Plasma Lithography Oberflächenstrukturierung für die Erzeugung von Cell Networks

Summary

Ein vielseitiges Plasma Lithographie wurde entwickelt, um stabile Oberfläche Muster zur Führung Anheftung der Zellen zu generieren. Diese Technik kann angewendet Cell Networks einschließlich derer, die natürlichen Geweben zu imitieren und hat für das Studium mehrere, unterschiedliche Zelltypen verwendet worden zu erstellen.

Abstract

Systematische Manipulation einer Zelle Mikroumgebung mit mikro-und nanoskaliger Auflösung wird häufig für die Entschlüsselung verschiedener zellulärer und molekularer Phänomene erforderlich. Um dieser Anforderung haben wir einen Plasma-Lithographie, die zellulären Mikroumgebung durch die Schaffung einer strukturierten Oberfläche mit Strukturgrößen im Bereich von 100 nm bis in den Millimeterbereich zu manipulieren entwickelt. Das Ziel dieser Technik ist in der Lage sein zu lernen, in einer kontrollierten Art und Weise, das Verhalten einzelner Zellen als auch für Gruppen von Zellen und ihrer Wechselwirkungen.

Dieses Plasma-Lithographie-Verfahren basiert auf selektiven Modifizierung der Oberflächenchemie auf einem Substrat durch Abschirmung der Kontakt der Niedertemperatur-Plasma mit einer physischen Form basiert. Diese selektive Abschirmung hinterlässt eine chemische Muster, Zelladhäsion und Bewegung führen kann. Dieses Muster oder Oberflächen-Templates können dann verwendet, um Netzwerke von Zellen, deren Struktur, die in der Natur nachzuahmen und erzeugt einen kontrollierbaren Umfeld für experimentelle Untersuchungen zu erstellen. Die Technik ist gut für das Studium biologisches Phänomen geeignet, da sie stabile Oberfläche Muster produziert auf transparente polymere Substrate in eine biokompatible Weise. Die Oberfläche Muster letzten Wochen und Monate und kann somit Guide Interaktion mit Zellen über lange Zeiträume, die das Studium der langfristigen zelluläre Prozesse, wie die Differenzierung und Anpassung erleichtert. Die Modifizierung der Oberfläche ist in erster Linie chemischer Natur und somit nicht vorstellen topografischen oder physische Störungen für die Interpretation der Ergebnisse. Darüber hinaus beinhaltet keine aggressiven oder giftigen Substanzen zu Strukturierung zu erreichen und ist für die Zellkultur kompatibel. Darüber hinaus kann es angewandt, um verschiedene Arten von polymeren Substraten, die durch die Fähigkeit, ihre Eigenschaften stimmen ideal für sich und werden häufig in biologischen Anwendungen zu ändern. Die erzielbare Auflösung ist auch von Vorteil, als Isolierung spezifischer Prozesse wie Migration, Adhäsion oder Bindung kann für diskrete, klar Beobachtungen an den einzelnen zu mehrzelligen Ebene.

Diese Methode wurde verwendet, um unterschiedliche Netzwerke verschiedener Zelltypen für Untersuchungen mit Migrations-, Signal-, Gewebe-Bildung und das Verhalten und die Interaktionen von Neuronen angeklagt in einem Netzwerk zu bilden.

