiska kretsar för inlärning och minne hos gnagare.
3. FC apparaten är en 30 cm x 30cm x 40cm hög slutna kammare (Phenotyper, modell 3000, Noldus Informationsteknik). Golvet i kammaren består av ett rostfritt stål galler som används för att avge chocken stimulans. Den Phenotyper är utrustad med en högtalare som avger en 2300Hz, 90dB ton på begäran, i egenskap av den betingade stimulus.
4. Den stöt avges via en chock-generator (Med Associates Inc.). Chocken är en tillfällig obehag som producerar lasTing smärta eller vävnadsskada. För både utbildning och prov, är leverans av chocken och stimuli ton tidsbestämda och kontrolleras automatiskt med hjälp av Ethovision XT add-on Trial och hårdvara Control Module (version 7,0, Noldus Informationsteknik).
5. Den första dagen är FC utbildning genomförs. Den Phenotyper rengörs noggrant med 70% etanol och ett enda djur placeras i kammaren. Utbildningen rättegången består av tre faser: (1) en baslinje fas när ingen chock eller ton administreras, (2) en utbildning fas, när ton-chock parningar presenteras, och (3) en post-utbildning fas, när ingen stötar eller ton administreras. Varje fas varar ca 5 minuter för en total träning försökstiden på 15 minuter per djur.
6. Under utbildningen fasen tonen administreras i 30 sekunder och sammanfaller med slutet av tonen, en 1mA stöt levereras till nätet för 1 sekund. Denna ton-stöt parning upprepas totalt 5 gånger, med en variabel från 10 till 60 Second intervall avståndet mellan varje parning.
7. Från utbildningen fasen tillbringar den procentandel av tiden varje djur orörlig, eller frysning, mäts från de sista 60 sekunderna av första baslinje fasen (upprätta spontan frysning innan ton-chock ligaspel) och från de sista 60 sekunderna av tjänsten -utbildning fas (att etablera frysning beteende som svar på ton-chock pairings). Normala djur uppvisar mycket låga nivåer av frysning under baslinjen fasen och mycket hög (~ 95%) nivåer av frysning under efter träningsfasen (fig. 4).
8. 24 timmar senare, är djuret tillbaka till samma kontext och observerades för 5 minuters kontextuella FC testet. Ingen chock eller ton levereras under denna fas, och procent av tid frysning beräknas för hela försöksperioden. Notera vikten av att sammanhanget konstant från utbildning till kontext test. I själva verket, har samma försöksledaren handtaget och testa djuren på båda dagarna är nedigt. Normala djur tillbringar ungefär 70% av det sammanhang studien bedriver frysning beteende (bild 4).
9. Den cued FC testet administreras en timme senare. Sammanhanget i kammaren ändras genom att ta bort gallergolvet, lägga paneler på utsidan av kammaren, och rengör golvet med en doftande rengöringsmedel. Djurets frysning beteende observerades för första minuten, och frysningspunkter är mycket låg om sammanhanget har tillräckligt ändrats (bild 4). Tonen spelas sedan i 3 minuter, följt av en slutlig tyst minut, och procent tid frysning beräknas. Normala djur visar höga nivåer av frysning under denna tid (fig 4).
10. Totalt är 5 diskreta åtgärder för frysning beteende samlas in, (1) baslinje, (2) efter utbildning, (3) sammanhang testet, (4) före cue test, (5) kö och efter cue-test.
11. Frånvaro av frysning under baslinjen fasen fastställer normala ångest nivåer, medan betydande frysning under efter träningsfasen tyder intakt sensorisk-motorisk förmåga. Frysning under sammanhanget testet fastställer 24-timmars minne för utbildning sammanhang, som bygger på intakta hippocampus och amygdala funktion ^9. Brist på förhand cue testet frysning tyder tillräcklig ändring i grundutbildningen sammanhang. Cue och efter cue frysning fastställer 24-timmars minne för tonen stimulans, som bygger på intakt amygdala funktion ^9.

