Summary
Een veelzijdige plasma lithografie techniek is ontwikkeld om stabiel oppervlak patronen te genereren voor de begeleiding van cellulaire bevestiging. Deze techniek kan toegepast worden op mobiele netwerken, inclusief degenen die natuurlijke weefsels na te bootsen en is gebruikt voor het bestuderen van meerdere, verschillende celtypes te creëren.
Abstract
Systematische manipulatie van een cel micro-omgeving met micro-en nanoschaal resolutie is vaak nodig voor het ontcijferen van de verschillende cellulaire en moleculaire fenomenen. Om aan deze eis, hebben we een plasma lithografie techniek om de cellulaire micro-omgeving te manipuleren door het creëren van een patroon oppervlak met functie maten variërend van 100 nm tot millimeter. Het doel van deze techniek is om te kunnen studeren, op een gecontroleerde manier, het gedrag van individuele cellen als groepen van cellen en hun interacties.
Deze plasma lithografie methode is gebaseerd op de selectieve wijziging van de oppervlakte chemie op een substraat door middel van het afschermen van het contact van een lage-temperatuur plasma met een lichamelijke mal. Deze selectieve afscherming laat een chemische patroon dat celhechting en beweging kunnen begeleiden. Dit patroon, of het oppervlak sjabloon, kan vervolgens worden gebruikt om de netwerken van cellen waarvan de structuur kan nabootsen, dat in de natuur gevonden en produceert een controleerbare omgeving voor experimenteel onderzoek te creëren. De techniek is zeer geschikt voor het bestuderen van biologisch fenomeen als het produceert stabiel oppervlak patronen op transparante polymere substraten in een biocompatibele manier. Het oppervlak patronen duurt weken tot maanden en kan zo leiden interactie met de cellen voor lange perioden waarin de studie van de lange termijn cellulaire processen, zoals differentiatie en aanpassing mogelijk maakt. De wijziging van het oppervlak is vooral chemische stof in de natuur en dus doet topografische of fysieke storing niet te voeren voor de interpretatie van de resultaten. Het maakt ook niet tot een agressieve of giftige stoffen om patronen te bereiken en geschikt is voor de weefselkweek. Bovendien kan het worden toegepast op verschillende soorten van polymère substraten, die als gevolg van de mogelijkheid om hun eigendommen af te stemmen zijn ideaal voor en worden veel gebruikt in biologische toepassingen te wijzigen. De resolutie haalbaar is ook goed, als isolatie van specifieke processen, zoals migratie, adhesie, of bindend zorgt voor discrete, heldere waarnemingen aan het single multi-niveau.
Deze methode is gebruikt om diverse netwerken van de verschillende celtypen vormen voor het onderzoek met betrekking tot migratie, signalering, weefsel en de vorming van het gedrag en de interacties van neuronen aangeklaagd in een netwerk.
Protocol
1. Creatie van mallen gebruikt voor patronen
- Conceptueel ontwerp van patronen. Patronen worden gecreëerd, die dienen om netwerken te vormen cel-, controle-cel contact, cellen te isoleren, natuurlijke structuren na te bootsen, of anderszins gids celadhesie en plaatsing.
- Computer-aided design-of CAD-gebaseerde creatie van patronen en het creëren van fotomasker. Het gewenste patroon is ontworpen in CAD-software, zoals AutoCAD, en wordt vervolgens verstuurd naar een extern bedrijf voor het produceren van een fotomasker.
- Fotolithografie de knie te krijgen patroon te produceren. Glazen dia's zijn patroon met ofwel een dunne positief weerstaan of een dikke negatieve weerstand te bieden, afhankelijk van de grootte van de structuur wordt gecreëerd. Glazen dia's worden gebruikt voor hun voordelen van lage kosten, sterker dan silicium wafers en niet de productie van zo veel stof wanneer gebroken. Als alternatief kunnen andere handige structuren zoals diffractie roosters worden gebruikt als de master-patroon.
- Het patroon slide is bevestigd aan een stapel dia's die niet zijn patroon. Alle stappen worden uitgevoerd in een schone stroom kap om stof te minimaliseren.
- Creatie van meester schimmels. Een container van zilverpapier iets groter dan de stapel van dia's is gemaakt om de 30 g Polydimethylsiloxaan (PDMS), die vervolgens wordt uitgegoten over de photolithographically patroon oppervlak een eerste mal maken vast te houden. Het PDMS is ontgast en mag remedie voor een tot twee dagen.
