Summary
Levator auris longus (LAL) genç erişkin farelerin kas muskarinik sinyalizasyon inhibitörleri tekrarlanan yönetim ve wholemounts nöromüsküler kavşak sonraki immün (NMJs) için prosedürleri açıklar. LAL kas ifşa ettiği için benzersiz avantajları vardır.
Abstract
Gastroknemius ve tibialis anterior gibi kemirgenler, Hind bacak kasları memeli NMJs oluşumu ve korunması için gerekli sinyalleri in vivo farmakolojik çalışmalarda sık sık kullanılır . Ancak, subkutan veya intramusküler uygulamadan sonra bu kasların içine ilaç penetrasyonu genellikle eksik ya da düzensiz ve birçok NMJs etkilenmez. Mini pompaları gibi cihazlar ile sistemik yönetim Spatiotemporal etkilerini artırabilir olsa da, bu yaklaşımın invaziv doğası karıştırıcı inflamatuvar yanıtları ve / veya doğrudan kas hasarına neden olabilir. Ayrıca, zaman alıcı bir seri kesit ve kapsamlı immün gerektirdiğinden bir arka bacak kas NMJs tam analizi zordur.
Fare LAL boyun dorsum yüzeysel olarak bulunan ince bir kas, düz levha. Bu, hızlı kasılan kas fonksiyonları kulak kepçesi taşımak için. Kafatası orta hat kaynaklanan ve her kepçesi kıkırdak kısmının yanal uzatmak rostral ve kaudal kısımları içerir. Kas çıkar Stylomastoid foramen olarak kaudal projeler yüz sinirinin bir şube tarafından verilir. Biz ve diğerleri, hem de kısa ve uzun vadeli NMJs ve kasları ilaçların in vivo etkilerinin araştırılması için avantaj sunan uygun bir hazırlık olması amacıyla LAL bulduk . İlk olarak, yüzeysel bir konumda, hafif anestezi altında ilaçlar birden fazla yerel uygulamaları kolaylaştırır. İkincisi, inceliği (2-3 kat kas liflerinin), kas içinde hemen hemen tüm NMJs görselleştirme ve analiz izin verir. Üçüncü olarak, onun innervasyon deseni ile birlikte sinir bozulmadan diseksiyon kolaylığı, ek elektrofizyolojik analizi, in vitro 9,5 izin verir. Belki de son ve en önemlisi, uygulanan küçük bir hacim (~ 50μl) kolayca tüm kas yüzeyi kapsayan tüm NMJs ilaç düzgün ve uzun süreli maruz kalma sağlar ve sistemik bir yaklaşım 1,8 ihtiyacını ortadan kaldırır .
Protocol
1. Muskarinik asetilkolin reseptör (mAChR) antagonistleri subkutan uygulanması
- 1.5mL reaksiyon tüp içinde steril serum fizyolojik uyuşturucu eriterek mAChR antagonisti aseptik koşullarda, uygun doz, (bkz. Tablo) altında hazırlayın. Aşağıdaki antagonistleri kullanıldı: atropin, Methoctramine, 4-DAMP AFDX-116, AFDX-384, MT 7.
- A1cc insülin enjektörü çözüm 50μl çizin ve her bir fare için ayrı bir şırınga kullanın. Ayrıca, sadece kontrol grubunda her fare için serum fizyolojik içeren şırınga hazırlar. Enjekte etmek için hazır olana kadar buz üzerinde şırınga tutun.
- Uygun anestezi derinliği tutam ayak yanıt eksikliği gözlemleyerek, ketamin ksilizin kokteyl (120 mg / kg ketamin, 8 mg / kg xylazine) fareler anestezi.
- Uygun sedasyon sonra, boyun kaudal bölge başkanı rostral bölgeyi kapsayan saç tıraş,% 70 etanol ile uzak kalan saç silin.
- Place stereomicroscope altında fare ve şırınga, iğne (Şekil 1A, B) hafifçe yukarı çekerken LAL kas iğne paralel eklemek. Bu bağ dokusu üzerinde iğne sokulur ve LAL kas kendisi doğrudan zarar vermez sağlar. Iğne ucu LAL kas kaudal yönünü kapsayacak şekilde yerleştirin.
- Çok yavaş şırınga geri çekilirken doğru LAL kas üzerinde çözüm enjekte etmeye başlar; toplam enjeksiyon süresi yaklaşık 1 dakika olmalıdır. Düzgün bir şekilde enjekte edilirse, çözüm örten deride en az bir saat kalacak, yaklaşık 1 cm çapında bir "dome" oluşturmalıdır. Düzgün enjekte çözüm sağ LAL kas tüm rostral ve kaudal bölgeleri kapsayacaktır.
- 1 ila 7 gün boyunca her 12 saatte bir aynı işlemi tekrarlayın. Diğer studies1 için, büyüme faktörleri, her 12 saatte bir 21 gün kadar enjekte etmek için aynı protokol kullanılır. 21 güne kadar, anestezi 2x bir gün ile uygulanan farelerde anormal tepkiler gözlendi.