Protocol

1. Herstellung von Formen zur Strukturierung eingesetzt

1. Konzeption von Mustern. Patterns sind geschaffen, die dazu dienen, Zell-Netzwerke zu bilden, Steuer-Zell-Kontakt, zu isolieren Zellen, ahmen natürliche Strukturen, oder auf andere Weise führen die Zelladhäsion und Platzierung.
2. Computer-Aided Design oder CAD-basierte Erstellung von Muster und Erstellung von Photomasken. Das gewünschte Muster wird in CAD-Software wie AutoCAD konzipiert und wird dann an ein externes Unternehmen zur Herstellung einer Photomaske geschickt.
3. Photolithographie zu meistern Muster zu erzeugen. Glasträger sind entweder mit einem dünnen positive widerstehen oder einen dicken Negativ-Resist abhängig von der Größe der Struktur geschaffen gemustert. Glasträger sind für ihre Vorteile als kostengünstige, stärker als Silizium-Wafern und nicht produzieren so viel Staub, wenn sie gebrochen werden. Alternativ können auch andere praktische Strukturen wie Beugungsgitter als Urmodell verwendet werden.
4. Die strukturierte Folie ist mit einem Stapel von Dias, die nicht gewesen sein gemusterten befestigt. Alle Schritte werden in einem sauberen Werkbank durchgeführt, um die Staubentwicklung zu minimieren.
5. Erstellung von Master-Formen. Ein Behälter aus Alufolie etwas größer als die Stapel von Dias erstellt, um die 30 g Polydimethylsiloxan (PDMS), die dann über die photolithographisch strukturierte Oberfläche gegossen wird, um eine erste Form erstellen zu halten. Das PDMS wird entgast und dürfen für 1-2 Tage aushärten.
6. Nach dem Aushärten des PDMS ist aus der Master-Muster geschält und bildet eine Form für den nächsten Schritt.
7. 6 g der 2 Teil Epoxy (Devcon # 14310 (6 g) wird für 1 Minute gemischt und anschließend in die Master-Form, entgast und aushärten gelassen. Entgasung der Epoxid schnell getan werden muss (<8 min) mit vielen Blasen brechen Zyklen und nur mit einer dünnen Schicht, bevor es die Epoxy-Sets und Blase Entfernung unmöglich wird, um die Luftblasen zu entfernen. Die 6 g verwendet erzeugt eine dünne Schicht, die schnelle Blase Entfernung erleichtert.
8. Nach einer Stunde wird die 2-teilige Epoxy teilweise geheilt werden und Epoxidharz können auf der Oberseite ohne Entgasung, um eine dickere Struktur, die Orientierung im späteren Schritten Griff zu produzieren hinzugefügt werden. Das Epoxidharz wird dann für 1-2 Tage aushärten.
9. Nach dem Aushärten wird das Epoxidharz aus der PDMS Master-Form entfernt und Band ist rund um die Epoxy-Form verpackt, um einen Container zu bilden. Eine Arbeitsgruppe Form wird dann durch Gießen PDMS auf die Epoxid-Schimmel, Entgasung des PDMS und Aushärtung für 1-2 Tage erstellt.
10. Nach dem Aushärten wird die Arbeitsform aus der Epoxid-geschält und gespeichert werden, um sauber zu halten.

2. Strukturierung von Oberflächen mit Formen für die Zell-Führung

1. Kleine Teile der Arbeiterklasse Schimmel sind ausgeschnitten und auf einen Polystyrol-Petrischale. Die Standorte dieser Formabschnitte gekennzeichnet sind.
2. Ein Stativ ist aus dem kleinen Abschnitten und gewichtet, um konformen Kontakt zwischen der Arbeiterklasse Schimmel und der Petrischale Oberfläche zu gewährleisten gebildet. Gute Platzierung können, indem Sie am unteren Rand der Schale beobachtet werden.
3. Die Montage ist in die Plasmakammer gelegt. Plasma-Behandlung eingeleitet wird und bei 150 Pa weiterhin bei 29,6 W (max. Leistung) für 10 Minuten mit Luft-Plasma.
4. Nach der Plasmabehandlung sind die Form und das Gewicht Anklage entfernt.
5. Die Petrischale wird unter UV-Licht für 10 Minuten der Sterilisation in der Biosicherheit Schrank gestellt und dort bis und mit Zellen besiedelt gespeichert.