- Eenmaal genezen van de PDMS is afgepeld van de master-patroon en vormen een mal voor de volgende stap.
- 6 g van de twee componenten epoxy (Devcon # 14310 (6 g) wordt gemengd gedurende 1 minuut en vervolgens uitgegoten in de master-mal, ontgast en toegestaan om te genezen. Ontgassen van de epoxy moet snel gebeuren (<8 min) met behulp van vele bubble breken cycli en met alleen een dun laagje voordat de epoxy sets en bel het verwijderen wordt het onmogelijk het verwijderen van de bubbels. De gebruikte 6 g geeft een dunne laag die snel bubble verwijderen vergemakkelijkt.
- Na een uur, zullen de twee componenten epoxy gedeeltelijk te genezen en nog veel meer epoxy kunnen worden toegevoegd op de top, zonder ontgassing om een dikkere structuur die is easer te verwerken in latere stappen te produceren. De epoxy is dan toegestaan om genezing voor een tot twee dagen.
- Eenmaal uitgehard, wordt de epoxy verwijderd uit de PDMS meester mal en tape is gewikkeld rond de epoxy mal om een container te vormen. Een werkende mal wordt vervolgens gemaakt door het gieten van PDMS op de epoxy mal, het ontgassen van de PDMS, en uitharden voor een tot twee dagen.
- Eenmaal uitgehard, wordt de werkende mal afgepeld van de epoxy en opgeslagen om netheid te behouden.
2. Patroonvorming van oppervlakken met mallen voor mobiele begeleiding
- Kleine delen van de arbeidersklasse schimmel zijn uitgesneden en geplaatst op een polystyreen petrischaal. De locaties van deze schimmel secties zijn gelabeld.
- Een statief is gevormd uit de kleine afdelingen en gewogen om te conformal contact tussen de werkende mal en de petrischaal oppervlak te verkrijgen. Een goede plaatsing kan worden waargenomen door te kijken naar de bodem van de schotel.
- De montage is geplaatst in het plasma kamer. Plasmabehandeling wordt gestart en voortgezet op 150 Pa bij 29,6 W (max. vermogen) gedurende 10 minuten met lucht plasma.
- Na de plasma behandeling, zijn de matrijs en het gewicht voorgeleiding verwijderd.
- De petrischaal is geplaatst onder UV-licht gedurende 10 minuten van de sterilisatie in de bioveiligheid kast en daar opgeslagen totdat gezaaid met cellen.
3. Zaaien oppervlakken met cellen
- SH-SY5Y CRL-2266 Human Neuroblastoom of andere cellen worden gekweekt met behulp van standaard protocollen voor het celtype.
- De samenloop van de SH-SY5Y CRL-2266 Menselijke cellen Neuroblastoom is visueel gemeten vóór het zaaien op het patroon oppervlak.
- Standaard cel splitsen wordt uitgevoerd om de cellen van het oppervlak van hun Petrischaal te verwijderen.
- De cellen, een keer vrij zwevend, worden gezaaid op het oppervlak van het patroon petrischaal na zijn verdund tot de gewenste samenvloeiing bereiken wanneer geplaatst op de patroon oppervlak.
- De cellen mogen vestigen en naar de oppervlakte te bevestigen.
- Het patroon petrischaal wordt gedurende enkele uren tot enkele dagen, terwijl de cellen monteren op het patroon gecreëerd door het plasma.
- Wanneer het kweken van de neuroblastoom cellen, retinoïnezuur (10 uM) wordt dagelijks toegevoegd om de cellen te induceren om te differentiëren in een neuron-achtige toestand. De toevoeging van de retinoïnezuur wordt gedaan in het donker.
- Retinoïnezuur wordt dagelijks toegevoegd voor enkele dagen, waarna de differentiatie zal worden waargenomen.
- Media is vervangen om de 3-4 dagen.