4. Genomföra Morris Water Maze (MWM) Uppgift

1. Morris Water Maze uppgift förfaranden baserade på tidigare beskrivningar ^10,11.
2. Morris water maze (MWM) uppgift är ett test av rumslig lärande för gnagare som kräver användning av distala ledtrådar för att hitta en nedsänkt fly plattform i en stor pool av ogenomskinligt vatten. Stora, tydliga visuella referenser är placerade runt poolen i specifika fasta platser. Djur lär sig att använda dessa ledtrådar för att navigera till SUbmerged plattform. Djuren övervakas och avlägsnas från vattnet om de inte kan simma.
3. Spatial lärande bedöms över upprepade försök och referens minne bestäms genom att bedöma preferens för plattformen området när plattformen är frånvarande. Återföring försök förbättra detekteringen av rumsliga nedskrivningar och kan beskatta ytterligare hjärnan regioner som främre hjärnbarken ^10.
4. MWM Uppgiften ges över 8 dagar och består av 4 faser, en cued prov, ett förvärv fas, en 24 hr prob test och en vändning lärande test.
5. Poolen är en skräddarsydd vit, polyeten tank, 200cm i diameter och 60 cm hög. Den är fylld med vatten till ca 30 cm djup och gjorde ogenomskinlig med vit, giftfri färg. Vatten hålles mellan 20 och 22 ° C (68 och 72 ° F). Flykten plattformen är en skräddarsydd, klar plast stativ med en cirkulär topp mäter 10 cm i diameter. Den sitter ungefär 1,5 cm under ytan av vattr.
6. Den cued Provet består av 4 försök administreras dag 1. För dessa studier är en distinkt svart och vit flagga placeras i mitten av plattformen så att fly platsen är uppenbart för djuren. För att minimera användningen av geografisk information under denna fas, är väggen signaler bort och plattformen och platser start varieras från rättegången inför rätta. Denna fas hjälper utesluta sensomotorisk-relaterade skillnader mellan experimentella grupper före förvärvet fasen börjar.
7. För alla faser av MWM uppgiften djuren hålls under frambenen och försiktigt placerats i vattnet vid den angivna startposition, mot väggen av poolen. Djuren testas i kohorter av 8 så att det finns en 8 till 10 minuters inter-försöket intervall mellan var och en av de 4 dagliga försöken. Under de internationella rättegången intervall djuren hålls i uppvärmningen burar för att undvika hypotermi.
8. För cued testet är en maximal simma på 30 sekunder tillåtet för djuret att klättra upp påplattform. Om den maximala tiden nås innan djuret flyr, styr försöksledaren till plattformen för hand och lägger den på plattformen. Djuret kvar på plattformen för en viloperiod på 20 sekunder innan den placeras i en värmande bur.
9. För varje cued prov studie djuret startas från en annan, förutbestämt startplats i utkanten av poolen, och plattformen också flyttas till var och en av de 4 olika kvadranten positioner.
10. Förvärvet fasen börjar följande dag och består av 4 försök per dag under 5 på varandra följande dagar. Under denna fas förblir dolda plattformen på samma plats och djuren lär sig att navigera till den med hjälp av distala rum ledtrådar.
11. Återigen, för var och en av de 4 studier är djuret placeras i poolen vid en annan, förutbestämd startpunkt. Varje dag, två av startpunkter är till vänster och två av startpunkter är till höger av plattformen, i slumpmässig ordning, för att undvika utveckling av egocentric rumsliga strategier för att lösa uppgiften.
12. Den maximala simma tid för varje förvärv försöket är 60 sekunder, varefter djuret styrs till och placeras på plattformen av försöksledaren. Djuret kvar på plattformen för 20 sekunder efter fly.
13. På dag 7, 24h efter den slutliga utbildningen studie är en 60-andra sond studie administreras i vilken plattformen avlägsnas. Denna fas bestämmer djurets preferens för kvadrant som används för att innehålla plattformen och används som ett mått på rumslig referens minne ^10. Efter sonden försöket, är plattformen tillbaka till samma kvadrant och 3 vanliga förvärv försök administreras.
14. För återföring lära test på dag 8, är plattformen flyttas till en ny plats för att bedöma återföring inlärningsförmåga. Mätning av tid djur tillbringar söker plattformen i dess tidigare läge kontra den nya platsen ger en bedömning av perseveration eller inalighet att undertrycka svara på den tidigare platsen när plattformen har förflyttats ^10. När det gäller förvärv och faser sond är fyra 60-sekunders försök administreras.
15. För cued testet, latens för att hitta plattformen och hastighet används som mått på visuell och motorisk funktion, respektive. Skillnader mellan experimentella grupper under denna fas måste beaktas vid tolkningen av förvärv och minne resultat som skillnader i sensorisk-motorisk funktion mellan grupperna kan finnas.
16. För förvärvet fasen innebär latens för att hitta plattformen och / eller våglängd används som mått på spatial inlärning. I normala djur, fly latens minskar gradvis under de fem förvärv dagarna så att medelvärdet flykt är cirka 15 till 20 sekunder på dag 5 (Fig. 5A).
17. För sonden fasen, medelavståndet till plattformen (figur 5B) och / eller latens att först nå plattformen tidigare läge (fig 5C
18. För återföring fasen, tillbringade procent tid i gamla kontra nya kvadranten innehåller plattformen används som ett mått på perseveration. Under de fyra försöken, bör företräde för den gamla plattformen platsen minska när preferens för den nya plattformen platsen är etablerad (Fig. 5D).

