Summary
절연 mesenteric의 동맥에 힘 측정을위한 자동 myography 방법이 설명되어 있습니다. 그것은 phenylephrine 및 세포외 칼슘에 대한 답변을 결정하기 위해 510A Mulvany - Halpern 자동 듀얼 와이어 Myograph을 사용합니다. 300 μm의, 독립적으로 - 방법은 60 직경의 작은 선박에 agonists에 사시 응답 일관성있는 결정 수 있습니다.
Abstract
같은 mesenteric 동맥으로 근위 저항 선박, 주변 저항에 크게 기여하고 있습니다. 주로 신체의 전반적인 요구 사항에 따라 여러 기관에 혈액 흐름을 감독의 직경 기능에 100-400 μm의 사이의 이러한 작은 선박. 쥐 mesenteric 동맥은 100 μm의보다 큰 직경있다. 첫째 Mulvay 및 Halpern 1 설명한 myography 기술은, Bevan 및 Osher이 제안한 방법을 기반으로했다. 기술은 근육 준비 상당한 단축을 방지합니다 사시 조건에 따라 소형 선박에 대한 정보를 제공합니다. 다른 agonists에 선박의 강제 생산과 감도가 활성 긴장 길이 관계에 의하면, 스트레치의 정도에 따라 있기 때문에, 그것은 장착 전선의 준수를 방지하기 위해 사시 조건 하에서 수축 연구를 수행하는 것이 필수적입니다. 스테인레스 스틸 와이어 때문에 기록된 응답 3 영향을 후자의 산화의 텅스텐 와이어로 선호하고 있습니다. 기법은 혈관 평활근 세포 수용체의 정상적인 기능에 대한 증거를 얻기 위해 탑재된 혈관 작용제 유도된 수축의 비교를위한 수 있습니다.
우리는 phenylyephrine와 계약 격리 mesenteric 동맥은 세포외 칼슘의 누적 농도 (CA 2 + E)를 추가시 휴식 여러 연구에 표시합니다. 결과는 우리가 G 단백질 결합 칼슘 2 + 감지 수용체 (자동차)를 표현하는 것을 perivascular 감각 신경을 빠졌다는 생각이 들어서,이 vasorelaxation 응답을 중재. 자동 와이어 myography 방법을 사용하여, 우리는 Wistar, 달 소금에 민감한 (DS)와 달 소금 방지 (DR)에서 mesenteric 동맥이 쥐이 칼슘 2 + 전자에 다르게 반응 여기에 표시됩니다. Wistar의 쥐에서 조직은 + - 감도 DR 및 DS에서 이들에 비해 높은 칼슘이 보여주었다. DS 쥐에서 mesenteric 동맥의 감소 자동차 표현이 감소 칼슘이 절연, 사전 계약 동맥 + 전자 유도 휴식과 연결합니다. 데이터는, 자동차가 증가 아드레날린 톤 미만 mesenteric 동맥의 이완을 위해 필요하다고 제안하는 등 고혈압의 발생, 그리고 훨씬 더 심각한 DS에 달 동물의 자동차 신호 경로에 내재된 결함을 나타냅니다.
방법 mesenteric 저항 동맥과 다른 agonists 및 / 또는 antagonists 사이에 유사한 작은 혈관과 비교의 혈관 반응의 전의 생체내을 결정하는 데 유용 것은 나란히 6,7,8을 평가 쉽고 지속적으로 수 있습니다.
Protocol
1. 쥐 mesenteric 작은 동맥의 분리
- 닫힌 실내에서 isoflurane과 동물을 마취하고 알코올로 복부를 닦아냅니다.
- mesenteric 침대를 폭로하기 위해 중간 라인 개복술을 수행합니다.
- 가위를 사용하여 뛰어난 mesenteric 동맥과 vasculature 먹이와 소장의 약 85 cm를 제거합니다. 가까운 pylorus에 창자 섹션 ileo - coecal 교차점 근처 말초 엔드의 근위 끝을 잘라. 대장의 세그먼트 오픈 흉부 심장 관통하여 isoflurane과 euthanized와 깊이 anesthetized 아르 쥐에서 격리됩니다.
- PSS를 포함하는 코팅 배양 접시에있는 excised 섹션을 배치하고 실온에서 mesenteric 동맥의 해부를 수행하십시오.
