Surface פלזמה ליתוגרפיה דפוסים של יצירת רשתות Cell

Summary

טכניקה צדדי ליתוגרפיה פלזמה פותחה כדי ליצור דפוסים משטח יציב להדרכת מצורף הסלולר. טכניקה זו יכולה להיות מיושם כדי ליצור רשתות התא כולל אלה המחקות רקמות טבעיות שימש לחקר מספר סוגי תאים שונים.

Abstract

מניפולציה שיטתית של microenvironment תא עם רזולוציה מיקרו ו ננו נדרש לעתים קרובות לפענוח תופעות תאית ומולקולרית שונים. כדי לענות על דרישה זו, פיתחנו ליתוגרפיה פלזמה טכניקה כדי לתפעל את microenvironment הסלולר על ידי יצירת משטח עם הדפס גדלים תכונה החל מ 100 ננומטר ל מילימטרים. מטרת טכניקה זו היא להיות מסוגלים ללמוד, בצורה מבוקרת, התנהגויות של תאים בודדים, כמו גם קבוצות של תאים ואת האינטראקציות ביניהם.

שיטה זו ליתוגרפיה פלזמה מבוסס על שינוי סלקטיבית של כימיה את פני השטח על מצע באמצעות מיגון הקשר של פלסמה בטמפרטורה נמוכה עם עובש פיזי. זה מיגון סלקטיבי עלים דפוס כימיים אשר יכול להנחות מצורף תא ותנועה. דפוס זה, או תבנית פני השטח, לאחר מכן ניתן להשתמש כדי ליצור רשתות של תאים, אשר יכולים לחקות את המבנה בטבע ומייצרת סביבה לשליטה לחקירות ניסיוני. הטכניקה היא גם מתאים ללימוד תופעה ביולוגית כפי שהוא מייצר דפוסי משטח יציב על מצעים פולימריים שקוף בצורה ביולוגית. דפוסי משטח להימשך שבועות עד חודשים ולכן יכול להנחות אינטראקציה עם תאים לפרקי זמן המאפשר לימוד של תהליכים ארוכי טווח הסלולר, כגון בידול adaption. שינוי על פני השטח הוא כימיים בעיקר בטבע, ולכן לא מציגים הפרעה טופוגרפית או פיזית על הפרשנות של התוצאות. הוא גם אינו דורש שימוש בחומרים קשים או רעילים להשיג דפוסים והוא תואם עבור בתרבית רקמה. יתר על כן, ניתן ליישם לשנות סוגים שונים של מצעים פולימריים, אשר בשל היכולת לכוון את הנכסים שלהם הם אידיאליים עבור נמצאים בשימוש נרחב ביישומים ביולוגיים. ההחלטה השגה הוא גם מועיל, כמו בידוד של תהליכים ספציפיים, כגון הגירה, הדבקה, קשירה או מאפשרת, תצפיות נפרדות ברור לכל אחד לרמה multicell.

שיטה זו כבר מועסק כדי ליצור רשתות רחב של סוגי תאים שונים לחקירות מעורבים הגירה, איתות, היווצרות רקמה, ואת התנהגות ואינטראקציות של נוירונים לדין ברשת.

Protocol

1. יצירת תבניות בשימוש דפוסים

1. עיצוב קונספטואלי של דפוסי. דפוסי נוצרות המשמשים ליצירת רשתות התא, תא קשר שליטה, לבודד תאים, לחקות מבנים טבעי, או בכל דרך אחרת מדריך הידבקות התא והשמה.
2. בעזרת מחשב או יצירת עיצוב CAD המבוססת על דפוס ויצירת photomask. התבנית הרצויה מעוצב תוכנות CAD, כגון AutoCAD, ו לאחר מכן נשלחת חברה חיצונית לייצור photomask.
3. Photolithography לייצר דפוס מאסטר. שקופיות הזכוכית הם בדוגמת עם או חיובי דק להתנגד או שלילי עבה להתנגד תלוי בגודל המבנה נוצר. שקופיות הזכוכית משמשים היתרונות שלהם להיות בעלות נמוכה, חזקה יותר פרוסות סיליקון לייצור אבק ולא פחות כאשר שבור. לחלופין, מבנים נוח אחרים כגון gratings עקיפה יכול לשמש תבנית האב.
4. השקופית בדוגמת מחובר ערימה של שקופיות אשר לא היו בדוגמת. כל הצעדים נעשים בתוך ברדס תזרים נקי כדי למזער את האבק.
5. יצירת תבניות מאסטר. מיכל של נייר כסף מעט גדול יותר ערימה של שקופיות נוצר להחזיק 30 גרם של polydimethylsiloxane (PDMS) הנשפך אז על פני השטח בדוגמת photolithographically ליצור עובש הראשונית. PDMS היא degassed ואיפשר לרפא עבור 1-2 ימים.
6. נרפא לאחר PDMS הוא קילף של דפוס מאסטר ויוצר עובש לשלב הבא.
7. 6 גרם של אפוקסי חלק 2 (devcon # 14310 (6 גרם) מעורבב דקה 1 ולאחר מכן שפכו לתוך תבנית האב, degassed ואיפשר לרפא. Degassing אפוקסי חייב להיעשות מהר (<8 דקות) באמצעות בועות רבות שבירת מחזורי ושימוש רק שכבה דקה לפני שהוא קובע אפוקסי הסרת בועה בלתי אפשרי להוציא את בועות. ז 6 השתמשו מייצרת שכבה דקה המאפשרת הסרה מהירה בועה.
8. לאחר שעה, אפוקסי 2 חלק יירפאו באופן חלקי אפוקסי יותר ניתן להוסיף על גבי ללא degassing לייצר מבנה עבה אשר easer לטפל בצעדים מאוחר יותר. אפוקסי מותר אז תרופה 1-2 ימים.
9. נרפא פעם, אפוקסי נמחקת עובש האב PDMS קלטת כרוך סביב העובש אפוקסי להקים מיכל. עובש עובד אז נוצר על ידי שפיכת PDMS על התבנית אפוקסי, degassing PDMS, וריפוי במשך 1-2 ימים.
10. נרפא פעם, עובש העבודה הוא קילף של אפוקסי ומאוחסנים לשמור על הניקיון.

