Summary
Izole mezenterik arterler kuvvet ölçümleri için otomatik bir kasılmaların kâğıda çizilmesi yöntemi açıklanmıştır. Fenilefrin ve ekstrasellüler kalsiyum yanıtlarını belirlemek için 510A Mulvany Halpern Otomatik Çift Tel Myograph kullanır. 300 mikron, bağımsız yöntemi 60 çaplarının küçük damarlarda agonistleri izometrik yanıtları tutarlı tespitine imkan sağlamaktadır.
Abstract
Proksimal direnç damarları, mezenterik arterler gibi periferik direnç önemli ölçüde katkıda bulunur. 100-400 mm arasında çapa işlevi öncelikle vücudun genel gereksinimlerine göre çeşitli organlara kan akışını yönlendirerek bu küçük gemiler. Sıçan mezenterik arter, 100 mm daha büyük bir çapa sahip. Kasılmaların kâğıda çizilmesi tekniği, ilk olarak Mulvay ve Halpern 1 açıklanan Bevan ve Osher 2 tarafından önerilen yöntem dayanmaktadır . Teknik kas hazırlanmasında önemli bir kısalma önlenir izometrik koşullar altında, küçük gemiler hakkında bilgi sağlar. Farklı agonistleri gemilerin yürürlüğe üretim ve duyarlılık aktif gerilim uzunlukta ilişkisi göre, streç ölçüde bağımlı olduğu için, montaj teller uygun önlemek için izometrik koşullar altında daralma çalışmalar yapmak şarttır. Paslanmaz çelik teller kaydedilen yanıtlar 3 etkileyen ikincisi, oksidasyonu nedeniyle tungsten teller tercih edilir. Tekniği, damar düz kas hücre reseptörleri normal fonksiyonu için kanıt elde etmek için monte gemilerin agonist bağlı kasılmalar karşılaştırılmasına olanak sağlar .
Biz phenylyephrine ile sözleşmeli izole mezenterik arterler ekstrasellüler kalsiyum (Ca 2 + e) kümülatif konsantrasyonlarda eklenmesi üzerine dinlenmek çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir. Bulgular bize G-protein-birleştiğinde Ca 2 +-algılayan reseptör (SYR) ifade eden bu perivasküler duyusal sinirler, sonucuna götürdü, bu vasorelaxation yanıt arabuluculuk . Otomatik bir tel kasılmaların kâğıda çizilmesi yöntemi kullanarak, Wistar, Dahl tuz-duyarlı (DS) ve tuza dayanıklı Dahl (DR) mezenterik arterler sıçan Ca 2 + e farklı yanıt verdiğini göstermektedir. Wistar sıçanlarda Dokular + hassasiyet DR ve DS olanlara kıyasla daha yüksek Ca 2 gösterdi. DS sıçan mezenterik arterler azalma araba ifade azalır Ca 2 + e-indüklenen izole, ön sözleşmeli arterlerin rahatlama ile ilişkilidir. Veri, araba, mezenterik arterler artmış adrenerjik ton altında rahatlamak için gerekli olduğunu öne sürdüğü gibi hipertansiyon oluşur ve çok daha şiddetli DS Dahl hayvanlarda araba sinyal yolağı içsel bir kusur, göstermektedir.
Yöntem, mezenterik direnç arter ve farklı agonist ve / veya antagonistleri arasındaki benzer küçük kan damarlarını ve karşılaştırmalar vasküler reaktivite ex vivo belirlenmesinde yararlı yan yana 6,7,8 kolay ve sürekli olarak değerlendirilir olabilir .
Protocol
1. Sıçan mezenterik arter izolasyonu
- Kapalı bir odasında izofluran ile hayvan anestezisi ve karın alkol ile silin.
- Mezenterik yatakta ortaya çıkarmak için bir orta hat laparotomi gerçekleştirin.