4. Observatie en analyse
- Periodieke beelden van de levende cellen of video's worden genomen om de cel gedrag te observeren in de tijd. Voor de live-beelden, zijn de cellen in een microscoop fase top incubator, die de cellen houdt bij 37 ° C, 100% vochtigheid, en 5% CO 2. Cellen kunnen ook worden gefixeerd en gekleurd voor observatie onder fluorescentie
5. Representatieve resultaten:
Een typisch resultaat van de uitvoering van de plasma-lithografie techniek is de vorming van een patroon van cellen die lijkt op sommige willekeurige of natuurlijke structuur. Dit is te zien in figuur 1a-b, waar lijnen en netwerken van neuronen zijn gemaakt. Andere celtypes gebruik kunnen worden gebruikt als te zien in figuur 1c-d, die de menselijke navelstreng endotheel cellen (HUVEC) en C2C12 skeletspiercellen de vorming van netwerken laat zien. Materialen zoals poly-L-lysine kan ook patroon, figuur 1e tot de bevestiging van bepaalde celtypes en voor andere doeleinden te vergemakkelijken. In het geval van de getoonde neuronen, wat was geschapen zijn netwerken van cellen die verbindingen tussen hen. Deze replica van wat er komt van nature in de hersenen waar de zenuwcellen hebben discrete verbindingen tussen naburige cellen die de werking van de hersenen beïnvloedt. Met de oprichting van een dergelijke structuur in het lab, kan het aantal, plaats, frequentie en andere factoren van de aansluitingen systematisch worden gecontroleerd. Het resultaat van deze arraignments kan visueel worden gemeten en extra ingangen, zoals chemische of elektrische stimulatie kan worden geïmplementeerd op het netwerk gedrag sonde.
Een negatief resultaat zou een overwoekerd of onvolledige patroon of een besmet monster. Een onvolledige of overwoekerd patroon zou het gevolg zijn van het zaaien van het substraat met ofwel te weinig of te veel cellen die het patroon zou niet voorzien van een ideale hoeveelheid cellen. Bovendien, als het patroon is niet goed ontworpen (bijvoorbeeld, lijnen te smal), de cellen niet in staat te bevestigen en succesvol te groeien. In het geval van een besmette monster, zou een goede hygiëne niet zijn gehandhaafd tijdens een van de stappen hoewel dit zeldzaam is bij het volgen van de juiste celkweek-protocol te wijten aan het feit dat de plasma-patronen ook de ondergrond steriliseert.
Figuur 1. Patterning van cellen en eiwitten.
Discussion
De cel onderzoeksmethode hier gepresenteerde kunnen maken van complexe patronen van meercellig netwerken die biologische structuren na te bootsen en biedt een methode om prikkels die zijn subcellulaire in de natuur die dan vergemakkelijkt onderzoek van zowel gegroepeerd cel gedrag en single cell reacties op omgevingsfactoren te produceren. Het gebruik van deze methode is eenvoudig maar toch robuust als het kan snel worden uitgevoerd met lage kosten apparatuur in hetzelfde lab als de cel cultuur. Het is ook sterk cel gevoelig, maakt een eenvoudige observatie van de resulterende gedrag en is van nature stabiel lange perioden, waarin onderzoek naar de lange termijn cel gedrag mogelijk maakt. Het staat bovendien voor een breed scala aan experimenten uit te voeren zoals het is compatibel met vele soorten cellen en kan creëren willekeurige patronen. De lange termijn stabiliteit van de techniek is afgeleid van het feit dat het oppervlak functionalisering bijgebracht door de plasma is een deel van het oppervlak en is geen coating of een andere laag die kan worden verwijderd of afgebroken. Indien bewaard onder vloeistof, kan dit type van wijziging behoudt zijn cel leiden mogelijkheid voor maand.
Het meest kritische deel van het experiment noodzakelijk om zinvolle resultaten te waarborgen is dat het creëren van de master-patroon die uiteindelijk gebruikt zal worden voor mobiele begeleiding. Als dit patroon niet goed is ontworpen, zal cellen niet goed reageren op de patroon en kan mogelijk niet zinvol gedrag. Parameters, zoals de lijndikte, patroon afstand, en anderen kunnen grote invloed op de cel compatibiliteit met een bepaald patroon, en meestal een reeks van dergelijke parameters kunnen worden gemaakt op het eerste fotomasker om te screenen voor het meest geschikte ontwerp.