- 오른쪽에있는 소장의 근위 끝을 아래로 핀과 intestineina 시계 반대 방향으로 방향의 나머지 부분 (대장의 반대편 왼쪽 먹이 vasculature에 ieproximal 끝)을 핀.
- 근위 세그먼트의 일부와 함께 지점 II 및 III 세그먼트를 해부하다.
- 정맥을 절개하다하고 동맥을 분리 (V - 모양의 분기점)와 지방과 결합 조직을 제거하여 청소. 포셉로 부드럽게 당기 및 결합 조직의 세포막을 통해 절단하여 동맥과 직접 접촉을 피하십시오.
2. 용기의 장착
- 좋은 포셉와 40 μm의 텅스텐 무료 스테인레스 스틸 와이어의 두 짧은 세그먼트 (≈ 4cm) 절단하고, 내피를 손상하지 않도록 돌보는 각 동맥의 루멘에 하나를 넣습니다. 필요한 경우 루멘를 엽니다 와이어 끝부분을 사용합니다. 선박 밖으로 스트리밍 혈액 좋은 징조 루멘 열입니다.
- 115 NaCl, 4.7 KCl, 1.4 MgSO 4 0.7 H 2 O 5, NaHCO 3, 1.2 K 2 HPO 4, 1.1 나 2 HPO 4, 1.0 CaCl 2, 20 HEPES과 : MM, 생리 식염수 (PSS로 myograph 챔버를 입력합니다 37 아스코르비 산 (100 μm의) 5 포도당, 산도 7.4) ° C와 집게를 사용하는 것은 신중하게 상온에서 챔버에 페트리 접시에서 스레드 선박 세그먼트를 전송하고 myograph 챔버에 excised 근위 선박 세그먼트를 전송하고 당겨 선박에 식량을 공급하는 전선을 따라 끝. 배 스트레칭하지 마십시오.
- 와이어 마이크로 미터에 연결된 오른쪽 턱에 가까운 고정 나사에 따라 시계 반대 방향의 거의 끝부분을 고정합니다. 포셉와 와이어의 끝에 자유를 잡으하고 오른쪽 턱에까지 고정 나사에 따라 시계 방향으로 안전. 와이어 따라 선박 세그먼트는 턱 자체와의 접촉을하지 않고 문턱 사이의 간격에 위치하고 있는지 확인하십시오.
- 분리 턱을 나사, 그리고 선박과 함께 두 번째 와이어 병렬 정렬과 루멘의 맨 끝에 삽입. 부드럽게 가이드로 이미 탑재 와이어를 사용하여 한 동작에서 선박 세그먼트의 루멘을 통해 전선을 공급. 책략 동안 그것을 스트레칭 피하기 위해 선박에서 1cm에 대한 전선을 보유하고, 내피를 감동하지 마십시오.
- 함께 턱을 비할 첫 번째 아래에 두 번째 설치 와이어 이동은 오른쪽 턱에 안전하게 있는지 확인합니다.
- 변환기에 연결된 왼쪽 턱의 근처에 고정 나사 아래 시계 방향으로 두 번째 와이어의 거의 끝부분을 고정합니다.
- 왼쪽 턱에있는 고정 나사에서 와이어의 맨 끝부분을 확보하고 전선을 스트레칭 조입니다.
- 일단 설치가 완료되면 "마운트 메뉴"의 모터를 재설정하고 선박의 정상화를 시작합니다.
3. 표준화
자동 듀얼 와이어 Myograph 시스템 - 510A는 "정규화"메뉴에서 부과하는 자동 정규화 기능을 보유하고 선박은 30 분 평균 이후 제조 업체의 프로토콜에 따라 표준화된 절차에 의해 표준화된 내부 둘레에 늘어 수 있습니다 37 ° C. 지수 곡선은 다음 내부 둘레 압력 데이터에 장착되어 있습니다. 절차는 동맥 100 mmHg 1 transmural 압력 하에서 편안 때 생체내에 있었고이 것이 루멘 직경 (D 100) 정의의 쥐 mesenteric 동맥에 대한 정규화 매개 변수는 다음과 같습니다.
- 대상 transmural 압력 = 13.3 kPa (100mm HG).