2. דפוסים של משטחים עם תבניות להדרכה תא

1. חלקים קטנים של עובש העבודה נחתכות החוצה והניח על צלחת פטרי קלקר. המיקומים של סעיפים אלה עובש מסומנים.
2. חצובה נוצר מתוך בסעיפים קטנים משוקלל כדי להבטיח קשר בין עובש קונפורמי העבודה ואת משטח צלחת פטרי. מיקום טוב ניתן לראות על ידי התבוננות בחלק התחתון של המנה.
3. הרכבה ממוקם לתא פלזמה. טיפול פלזמה היא יזמה והמשיך בבית אבא 150 ב 29.6 W (מקסימום כוח) במשך 10 דקות באמצעות אוויר פלזמה.
4. לאחר הטיפול פלזמה, עובש לבין הגשת כתב האישום משקל יוסרו.
5. צלחת פטרי היא תחת אור UV למשך 10 דקות של עיקור בתוך ארון biosafety ומאוחסנים שם עד seeded עם תאים.

3. מתזמן משטחים עם תאים

1. תאים SH-SY5Y CRL-2266 Neuroblastoma אדם או אחרים תרבותי באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים עבור סוג תא.
2. מפגש של SH-SY5Y CRL-2266 תאים Neuroblastoma האדם נמדד חזותית לפני זריעה על פני השטח בדוגמת.
3. פיצול תא רגיל מתבצעת כדי להסיר את התאים מפני השטח של צלחת פטרי שלהם.
4. התאים, צף ללא תשלום פעם אחת, הם זורעים על פני השטח של צלחת פטרי בדוגמת לאחר דילול כדי להשיג את המפגש הרצוי כאשר הוא ממוקם על פני השטח בדוגמת.
5. התאים מותר להתיישב ולצרף אל פני השטח.
6. צלחת פטרי היא בדוגמת מודגרות למשך מספר שעות עד מספר ימים תוך התאים להרכיב על גבי התבנית נוצרה על ידי הפלזמה.
7. כאשר נוירובלסטומה culturing התאים, החומצה הרטינואית (10 מיקרומטר) מתווסף מדי יום על מנת לגרום לתאים להתמיין המדינה נוירון דמוי. תוספת של חומצה רטינואית נעשית בחושך.
8. החומצה הרטינואית מתווסף מדי יום במשך כמה ימים, שלאחריו הבידול יהיה הנצפה.
9. מדיה מוחלף מדי 3-4 ימים.

4. תצפית וניתוח

1. תמונות תקופתיים של תאים חיים או קטעי וידאו נלקחים על מנת לבחון את התנהגות התא לאורך זמן. לקבלת תמונות לחיות, התאים ממוקמים שלב מיקרוסקופ חממה העליון אשר שומר את התאים ב 37 ° C, לחות 100%, 5% CO _2. תאים יכולים גם להיות קבועים מוכתם להסתכלות תחת פלואורסצנטי

5. נציג תוצאות:

תוצאה אופיינית של יישום טכניקה ליתוגרפיה פלזמה היא היווצרות דפוס של תאים הדומה קצת מבנה שרירותי או טבעי. הדבר בא לידי ביטוי איור 1a-b שם שורות רשתות של נוירונים נוצרו. סוגי תאים אחרים יכולים לשמש היטב כפי שניתן לראות באיור 1c-d, המציג אדם וריד הטבור לתאי אנדותל (HUVEC) ו C2C12 לתאי שריר השלד ויוצרים רשתות. חומרים כגון פולי-L-ליזין יכול להיות גם בדוגמת, איור 1e כדי להקל על ההתקשרות של סוגי תאים מסוימים לשימושים אחרים. במקרה של הנוירונים הראו, מה נוצר הן רשתות של תאים שבהם יש קשרים ביניהם. זה משכפל מה מתרחש באופן טבעי במוח שבו נוירונים יש קשרים דיסקרטית בין תאים שכנים, אשר משפיע על פעולת המוח. עם הקמת מבנה כזה במעבדה, מספר, מיקום, תדירות וגורמים אחרים של קשרים ניתן לשלוט באופן שיטתי. התוצאה של הקראות אלו ניתן למדוד חזותית תשומות נוספות כגון כימיים או גירוי חשמלי יכול להיות מיושם כדי לחקור את התנהגות הרשת.