Andere belangrijke parameters met betrekking tot het uitvoeren van patronen zijn schimmel creatie, het onderhouden van een stofvrije omgeving, cel seeding en algemene steriliteit van celkweek. Mold creatie kan worden uitgevoerd door de verschillende stappen die overschrijving worden ondernomen om te zorgen voor herhaalde PDMS afkanten een epoxy mal. De epoxy mal is gemaakt, omdat het niet zal worden afgebroken in de dezelfde manier als een mal verzetten met kleine, high aspect ratio structuren onder herhaalde gieten. Indien de overdracht spuitgieten is dit juist gebeurt, zal de afmetingen en de opbrengst niet worden aangetast maar als het verkeerd gedaan, zoals door slecht ontgassen, onvolledige genezen, of overmatige verhitting, bubbels, ruwheid en vervorming van een patroon kan optreden, die invloed op het uiteindelijke resultaat. Met betrekking tot het behoud van een stofvrije omgeving, moet de mallen worden gehouden zo schoon mogelijk als elke stof kunnen interfereren met de juiste contact tussen de werkende PDMS vorm en het oppervlak en daarmee een goede plasma afscherming en chemische patronen. Het zaaien dichtheid van de cellen ook moet worden geoptimaliseerd om ervoor te zorgen dat noch te weinig of te veel cellen van het patroon gebied bewonen en steriliteit moet worden gehandhaafd om bacteriën en andere verontreinigingen van de cellen wordt gebruikt te voorkomen.
De techniek kan ook worden geïntegreerd met andere elementen, zoals microfluidics, micro-elektroden, en mechanische sondes. Dit zorgt voor extra prikkels om de cellen om beter te kunnen verschillende fysiologische omstandigheden repliceren tijdens het experimenteren en toekomstige werkzaamheden is gericht op het bestuderen van de effecten van deze combinaties
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma Cleaner And Vacuum Chamber | Harrick Scientific Products, Inc. | PDC-001 | |
| Inverted fluorescence and phase contrast microscope | Nikon Instruments | TE2000-U | |
| Microscope stage top incubator | AmScope | Model TCS-100 | Modified to include an enclosure that supplies an appropriate atmosphere |
| Polystyrene Petri dish | VWR international | 25384-090 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy | Devcon Inc. | 2 ton clear epoxy #14310 | |
| Cell culture media | Various | Media follows standard formulations for cell type | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 |
References
- Junkin, M., Watson, J., Vande Geest, J. P., Wong, P. K. Template-Guided Self-Assembly of Colloidal Quantum Dots Using Plasma Lithography. Adv Mater. 21, 1247-1251 (2009).
- Junkin, M., Wong, P. K. Probing cell migration in confined environments by plasma lithography. Biomaterials. 32, 1848-1855 (2011).
- Keyes, J., Junkin, M., Cappello, J., Wu, X., Wong, P. K.
- Langowski, B. A., Uhrich, K. E.
- Tourovskaia, A., Barber, T., Wickes, B. T., Hirdes, D., Grin, B., Castner, D. G. Micropatterns of Chemisorbed Cell Adhesion-Repellent Films Using Oxygen Plasma Etching and Elastomeric Masks. Langmuir. 19, 4754-4764 (2003).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276, 1425-1428 (1997).
- Johansson, B. -L., Larsson, A., Ocklind, A., Ohrlund, A. Characterization of Air Plasma-Treated Polymer Surfaces by ESCA and Contact Angle Measurements for Optimization of Surface Stability and Cell Growth. Journal of Applied Polymer Science. 86, 26185-26185 (2002).
- Murakami, T., Kuroda, S. -i, Osawa, Z. Dynamics of Polymeric Solid Surfaces Treated with Oxygen Plasma: Effect of Aging Media after Plasma Treatment. Journal of Colloid and Interface Science. 202, 37-44 (1998).
- Strobel, M., Lyons, C. S., Mittal, K. L. Plasma surface modification of polymers: Relevance to adhesion. , VSP. Utrecht, Netherlands. (1994).
- Xia, Y., Whitesides, G. M.
- Song, M., Uhrich, K. R. Optimal Micropattern Dimensions Enhance Neurite Outgrowth Rates, Lengths, and Orientations. Annals of Biomedical Engineering. 35, 1812-1820 (2007).
- Zhao, F., Wu, T., Lau, A., Jiang, T., Huang, Z., Wang, X. -J. Nrf2 promotes neuronal cell differentiation. Free Radical Biology and Medicine. 47, 867-879 (2009).
- Ohl, A., Schroder, K. Plasma-induced chemical micropatterning for cell culturing applications: a brief review. Surface and Coatings Technology. 116-119, 820-830 (1999).
- van Kooten, T. G., Spijker, H. T., Busscher, H. J. Plasma-treated polystyrene surfaces: model surfaces for studying cell-biomaterial interactions. Biomaterials. 25, 1735-1747 (2004).
- Loesberg, W. A., te Riet, J., van Delft, F., Schön, P., Figdor, C. G., Speller, S. The threshold at which substrate nanogroove dimensions may influence fibroblast alignment and adhesion. Biomaterials. 28, 3944-3951 (2007).