- 시간 = 60 초, 정상화 단계의 각각의 기간.
- IC 1 / IC 100 = 0.9 (IC 1 = 표준 내부 둘레, IC 100 대상 압력에 대응 = 내부 둘레.
- 접안 렌즈 교정 2 * Δ (mm / 안구 부문), 2 델타 프로그래밍 이유입니다.
hairlines가 탑재된 선박 segm의 맨 근처에 종료 끝나면 현미경 눈 피스 신호를 사용하여 마운트된 mesenteric 동맥의 길이를 측정엔트. 간단히, 탑재 선박 세그먼트의 길이는 해부 현미경에서 보정 안구 시선을 조각으로 최대 배율로 측정됩니다. 세그먼트의 끝에서 (1) 이상의 헤어 라인과 눈 피스 읽기 및 안구 부문에서 세그먼트의 끝 근처가 (2) 측정 및 기록됩니다. 이 값은, 마이크로 미터 수치로, 이전과 혈관을 스트레칭 후이 기록되며 장착되어 곡선과 100mm HG의 대상 transmural 압력에 해당하는 내부 직경을 계산하는 프로그램의 메뉴에 입력된
우리의 연구에서 동맥은 D 1 루멘 직경으로 설정되었습니다 = 0.9 활성 강제로 개발이 최대한입니다 XD 100. 쥐 mesenteric의 동맥에 ≥ 10 MN의 활성 강제로 개발은 진행하는 실험 최적 간주됩니다. 낮은 활성 강제로 조직이 삭제되었습니다.
4. 응답 측정
정규화 후 혈관의 기계적 및 기능적 특성 재현할 수축을 얻는 5 μm의의 phenylephrine (PE)의 반복 응용 프로그램 (일반적으로 2 또는 3)에 도전 혈관을 포함하는 "표준 시작"을 수행하여 다시 활성화됩니다. 저희 연구실에 전형적인 "표준 시작"다음과 같이 stimulations과 실패야 기간의 시리즈로 구성되어 있습니다 :
- myograph 챔버는 95 %의 공기와 5% CO 2 표지 및 폭기를 시작 바꿉니다.
- 신선한 PSS (100 μm의 제품 아스코르비 산을 포함하는)와 챔버를 채우기
- 계약 5 분 5 μm의 PE와 혈관과 PSS 버퍼와 4 번 씻는다.
- 후 마지막으로 세척, PSS와 리필 챔버 및 단계 (2)를 반복하기 전에 3 분 기다려 그리고 (iii).
표준 시작 후 동맥은 실험을 위해 준비가되었습니다. 계약 선박의 Relaxations는 CaCl 2의 농도 증가 (- 4 MM 0.5)의 누적 또한에 의해 평가됩니다. 억제제를 사용하는 선박은 assays시 20 분 및 현재에 대한 myograph 챔버에있는 화합물 사전 incubated입니다.
5. 데이터 분석
선박과 힘 tracings 직접 텍스트 데이터로 변환에 대한 "정규화"데이터는 SigmaPlot 11.0 그래프 프로그램 (Systat 소프트웨어, 포인트 리치몬드, CA)로 분석하여 그림 1에 표시된 꾸몄다되었습니다. tracings부터 계산 농도 - 반응 데이터, 프로그램의 약리학 메뉴에서 4 매개 변수 물류 기능에 장착되어 실험 데이터 EC 50 값을 결정하여 분석했다. 그룹 사이에 그룹 내의 비교는 편도 분산 분석 (ANOVA) 및 P <0.05 중요한 것으로 간주됩니다과 차이에 의해 수행되었다.
6. 대표 결과 :
| 매개 변수 | Wistar | 달 소금 민감한 | 달 소금 방지 |
|---|---|---|---|
| L 100 (μm의) | 83.26 ± 2.33 | 91.52 ± 4.67 | 117.45 ± 8.43 * |
| X 1 | 604.21 ± 41.97 | 752.24 ± 85.25 | 745.84 ± 110.09 |
| R 2 | 0.99 ± 0.003 | 0.97 ± 0.008 | 0.97 ± 0.007 |
* Wistar과 DR을위한 L 100 값 차이는 통계적으로 의미입니다. 샤피 - Wilk의 정상 테스트 (P = 0.588에게) 전달, 균등 분산 테스트 (P = 0.237가) 전달.