תוצאה שלילית יהיה דפוס מגודל או חלקי או מדגם מזוהמים. דפוס שלם או מגודל היה תוצאה של זריעת את המצע עם תאים או מעט מדי או יותר מדי שלא תספק את התבנית עם כמות אידיאלי של תאים. בנוסף, אם הדפוס לא נועד נכונה (למשל, קווים צרים מדי) התאים לא יוכלו לצרף ולגדול בהצלחה על זה. במקרה של מדגם מזוהמים, ניקיון נאותה לא היה נשמר במהלך אחד השלבים אם כי זה נדיר כאשר הבאים לתא הנכון תרבות פרוטוקול בשל העובדה כי דפוסים פלזמה גם sterilizes את המצע.

באיור 1. דפוסים של תאים וחלבונים.

Discussion

החקירה תא השיטה המוצגת כאן מאפשרת יצירת תבניות מורכבות של רשתות תאיים אשר לחקות מבנים ביולוגיים כמו גם מספק שיטה לייצר גירויים שאינם subcellular בטבע אשר לאחר מכן מאפשר חקירה של התנהגות שני תאים מקובצים ותגובות תא יחיד לגורמים סביבתיים. השימוש בשיטה זו הוא פשוט עדיין חזקים כפי שהוא יכול להתבצע במהירות במעבדה כמו התרבות תאים עם ציוד בעלות נמוכה. הוא גם מאוד רגיש התא, מאפשר התבוננות קלה של התנהגות כתוצאה והוא מטבעו יציב למשך תקופות זמן ארוכות, המאפשרת חקירה של התנהגות התא ארוך טווח. בנוסף הוא מאפשר מגוון רחב של ניסויים להתבצע כפי שהוא תואם סוגי תאים רבים יכולים ליצור דפוסי שרירותי. יציבות לטווח ארוך של הטכניקה נובעת מהעובדה functionalization משטח הנחילה ידי הפלזמה הוא חלק השטח אינו ציפוי או שכבת אחרים אשר ניתן להסירו או מושפל. אם כל הזמן תחת נוזל, זה סוג של שינוי יכולים לשמור על היכולת תא המנחה שלה במשך חודשים.

החלק הקריטי ביותר של הניסוי הדרושים כדי להבטיח תוצאות משמעותיות היא יצירת דפוס מאסטר אשר תביא בסופו של דבר לשמש הדרכה התא. אם דפוס זה אינו מתוכנן כראוי, התאים לא מגיבים כראוי לדפוס ולא יכול לייצר התנהגות שימושי. פרמטרים כגון רוחב קו, ריווח דפוס, ואחרים יכול מאוד להשפיע על תאימות תא עם דפוס מסוים, בדרך כלל מגוון רחב של פרמטרים כגון ניתן ליצור photomask הראשונית למסך על העיצוב המתאים ביותר.

פרמטרים חשובים אחרים הקשורים בביצוע דפוסים כוללים יצירת עובש, שמירה על הסביבה אבק חינם, זריעת תאים עקרות הכללי של תרבית תאים. יצירת עובש עשוי להתבצע על ידי העברת צעדים שונים אשר נעשים על מנת לאפשר חזרה PDMS את הליהוק עובש אפוקסי. עובש אפוקסי נוצר כי זה לא יהיה לבזות באותו אופן כמו להתנגד עובש עם קטן, יחס גבוה מבנים ההיבט תחת הליהוק חוזרות ונשנות. אם דפוס ההעברה נעשית בצורה נכונה, הממדים ואת התשואה לא יושפעו אבל אם נעשה בצורה לא נכונה על ידי ריפוי, degassing גרוע שלם, או חימום יתר כגון, בועות, חיספוס דפורמציה של דפוס יכול להתרחש אשר משפיע על התוצאה הסופית. ביחס לשמירה על סביבת אבק חינם, תבניות חייב להישמר נקי ככל האפשר אבק כל יכול להפריע הקשר הנכון בין עובש העבודה PDMS לבין השטח הנכון ובכך פלזמה מיגון דפוסים כימיים. צפיפות זריעה של התאים גם חייב להיות מותאם על מנת להבטיח כי לא התאים מעט מדי או יותר מדי מאכלסים את השטח דפוס ועקרות חייבת להישמר כדי למנוע זיהום חיידקי אחרים של תאים בשימוש.

הטכניקה יכולה גם להיות משולב עם יסודות אחרים כגון מיקרופלואידיקה, microelectrodes, ואת בדיקות מכניות. זה מספק גירויים נוספים על התאים כדי לשכפל טוב יותר בתנאים פיסיולוגיים שונים במהלך ניסויים ולעבוד בעתיד הוא התמקד בחקר ההשפעות של שילובים אלה