5. Representativa resultat:

Figur 1. Schematisk representation av våra kognitiva tester paradigm.

Figur 2. Representativa resultat från kontrolldjur på den nya platsen erkännande uppgift. A) Total tid utforska två rumsliga positioner bör vara ungefär lika under förtrogenhet fas. B) Prospektering förhållande (tid att utforska nya posättningen / tid att utforska båda positionerna) visar en tydlig preferens för det nya rumsliga positionen efter 5-minuters och 24-timmars fördröjning intervall. Den streckade linjen indikerar chans prestanda.

Figur 3. Representativa resultat från kontrolldjur på den förhöjda plus labyrint. Normala djur tillbringar mindre tid än förväntat av en slump i de öppna armarna (indikeras av den streckade linjen). Ängslig djur kommer att spendera proportionellt mindre tid i de öppna armarna jämfört med kontroller, medan flera exponeringar mot labyrint eller behandling med ångestdämpande medel ökar tiden i de öppna armarna.

Figur 4. Representativa resultat från kontrolldjur på rädslan konditionering uppgiften. Låga nivåer av frysning observeras under initial exponering till kammaren (baslinje), Och när sammanhanget ändras före den vita testet (före-cue test). Däremot normala djur tillbringar större delen av tiden efter träningsperioden bedriver frysning beteende. Om djuren kommer ihåg i vilket sammanhang utbildningen skedde efter en 24 hr försening, kommer de delta i frysning beteende för cirka 70% av 5-minuters sammanhang rättegång. Likaså om djuren kommer ihåg tonen, de visar höga nivåer av frysning under kö och efter cue-test.

Figur 5. Representativa resultat från kontrolldjur på Morris Water Maze uppgift. A) Escape latens minskar med progressiv träning under förvärvet fasen. B) och C) Genomsnittlig avstånd från och latens att först korsa föregående plattformen plats under 24 hr probtest används som mått på rumslig referens minne. D) Återföring inlärning bedöms genom att ändra placeringen av plattformen på den sista dagen av TESTing. Under de 4 studierna normala djur stannar gradvis söka på gamla kvadranten och lära sig att plattformen är på en ny plats.

Discussion

Det finns ett trängande behov av långsiktiga strategier för att förebygga utvecklingen av kognitiv dysfunktion som blir allt vanligare i cancer överlevande ^12,13. Stamcellsterapi kan ge medel för att lindra en rad normal vävnad följdtillstånd i CNS, eftersom de ger en möjlighet att ersätta celler som förlorade eller skadade från cytotoxiska cancerbehandlingar ^14. Att påskynda förverkligandet av dessa ansträngningar har vi genomfört en rad bevis på huvudsakliga experiment som har bekräftat förmågan att kranialt ympade hNSCs att funktionellt återställa kognition inom det bestrålade vävnaden bädd av CNS ^3. Kritiskt för denna strävan var möjligheten att tillförlitligt genomföra en serie av noggrant kontrollerade kognitiva tester på ett reproducerbart sätt. Vi har detaljerade dessa kritiska procedurer i arbetet med att påskynda den translationella potential stamcellsterapi på kliniken. Ytterligare överväganden somkan ha en betydande inverkan på kvaliteten på uppgifterna är markerade nedan.

Kognitiv testning kräver noggrann uppmärksamhet på detaljer och följa vissa standardmetoder kan hjälpa till att minimera artefakter som försvårar tolkningen av resultaten. Användningen av särskilda beteende tester rum separat från djurrum innehav och praktiker är att föredra. Det är också klokt att använda "vitt brus" som blockerar externa ljud i djurets anläggning som kan distrahera djur från uppgiften. För att minimera stressen till djur avsedda för kognitiv testning, är det viktigt för dem att känna till praktiker som ska utföra beteende tester före uppgiften administration. Generellt gäller att om testning kvinnor och män, är det lämpligt att testa kvinnor först som de tenderar att vara mer orolig under testningen om manliga lukt ledtrådar kvar i test arenor. Vid administrering en seriell batteri uppgifter, är det viktigt att exponera djuren till least stressande funktioner först (som EPM, NPR) och mest stressiga uppgifter senaste (som FC, MWM).