3. Seeding Oberflächen mit Zellen

1. SH-SY5Y CRL-2266 humanen Neuroblastom oder andere Zellen kultiviert werden über Standard-Protokolle für den Zelltyp.
2. Der Zusammenfluss von SH-SY5Y CRL-2266 humanen Neuroblastom-Zellen ist optisch vor der Aussaat auf die gemusterte Oberfläche gemessen.
3. Standard-Zell-Splitting wird durchgeführt, um die Zellen von der Oberfläche der Petrischale zu entfernen.
4. Die Zellen, einmal frei schwebend, auf die Oberfläche der gemusterten Petrischale, nachdem sie verdünnt, um die gewünschte Zusammenfluss erreichen, wenn auf der strukturierten Oberfläche platziert ausgesät.
5. Die Zellen werden absitzen und heften sich an die Oberfläche.
6. Die strukturierte Petrischale wird für mehrere Stunden bis mehrere Tage inkubiert, während die Zellen auf das Muster durch das Plasma erzeugt montieren.
7. Wenn die Kultivierung der Neuroblastom-Zellen, Retinsäure (10 pM) wird täglich um die Zellen zu induzieren, um in einem Neuron-ähnliche Zustände zu unterscheiden aufgenommen. Die Zugabe der Retinsäure im Dunkeln durchgeführt.
8. Retinsäure ist täglich für mehrere Tage aufgenommen, nach der Differenzierung zu beobachten sein wird.
9. Medien ersetzt wird alle 3-4 Tage.

4. Beobachtung und Analyse

1. Regelmäßige Aufnahmen der lebenden Zellen oder Videos getroffen werden, um die das Verhalten der Zelle im Laufe der Zeit zu beobachten. Für Live-Bilder werden die Zellen in einem Mikroskoptisch top Inkubator, die die Zellen hält bei 37 ° C, 100% Luftfeuchtigkeit und 5% CO ₂ platziert. Es können auch Zellen fixiert und für die Beobachtung unter Fluoreszenz angefärbt werden

5. Repräsentative Ergebnisse:

Eine typische Folge der Durchführung der Plasma-Lithographie ist die Bildung eines Musters von Zellen, die eine willkürliche oder natürliche Struktur ähnelt. Dies ist in Abbildung 1a-b, wo Leitungen und Netze von Neuronen geschaffen gesehen haben. Andere Zelltypen können ebenso wie in Abbildung 1c-d, die menschliche Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) und C2C12 Skelettmuskelzellen bilden Netze Ausstellungen zu sehen. Materialien wie Poly-L-Lysin können auch gemustert werden, Bild 1e, um die Befestigung von bestimmten Zelltypen und für andere Zwecke zu erleichtern. Im Falle der Neuronen gezeigt, was geschaffen werden Netzwerke von Zellen, die Verbindungen zwischen ihnen. Dieser repliziert, was kommt in der Natur im Gehirn, wo Neuronen haben diskrete Verbindungen zwischen benachbarten Zellen, die die Arbeitsweise des Gehirns beeinflusst. Mit der Schaffung einer solchen Struktur im Labor kann die Anzahl, Position, Frequenz und andere Faktoren, die Verbindungen systematisch kontrolliert werden. Das Ergebnis dieser Anklagen visuell gemessen werden und zusätzliche Eingaben wie chemische oder elektrische Stimulation kann implementiert, um die Netzwerk-Verhalten Sonde werden.

Ein negatives Ergebnis wäre ein überwuchert oder unvollständige Muster oder eine verunreinigte Probe. Eine unvollständige oder überwachsen Muster würde von der Aussaat des Substrats mit entweder zu wenige oder zu viele Zellen, die nicht liefern das Muster mit einem idealen Menge an Zellen zur Folge hätte. Außerdem, wenn das Muster nicht vorgesehen ist korrekt (z. B. Linien zu schmal) die Zellen nicht in der Lage zu befestigen und erfolgreich zu wachsen auf ihr. Im Fall einer verunreinigten Probe würde eine sorgfältige Reinlichkeit nicht während einer der Schritte beibehalten haben, obwohl dies selten ist, wenn nach einer ordnungsgemäßen Zellkultur-Protokoll aufgrund der Tatsache, dass die Plasma-Strukturierung auch sterilisiert das Substrat.

Abbildung 1. Strukturierung von Zellen und Protein.