L 100 대상 transmural 압력에 해당하는 마운트 세그먼트의 = 내부 직경.
X 1 = 자사의 정규화된 내부 둘레 (실험이 수행되었다되는 마이크로 미터 읽기 즉, 값)에 탑재된 선박을 스트레칭하는 데 필요한 마이크로 포지셔너 설정.
R이 지수 곡선에의 적합 = 회귀 계수 (X I, Y I).
주의 사항 : 자세한 절차는 510A Myograph 시스템 6 매뉴얼에 설명되어 있습니다.
표 1. 샘플 읽기 아웃 "정규화 메뉴"에 표시되는 기본 프로그램에서 Wistar, DS와 DR의 mesenteric 동맥 세그먼트에 대한 정규화 매개 변수. 값 5 동물의 (± SEM)를 의미하고 있습니다. Wistar과 DS에 대한 L 100 값 사이의 차이는 * (P는 <0.05) 통계적으로 의미입니다.
| Wistar | DS | DR |
|---|---|---|
| 14.2 ± 0.6 | | 20.9 ± 1.3 * | |
각 선박 5 μm의 PE의 응용 프로그램을 다음과 Wistar, DS 및 DR의 쥐으로부터 격리 mesenteric 동맥에서 표 2. 개발 긴장 (MN). 보고된 값은 6-8 동물의 (± SEM)를 의미하고 있습니다. Wistar 컨트롤에서 * 중요한 것은 다른 (P는 <0.05).
그림 1. 칼슘 2 Wistar 쥐에서 PE - 계약 mesenteric 동맥의 + 전자 유도 휴식 1 ㎜ 칼슘 2 +를 포함하는 생리 식염수에 와이어 myograph에 마운트. 동맥, 37 30 분 equilibrated되었습니다 ° C 일정한 통기 및 CA 2 반응과 + E 결정. PE는 칼슘 2 누적 첨가 다음 5 μm의의 추가에 대한 추적 대표위원회는 + 표시됩니다.
그림 2. 칼슘 2 DS의 쥐에서 PE - 계약 mesenteric 동맥의 + 전자 유도 휴식 1 ㎜ 칼슘 2 +를 포함하는 생리 식염수에 와이어 myograph에 마운트. 동맥, 37 30 분 equilibrated되었습니다 ° C 일정한 통기 및 CA 2 반응과 + E 결정. PE는 칼슘 2 누적 첨가 다음 5 μm의의 추가에 대한 추적 대표위원회는 + 표시됩니다. CA 2 + 휴식이 심각 Wistar과 DR 쥐에서 그에 비해이 조직에 손상되었습니다.
그림 3. 칼슘 2 DR의 쥐에서 PE - 계약 mesenteric 동맥의 + 전자 유도 휴식 1 ㎜ 칼슘 2 +를 포함하는 생리 식염수에 와이어 myograph에 마운트. 동맥, 37 30 분 equilibrated되었습니다 ° C 일정한 통기 및 CA 2 반응과 + PE가 카 2 누적 첨가 다음 5 μm의의 추가에 대한 추적 전자 determined.A 대표 힘을 +가 표시됩니다.
그림 4. A. [칼슘 2 +] E - 반응 곡선. DR 및 DS 쥐으로부터 격리 mesenteric 오락실에서는 4 매개 변수 물류 curve.C.CaR 표현에 데이터를 피팅에 의해 결정 휴식 EC 50 값을 보여주는 B. 바 차트.
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Discussion
고혈압, 심혈관 및 신장 뇌성 병적 상태 / 사망률의 주요 원인이다. 고혈압의 발생은 인구의 높은 소금에 민감한 고혈압은 고령화에 특히 높은, 그리고 백인보다 흑인에서 더 유행이다. 이것은 자신의 신장 9 나트륨을 유지하는 흑인의 경향에 의한 것으로 생각됩니다. 소금 감도는 신장 질환의 주요 기여 요인이며 내피 기능 장애와 관련된 있지만 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 저희 연구실의 최근 연구는 높은 소금 다이어트는 칼슘 2 + 농도 ([칼슘 2 +] IF) 중간 액을 감소하고, 소금에 민감한 쥐 10,11에서 수축기 혈압을 증가하는 것으로 나타났습있다. 이러한 효과는 새로운 치료법의 개발을위한 목표를 제공할 수 mesenteric 동맥과 소금에 민감한 신경성 환자의 자동차 수준에서 유사한 감소를 kidneys.Finding의 자동차의 감소 표현으로 표시될 수 있습니다. 우리는 차가 vasculature에서 신호의 메커니즘을 이해하기 위해 칼슘 2 + E를 혈관 반응을 연구하기 위해 고혈압의 동물 모델 번호에서 고립 mesenteric 동맥으로 자동 와이어 myography을 사용하고 있습니다.