- Makaslar kullanılarak, superior mezenterik arter damarsal beslenme ile bağırsak yaklaşık 85 cm kaldırın. Pilorusta yakın bağırsak bölümünde ve bağırsak coecal kavşak yakınında distal ucu proksimal ucunu kesin. Bağırsak segmentleri açık göğüs kalp ponksiyon izofluran ve ötenazi ile derin anestezi sıçanların izole edilmiştir.
- PSS içeren kaplı petri eksize bölümüne yerleştirilir ve oda sıcaklığında mezenterik arter diseksiyon.
- Sağ tarafta bağırsak proksimal ucu aşağı pin ve intestineina saat yönünün tersine (bağırsak uzak tarafında sol besleme damarsal ieproximal sonuna) geri kalan pin.
- Proksimal segmentinin bir parça ile birlikte şube II ve III segmentleri teşrih.
- Ven inceleyin ve arter izole (V-şekilli şube noktası ile) ve yağ ve bağ dokusu ortadan kaldırarak temiz. Forseps ile yavaşça çekerek ve bağ dokusu zarından kesme arter ile doğrudan temastan kaçının.
2. Geminin montajı
- Ince bir forseps ile 40 mikron tungsten paslanmaz çelik tel, iki kısa kesimleri (≈ 4 cm) kesin ve endotele zarar vermemeye özen her arter lümen içine yerleştirin. Gerekirse lümen açmak için tel ucu kullanın. Kan damar dışına akışı iyi bir işaret lümen açıldı.
- 115 NaCl, 4.7 KCl, 1.4 MgSO 4 .7 H 2 O, 5 NaHCO 3, 1.2 K 2 HPO 4, 1.1 Na 2 HPO 4, 1.0 CaCl 2, 20 Hepes ve: mM; fizyolojik tuz solüsyonu (PSS myograph odasının doldurun 37 5 glikoz, askorbik asit (100 mcM) ile pH 7.4) ° C ve forseps kullanarak dikkatli bir şekilde oda sıcaklığında odasına petri dişli damar segmenti transfer ve myograph odasına eksize proksimal damar segmentinin transferi ve çekme geminin içine beslemek için tel boyunca sonunda. Gemi uzanan kaçının.
- Tel yakın sabitleme vidası mikrometre bağlı sağ çene altında saat yönünün tersine yakın ucunu sabitleyin. Forseps ile telin serbest ucunu yakalayın ve saat yönünde, sağ çene uzak sabitleme vidası altında güvenli. Tel boyunca geminin segment çene kendisi ile herhangi bir temas yapmadan çene arasındaki boşluğu yer olduğundan emin olun.
- Dışında çene Vida ve gemi ile ikinci tel paralel hizalamak ve lümen uzak ucuna takın. Yavaşça bir kılavuz olarak önceden monte edilmiş tel kullanarak bir hareket damar segmentinin lümen yoluyla tel besleme. Gemi manevrası sırasında germe önlemek için yaklaşık 1 cm tel tutun ve endotel dokunmaktan kaçının.
- Çene birlikte Vida ve ilki altındaki ikinci montaj tel hamle sağ çene güvenli olmasını sağlamak.
- Yakın sabitleme vidası transdüser bağlı sol çene altında bir saat yönünde ikinci tel sona yaklaştığını sabitleyin.
- Güvenli ve sabitleme vidası sol çene altında tel ucunda tel germek için sıkın.
- Bir kez montajı tamamlandığında, "Montaj Menü" motor sıfırlamak ve geminin normalleşme başlatın.
3. Normalleştirme
Otomatik Çift Tel Myograph System-510A "Normalizasyon" menüsünden değerlendirilir otomatik bir normalleştirme işlevi vardır ve gemi az 30 dakika için dengeleme sonra üretici firmanın protokolüne göre standart bir prosedür ile normalleştirilmiş bir iç çevresi gergin olması sağlar 37 ° C Üstel sonra iç çevresi basınç verilerine takılmıştır. Bu prosedür, arter, 1 100 mmHg bir transmural basınç altında rahat, in vivo olarak vardı ve var olacağını lümen çapı (d 100) tanımlar sıçan mezenterik arter için normalleşme parametreleri aşağıdaki gibidir:
- Hedef transmural basıncı = 13,3 kPa (100 mm Hg).