Discussion

Die Zelle Untersuchung hier vorgestellte Methode ermöglicht die Erstellung von komplexen Mustern von mehrzelligen Netzwerken, die biologischen Strukturen imitieren sowie eine Methode, um Reize, die subzelluläre in der Natur, die dann erleichtert Untersuchungen beider gruppiert das Verhalten der Zelle und Single-Zell-Reaktionen auf Umwelteinflüsse sind zu produzieren. Die Anwendung dieser Methode ist einfach, aber robust, wie es schnell mit geringen Kosten Geräte im selben Labor wie der Zellkultur durchgeführt werden. Es ist auch stark Zelle empfindlich, ermöglicht eine einfache Beobachtung der resultierenden Verhalten und ist von Natur aus stabil über lange Zeiträume, die Untersuchung der langfristigen Verhalten der Zelle ermöglicht. Es ermöglicht zudem ein breites Spektrum von Experimenten durchgeführt, wie es mit vielen Zelltypen und können beliebige Muster zu erstellen. Die langfristige Stabilität der Technik ergibt sich aus der Tatsache, dass die Funktionalisierung der Oberfläche durch das Plasma vermittelt ein Teil der Oberfläche ist und nicht eine Beschichtung oder andere Schicht, die entfernt oder abgebaut werden kann. Wenn unter flüssigem gehalten wird, kann diese Art der Modifikation behält seine Zelle führen Fähigkeit für Monate.

Der wichtigste Teil des Experiments notwendig, um aussagekräftige Ergebnisse zu gewährleisten, ist die Erstellung der Master-Muster, die letztlich für die Zell-Führung genutzt werden. Wenn dieses Muster ist nicht richtig entwickelt, werden die Zellen nicht angemessen, um das Muster zu reagieren und können keine brauchbaren Verhalten. Parameter wie Linienbreite, Muster Abstand, und andere können einen großen Einfluss auf die Zelle Kompatibilität mit einem bestimmten Muster, und in der Regel eine Reihe solcher Parameter kann über die erste Photomaske Bildschirm für die am besten geeignete Design erstellt werden.

Andere wichtige Parameter in Bezug auf out Strukturierung Durchführung gehören Formenbau, die Aufrechterhaltung einer staubfreien Umgebung, Zell-Aussaat und allgemeine Sterilität der Zellkultur. Mold Schöpfung kann durch die verschiedenen Schritte, die Übertragung verpflichtet, für die wiederholte PDMS Ablegen einer Epoxy Form erlauben, sind erfolgen. Die Epoxy-Form entsteht, weil es nicht auf die gleiche Weise abgebaut wird als widerstehen Form mit kleinen, Strukturen mit großem Seitenverhältnis unter wiederholter Gießen. Wenn der Transfer Moulding korrekt erfolgt ist, werden die Abmessungen und die Ausbeute nicht betroffen, aber wenn sie falsch wie durch schlecht Entgasung, unvollständige Härtung, oder übermäßige Erwärmung getan, Blasen, Unebenheiten und Verformungen eines Musters kann auftreten, wirkt sich das Endergebnis. In Bezug auf die Aufrechterhaltung einer staubfreien Umgebung, müssen die Formen so sauber wie möglich gehalten werden, wie Staub mit den richtigen Kontakt zwischen der Arbeiterklasse PDMS Form und die Oberfläche und damit richtigen Plasma-Abschirmung und chemische Strukturierung stören können. Die Aussaat Dichte der Zellen muss auch optimiert, um sicherzustellen, dass weder zu wenige oder zu viele Zellen das Muster Gebiet bewohnen und Sterilität muss beibehalten werden, um Bakterien und andere Verunreinigungen der Zellen verwendet zu vermeiden.

Die Technik kann auch mit anderen Elementen wie Mikrofluidik, Mikroelektroden und mechanische Sonden eingebaut werden. Dies sorgt für zusätzliche Reize zu den Zellen, um besser zu replizieren verschiedenen physiologischen Bedingungen während der Experimente und die zukünftige Arbeit basiert auf der Untersuchung der Auswirkungen dieser Kombinationen konzentriert