2. LAL kaslarının diseksiyonu
- Pentobarbital sodyum aşırı dozda (390 mg / kg) ile fareler Euthanize. Ölüm torakotomi sonra kalp atışı eksikliği değerlendirerek güvence altına alınmıştır.
- 1 pin ve burundan 1 pin her pençe, bir diseksiyon çanak dorsal tarafına fareyi yukarı aşağı pin.
- Sol, sol kürek kemiği çevresinde bölgeye kulak sadece proksimal bölgeden LAL birlikte kesmek için küçük yaylı makas kullanılarak, sadece deri yoluyla ilk kesi olun.
- Bu bölgede cilt dikkatlice çıkarın, ama bu doğru LAL kas ek puan olarak sağ kulak çok yakın kesme önlemek.
- Başın yüzeysel yüzeyinde orta hat boyunca sağ ve sol LAL kasları karşılayan lipid merkezi bir konuma sahip yağ dokusu şeridi, bulun. Küçük yaylı makas kullanılarak, omuz (Şekil 1C) ulaşana kadar sağ sol LAL kas proksimal kenarından yağ dokusu (sol kulak doğru) 1cm kesti.
- Bir kez kesi, geriye doğru LAL kas kas ventral tarafında ortaya çıkarmak için küçük forseps ile soyma yapılır. Forseps (Şekil 1C) ile sağ LAL kas dikkatle yukarı çekerken, bağ dokusu ve fasya kesin.
- Kulağının dibinde kaudal sonuna doğru LAL etrafında kesin. , Kesim, sağ kulak rostral sonuna doğru hareket, sağ LAL (Şekil 1C) devredildi tutarak devam edin . LAL kendisi zarar riski daha bu aşamada daha fazla doku dahil etmek daha iyidir. Kas, pipet 1X PBS kas üzerinde kurumaya başlar.
- Place 1X PBS, dorsal tarafına içeren 30mm kültür Sylgard çanak LAL disseke. Küçük böcek iğneli kas dört köşe aşağı pin.
- Sağ LAL kas dorsal ve ventral yüzeyleri küçük forseps ve yaylı makas, temiz, bağ dokusu kullanma. Ventral yüzeyi temizlemek için kas ters çevirin ve yeniden-pin. 2-3 kaslar aynı 30mm çanak yerleştirilmiş olabilir.
3. LAL NMJs Triple immün: 1. Gün
- Başında immün önce, gerekli tüm reaktifler hazırlamak. 1X PBS,% 2 sığır serum albumin BSA) / PBS,% 2 0.1M Glycine BSA / PBS,% 2 BSA / PBS, ve% 4 1X PBS paraformaldehid (PFA)% 0.2 Triton X100 ihtiyaç duyulacaktır. -20 ° C derin dondurucuda Pre-soğuk metanol.
- Bu işlem sırasında çanak dorsal tarafına tutturulmuş LAL kasları bırakın. 1X PBS çözümü atın ve kas karşılamak için yeterli% 4 (PFA) ekleyebilirsiniz. Çalkalayıcı yerleştirin çanak 20 dakika boyunca 2 veya 3 hız ayarlayın. Aksi belirtilmedikçe, aşağıdaki adımları çanak çalkalayıcı üzerinde yer olmalıdır.
- % 4 PFA atın kas ve 1X PBS 3 kez, 10 ', her ile yıkayın.
- Son 1X PBS 2% 30 'BSA / PBS çözüm 0.1M Glycine yıkayın ve eklemek atın.
- 0.1M Glycine çözümü bir atınd eklemek 1X PBS 1:200 15 'lik bir konsantrasyon rodamin konjuge α-bungarotoxin içeren.
- Α-bungarotoxin çözüm atın ve 1X PBS, 3 kez 10 'her kas yıkayın.
- Ön soğutmalı metanol ekleyerek doku Permeabilize ve tam 5 dakika boyunca -20 ° C derin dondurucuda çanak, hiçbir ihtiyaç sallayarak.
- Metanol çıkarın ve 3 kez 10 'her 1X PBS ile yıkayın. Ile son yıkama ve blok doku atın% 0.2 triton X-100,% 2 BSA / PBS 1 saat. Yıkama ve engelleme adımları oda sıcaklığında yapılır.
- 4, titreme, gecede kasları inkübe ° C primer antikorları bloke çözüm (bkz. Tablo) seyreltilmiş bir kokteyl.
4. LAL NMJs Triple immün: 2. Gün
- 1X PBS 3 kez, 10 'oda sıcaklığında her kasları yıkayın.
- Oda sıcaklığında 1 saat (bkz. Tablo) çözümü engelleme ikincil antikor kokteyli ekleyin. Foto-Alexa-Fluor 647 floresan beyazlatma önlemek için kasların bu adımı itibaren ışıktan korunmalıdır.