- Zaman = 60 sn; normalleşme adımları her Süresi.
- IC 1 / IC 100 = 0.9 (IC 1 = normalize iç çevresi, IC 100 = Hedef basınca tekabül eden iç çevresi .
- Vizör kalibrasyon 2 * Δ (mm / oküler bölme); 2 delta programlama nedenlerden dolayı.
Hairlines monte gemi segm uzak ve yakın uçları bittiğinde mikroskop göz parça okuma kullanarak monte mezenterik arter uzunluğunu ölçünent. Kısaca, diseksiyon mikroskobu kalibre edilmiş bir göz göz parça monte damar segmentinin uzunluğu ile maksimum büyütme ölçülür. Segmentin en uç (1) üzerinden saç hattı ile göz parça okuma ve oküler bölünmeler segmentinin yakın sonunda (2) ölçülür ve kaydedilir. Bu değerler, mikrometre okumaları, gemi germe önce ve sonra kaydedilir ve program için menüler girilen monte eğrisi ve iç çapı 100 mm Hg hedef transmural basınç karşılık gelen hesaplamak
Çalışmalarda, damar lümen çapı d 1 = 0.9 etkin bir güç geliştirme maksimal xd 100,. Sıçan mezenterik arterlerde ≥ 10 mN Aktif kuvvet gelişimi devam etmek için deneyler için optimum olarak kabul edilir. Alt aktif güçle Dokular atıldı.
4. Tepkilerin ölçülmesi
Normalleştirme sonra, gemilerin mekanik ve fonksiyonel özellikleri tekrarlanabilir kasılmaları elde etmek için 5 mcM fenilefrin (PE) tekrarlanan uygulamaları (normalde 2 ya da 3) ile zorlu damarları içeren bir "standart start" yaparak yeniden aktive edilir. Laboratuvarımızda tipik bir "standart start" uyarılara ve yıkanmaya dönemleri aşağıdaki gibi bir dizi oluşur:
- Myograph odası% 95 hava ve% 5 CO 2 ile kaplayın ve havalandırma değiştirin.
- Taze PSS (100 mcM askorbik asit içeren) ile oda doldurun
- Sözleşme 5 dakika için 5 mcM PE ile gemi ve PSS tamponu ile 4 kez yıkayın.
- Sonra son yıkama, PSS ile dolum haznesi ve adımların, (ii) tekrar önce 3 dakika bekleyin ve (iii).
Standart başladıktan sonra, arter deney için hazır. Sözleşmeli damarları gevşeten CaCl 2 artan konsantrasyonlarda (0.5 - 4 mM) kümülatif olarak değerlendirilir. inhibitörleri kullanılır. damarları deneyleri sırasında 20 dakika ve şu an için myograph odasında bileşikleri ile önceden inkübe edilir.
5. Veri Analizi
SigmaPlot 11.0 grafik programı (Systat Yazılım, Richmond, CA) ile gemiler ve kuvvet iz, doğrudan metin veri dönüştürülür "Normalizasyon" veri analiz ve Şekil 1'de gösterildiği gibi çizilir. Iz hesaplanan konsantrasyon-yanıt veriler, programın Farmakoloji menüsünde dört parametreli lojistik fonksiyonu monte deneysel veriler EC 50 değerleri ile analiz edildi. Gruplar arasında ve grup içi karşılaştırmada ise Tek Yönlü Varyans Analizi (ANOVA) ve p <0.05 anlamlı olarak kabul edilir farklılıklar tarafından gerçekleştirildi.
6. Temsilcisi Sonuçlar:
| Parametreler | Wistar | Dahl Tuz Duyarlı | Dahl Tuz-Dirençli |
|---|---|---|---|
| L 100 (mikron) | 83,26 ± 2,33 | 91,52 ± 4,67 | 117,45 ± 8.43 * |
| X 1 | 604,21 ± 41,97 | 752,24 ± 85,25 | 745,84 ± 110,09 |
| r 2 | 0.99 ± 0.003 | 0.97 ± 0.008 | 0.97 ± 0.007 |
* Wistar ve DR L 100 değerleri arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı. Shapiro-Wilk Normallik Testi (p = 0,588) geçti; Eşit Varyans Testi (p = 0,237) geçti.