[칼슘 2 +] 전자 좁은 범위 (1.1-1.4 ㎜) 이내에 유지되며 인체 12, 따라서 자동차 [+ 칼슘 2] 전자 가능할 수용체 활성화를 위해 작은 변화를 감지할 수 있어야합니다. 사실, 자동차 칼슘 2 + E 13, 및 작은 증가 작은 변화를 감지하기 위해 표시되었습니다 [칼슘 2 +] 생리 범위 14 이내에있다면. 측정 현장 microdialysis 연구에서 [칼슘 2 +] 경우에 주변 저항과 혈압 (BP)의 규정에 필수적인 십이지장 submucosa 및 신장 피질, 두 조직은 창자 루멘 [칼슘 2 +]의 함수로 동적 변화를 보여주었다. 증가 창자 [칼슘 2 +] 0에서 6 mm까지, 증가 [칼슘 2 +] 1.1에서 1.9 perivascular 신경 자동차 16 활성화 관찰의 범위에있는 MM 4,5,15,하고 격리 mesenteric 휴식을 취하면 동맥 17. 우리는 또한 자동차의 감소를 감지하는 것으로 나타났습니다 [칼슘 2 +] E와 차례로 neocortical 터미널 18 릴리스 확률에 미치는 영향을 attenuates 비 선택적 양이온 채널의 활성화를 통해 행동 가능성이 기간을 향상시킬 수 있습니다. 이것은 자동차 칼슘 2 + E에 대한 응답으로 뇌 흥분을 변경하는 사전 시냅스 피드백을 제공하는 것이 좋습니다. 또한 PvN 자동차의 desensitization이 수용체의 규정에 대한 이해가 정상과 신경성 조건 모두에 따른 역할을 명확히 것을 제안, 반복, 장시간 자극 16과 함께 발생합니다. Bukoski와 동료는 보여주 거기에 작은 변화 [칼슘 2 +] 자동차를 활성화하고 정상적인 조건 3,4.19, 아래 vasodilator 합성에 기여하는 정도있다면. 이러한 관찰을 바탕으로, 우리는 고혈압을 볼 있으므로 혈압을 제어하는 악용될 수로 반응도 증가 혈관 톤의 조건 하에서 발생하는 것으로 가정. 자동차 활성화의 연구 방법과 신호 중간체의 인산화이 리드는가, 그러므로, 정상 및 신경성 생리학에서의 역할을 조사하기 위해 필요합니다. 차가 G 단백질 결합 수용체 (GPCR)이며, 일반적인 치료 목표를 다른 GPCRs와 유사한 구조를 통해 규제이다. 따라서, 혈관에서의 규제의 메커니즘을 이해하는 것은 안티 - 고혈압성 치료 대상으로서의 가능성을 결정하기 위해 유용한 데이터를 제공합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
설명이 프로젝트는 보너스 번호 R01 HL064761, R25 HL059868, 1SC1 HL099139과 건강의 P20 MD000175 형태 국립 연구소에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auto Dual Wire Myograph System-510ADMT-USA, Inc. | Atlanta, GA. | 100151 | |
| PowerLab/4SP Data Acquisition System |  ADInstruments |
ML750 | New models with 4-16 input channels are available. |
| Dell Dimension XPS Gen 4 Computer | Dell | ||
| Stemi SV II (Apo) Dissection Microscope with Ocular | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Wistar, Dahl salt-sensitive, Dahl salt-resistant rats | Harlan Laboratories | ||
| Rodent chow | Harlan Laboratories | ||
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | ||
| Other chemicals | All chemicals used were of the purest grades available commercially. |
References
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