100 L = monte segmenti hedef transmural basınç ilgili İç çapı.
X 1 = normalize iç çevresi (yani hangi deneyler yapıldı mikrometre okuma değeri) monte gemi germek için gerekli mikro pozisyoner ayarı.
r 2 üstel eğriyi = oturması için regresyon katsayısı (X i, Y i).
Not: Ayrıntılı prosedür 510A Myograph Sistemi 6 kılavuzda açıklanmıştır.
Tablo 1: Örnek okuyun-Out "Normalizasyon Menüsü" nde gösterilen Basic programı Wistar, DS ve DR mezenterik arter segmentleri için normalleşme parametreleri. Değerler 5 hayvanların (± SEM) anlamına gelir. Wistar ve DS için L 100 değerleri arasındaki farklar istatistiksel olarak anlamlı (p <0.05).
| Wistar | DS | DR |
|---|---|---|
| 14.2 ± 0.6 | | 20.9 ± 1.3 * | |
Tablo 2, her bir gemi için 5 mcM PE uygulamaları aşağıdaki, Wistar, DS ve DR sıçan izole mezenterik arterler, geliştirilen gerilimler ( MN). Bildirilen değerlerin 6-8 hayvanların (± SEM) anlamına gelir. * Wistar denetimleri önemli derecede farklılık (p <0.05).
Şekil 1. Ca 2 + PE-sözleşmeli bir Wistar sıçan mezenterik arter e-kaynaklı rahatlama fizyolojik tuz çözeltisi içeren 1 mM Ca 2 + tel myograph monte edilmiş . Arter 30 dakika süreyle 37 ° dengelenmiş ° C sürekli havalandırma ve yanıtları Ca 2 + e belirlenir. PE Ca 2 kümülatif eklemeler 5 mcM ek dayanan bir temsilci force + gösterilmiştir.
Şekil 2 Ca 2 + PE-sözleşmeli DS sıçan mezenterik arter e-kaynaklı rahatlama fizyolojik tuz çözeltisi içeren 1 mM Ca 2 + tel myograph monte edilmiş . Arter 30 dakika süreyle 37 ° dengelenmiş ° C sürekli havalandırma ve yanıtları Ca 2 + e belirlenir. PE Ca 2 kümülatif eklemeler 5 mcM ek dayanan bir temsilci force + gösterilmiştir. Ca 2 + rahatlama ciddi Wistar ve DR sıçan göre bu doku içinde tatlıya bağlandı.
Şekil 3. Ca 2 + PE-DR sıçan sözleşmeli mezenterik arter e-kaynaklı rahatlama fizyolojik tuz çözeltisi içeren 1 mM Ca 2 + tel myograph monte edilmiş . Arter dengelenmiş az 30 dakika süreyle 37 ° C sürekli havalandırma ve yanıtları Ca 2 + 5 mcM PE Ca 2 kümülatif eklenen ek iz e determined.A temsilcisi force + gösterilmiştir.
Şekil 4. A. [Ca 2 +] E-yanıt eğrileri B. DR ve DS sıçanların izole mezenter eğlencelerle dört parametre lojistik curve.C.CaR ifade veri sıkıştırılmak suretiyle belirlenir dinlenmek için EC 50 değerlerini gösteren Çubuk grafik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hipertansiyon, kalp-damar, beyin ve böbrek morbidite / mortalitenin önde gelen nedenidir. Hipertansiyon oluşumu nüfusun yüksek olduğu ve tuz duyarlı hipertansiyon özellikle yaşlanan nüfus, yüksek ve siyahlar beyazlara nazaran daha yaygındır. Bunun nedeni, onların böbrekler 9 sodyum korumak için siyahların eğilimi olduğuna inanılıyor . Tuz duyarlılık, böbrek hastalığı için önemli bir faktör ve endotel disfonksiyonu ile ilişkili, fakat mekanizması tam olarak anlaşılmış değildir. Laboratuvarımızda son çalışmalar, yüksek tuz diyeti Ca 2 + konsantrasyonu ([Ca 2 +] IF) interstisyel sıvı azaltmak ve tuz-duyarlı sıçanlarda 10,11 sistolik basınç artışı ortaya çıkmıştır . Bu etkiler, yeni tedavilerin geliştirilmesi için bir hedef sağlayabilir mezenterik arter ve tuz duyarlı hipertansif hastalarda araba düzeylerinde benzer azalmalar kidneys.Finding Otomobil ifade azalmasına bağlı olabilir. Biz izole mezenterik arterler ile araba damarsal sinyal mekanizmasını anlamak için Ca 2 + e vasküler reaktivite çalışma hipertansiyon hayvan modellerinde bir dizi otomatik tel kasılmaların kâğıda çizilmesi kullanarak edilmiştir.
[Ca 2 +] e insanlar 12 (1,1 - 1,4 mM) dar bir aralık içinde tutulur, bu nedenle Araba [+ Ca 2] e mümkün reseptör aktivasyonu için küçük değişiklikler tespit etmek gerekir. Aslında, araba, Ca 2 + e 13, ve küçük artışlar küçük değişiklikler tespit edilmiştir [Ca 2 +] 14 fizyolojik aralığı içinde olduğunu EĞER ölçüm yerinde mikrodiyaliz çalışmalar [Ca 2 +] EĞER , periferik direnç ve kan basıncı (BP) düzenlenmesi için gerekli olan duodenal submukoza ve böbrek korteks, iki dokular, bağırsak lümen [Ca 2 +] bir fonksiyonu gibi dinamik değişiklikler gösterdi. Artan gut [Ca 2 +] 0 - 6 mM, artan [Ca 2 +] 1.1 ile 1.9 aralığında gözlenen perivasküler sinir araba 16 etkinleştirmek için mM 4,5,15, ve izole mezenterik dinlenmek EĞER arterler 17. Biz de araba azalır algılar olduğunu göstermiştir [Ca 2 +] e ve aktivasyonu yoluyla da neokortikal terminalleri 18 serbest bırakma olasılığı üzerindeki etkisini hafifletir non-selektif katyon kanalı, aksiyon potansiyeli süresi artar. Bu araba Ca 2 + e yanıt beyin eksitabilite değiştirmek için pre-sinaptik geri bildirim sağlar. Ayrıca, PVN otomobilin duyarsızlaştırma bu reseptör düzenleme anlayışı, normal ve hipertansif şartlarda rolünü açıklığa kavuşturmak olacağını düşündüren, tekrarlanan, uzun süreli stimülasyon 16 ile oluşur. Bukoski ve arkadaşları göstermiştir ki küçük değişiklikler [Ca 2 +] Araba etkinleştirmek ve normal şartlar 3,4.19, altında vazodilatör sentezine katkıda bulunmak için yeterli EĞER. Bu gözlemlere dayanarak, hipertansiyon görülür ve bu nedenle kan basıncı kontrolü için istismar edilebilir bu yanıtı da artmış vasküler sesi koşullar altında oluşacağını önerme. Araba aktivasyon çalışma ve nasıl sinyal ara fosforilasyon için bu yol açar, bu nedenle, normal ve hipertansif fizyolojisi rolünü prob için gerekli. Araba, G-protein kenetli reseptör (GPCR) ve diğer GPCRs ortak terapötik hedeflerin gibi benzer mekanizmalar aracılığıyla düzenlenir. Bu nedenle, kan damarları ve düzenleme mekanizmalarını anlamak potansiyel anti-hipertansif tedavi için bir hedef olarak belirlemek için gerekli verileri sağlayacak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Ödülü Numaraları R01 HL064761, R25 HL059868 1SC1 HL099139 ve Sağlık P20 MD000175 formu Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından açıklanan proje desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auto Dual Wire Myograph System-510ADMT-USA, Inc. | Atlanta, GA. | 100151 | |
| PowerLab/4SP Data Acquisition System |  ADInstruments |
ML750 | New models with 4-16 input channels are available. |
| Dell Dimension XPS Gen 4 Computer | Dell | ||
| Stemi SV II (Apo) Dissection Microscope with Ocular | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Wistar, Dahl salt-sensitive, Dahl salt-resistant rats | Harlan Laboratories | ||
| Rodent chow | Harlan Laboratories | ||
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | ||
| Other chemicals | All chemicals used were of the purest grades available commercially. |
References
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260, 617-619 (1976).
- Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro. Agents Actions. 2, 257-260 (1972).
- Mulvany, M. J. Procedures for investigating of small vessels using small vessel myograph. DMT Danish Myo Technology. , (2004).
- Angus, J. A., Wright, C. E. Techniques to study the pharmacodynamics of isolated large and small blood vessels. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 44, 395-407 (2000).
- Halpern, W., Mulvany, M. J., Warshaw, D. M. Mechanical properties of smooth muscle cells in the walls of arterial resistance vessels. J. Physiol. 275, 85-101 (1978).
- Lindhorst, J., Alexander, N., Blignaut, J., Rayner, B. Differences in hypertension between blacks and whites: an overview. Cardiovasc. J. Afr. 18, 241-247 (2007).
- Eley, S. L., Allen, C. M., Williams, C. L., Bukosi, R. D., Pointer, M. A. Action of thiazide on renal interstitial calcium. Am. J. Hypertens. 21, 814-819 (2008).
- Palmer, C. E., Rudd, M. A., Bujoski, R. D. Renal interstitial Ca2+ during sodium loading of normotensive and Dal-salt hypertensive rats. Am. J. Hypertens. 16, 771-776 (2003).
- Hurwitz, S. Homeostatic control of plasma calcium concentration. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 31, 41-100 (1996).
- Brown, E. M., MacLeod, R. J. Extracellular sensing and extracellular calcium signaling. Physiol. Rev. 81, 239-297 (2001).
- Breitwieser, G. E. Extracellular calcium as an integrator of tissue function. Int. J. Biochem. Cell Biol. 40, 1467-1480 (2008).
- Mupanomunda, M. M., Wang, Y., Bukoski, R. D. Effect of chronic sensory denervation on Ca2+-induced relaxation of isolated mesenteric resistance arteries. Am. J. Physiol. 274, 1655-1661 (1998).
- Mupanomunda, M. M., Ishioka, N., Bukoski, R. D. Interstitial Ca2+ undergoes dynamic changes sufficient to stimulate nerve-dependent Ca2+-induced relaxation. Am. J. Physiol. 276, 1035-1042 (1999).
- Mupanomunda, M. M., Tian, B., Ishioka, N., Bukoski, R. D.
- Awumey, E. M., Hill, S. K., Diz, D. I., Bukoski, R. D. Cytochrome P-450 metabolites of 2-arachidonoylglycerol play a role in Ca2+-induced relaxation of rat mesenteric arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 2363-2370 (2008).
- Chen, W., Bergsman, J. B., Wang, X., Gilkey, G., Pierpoint, C. R., Daniel, E. A., Awumey, E. M., Dauban, P., Dodd, R. H., Ruat, M., Smith, S. M. Presynaptic external calcium signaling involves the calcium-sensing receptor in neocortical nerve terminals. PloS One. 5, e8563-e8563 (2010).
- Bukoski, R. D. The perivascular sensory nerve Ca2+ receptor and blood pressure regulation: a hypothesis. Am. J. Hypertens. 11, 1117-1123 (1998).
- Bukoski, R. D. Dietary Ca2+ and blood pressure: evidence that Ca2+-sensing receptor activated sensory nerve dilator activity couples changes in interstitial Ca2+ with vascular. 16, 218-221 (2001).