- 1X PBS 3 kez, 10 ', her kasları yıkayın.
- 1X PBS içinde kalan bağ dokusu Temiz, LAL kasların lateral sınırları kesilmiş ve slaytlar dorsal tarafına monte cam kapak fişleri ve montaj medya kullanarak. Yerinde kapak kayma güvenliğini sağlamak için açık bir oje kullanın.
- Analiz için hazır olana kadar -20 ° C'de ışık ve mağaza slaytlar koruyun.
5. LAL NMJs Konfokal görüntüleme
- Yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüler, Leica TCS 4D konfokal mikroskop Leica Planı Apo 63X yağ objektif (1.4NA) ile elde edilir.
- Floresein ve Alexa 647 sinyalleri aynı anda sırasıyla, lazer çizgileri 488 nm (Argon, 488 nm, 20 mW) ve 633 nm (HeNe, 633 nm, 10 mW) ile tarandı. Sırayla, rodamin sinyal sonra lazer hattı ile 561 nm (DPSS, 561, 20 mW) taranır. Optik bölümleri 0.3 mikron aralıklarla toplanan ve z-düzleminde görüntü sayısı 60-80 arasında değişiyordu. Iğne deliği Airy 1 (107,97 um) göre ayarlanır. Görüntü formatı 1024 x 1024 (X, Y), az 1 234,32 mm x 234,32 mm ve 229,05 nm x 229,05 nm piksel boyutunda bir görüntü boyutu 400Hz hızlı bir zoom faktörü.
- Leica TCS-NT kazanım yazılım sonra maksimum yoğunluğu projeksiyonları z serisi görüntüleri yeniden oluşturmak için kullanılır.
- Multipanel görüntüleri Adobe Photoshop kullanarak, parlaklık ve kontrast ayarlanır.
- Tipik bir LAL kas için, biri yaklaşık 75-100 tr yüz NMJs analiz etmek gerekir. Synaptic istikrar gibi pre-, peri-ve postsinaptik unsurların mekansal uyumu (yani sinir, Schwann hücreleri ve kas) gibi özellikleri ve sinaptik alan ölçümleri (yani sinaps boyutu) tarafından belirlenir.
Temsilcisi sonuçları:
Nikotinik AChRs postsinaptik kümeleri (Kırmızı Şekil 2) tam apposed tek bir kas lifi, yetişkin bir memeli NMJ, tek bir motor akson son derece sinir terminal farklılaşmış milleri (Yeşil Şekil 2) formunu ince dalları ayrıntılarına . Perisynaptically, terminal Schwann hücreleri sıkı presinaptik sinir terminalleri (Blue Şekil 2) tüm dallarını kapsamaktadır. Bu üçlü organizasyonun yapısal ve işlevsel bütünlüğü ciddi alt tipi özel mAChR inhibitörleri günlük uygulama tarafından rahatsız. Burada sunulan örnek (Şekil 3), 4-DAMP, M1, M3, M4 ve M5 mAChR alt tipleri için yüksek afinite ile mAChR antagonisti (Şekil 3B, kas yüzeyi boyunca sayısız NMJs sinir terminallerine seçici eleme çağrıştırıyor C). Buna ek olarak, terminal Schwann hücrelerinin süreç uzantısı olmadan parlak S100 etiketleme (Şekil 3B, 3C) ile kanıtlanan 8 anormal suskun. Postsynaptically, kas lifleri normal ve nAChRs, hiçbir kayıp vardır (Şekil 3B, 3C).
Şekil 1 LAL kas Anatomik yeri ve organizasyonu. Rostral (rLAL), kaudal (cLAL) ve LAL sinir (LALn) ve buna karşılık gelen uç plakası bantları yeri (A, içerlek) gösterilmiştir. LAL kas göre iğne konumu ve enjeksiyon işlemi (B) gösterilmiştir. Kesi noktaları diseksiyon prosedürü (C) gösterilmiştir.
Şekil 2 NMJ Üçlü organizasyonu. Yüksek büyütmeli bir fare NMJ konfokal kez. Tek bir akson terminal Schwann hücresi ve süreçler (terminali Schwann hücre gövdeleri A ', yıldızlarla noktası) tarafından sıkıca kapalı ince terminal dalların (A), ayrıntılarına. Postsynaptically bir kas lifi, nikotinik AChRs bir küme hassas sinir terminaline dalları apposed.yalleri ve terminal Schwann hücresi.
Şekil 3 LAL kasları 4-DAMP, mAChR antagonisti ile tedavi. LAL kasların Düşük ve yüksek büyütmeli konfokal kez araç ya da 4-DAMP ile tedavi edildi. Araç ile tedavi edilen kas (4 DAMP tedavi kas eksikliği sinir terminalleri (A-A'''), sayısız NMJs aksine B-B ', C-C'''). Şekil 2B kutulu alan Şekil 2C yakınlaştırılmış.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan yöntem memeli NMJs istikrar ve bakım sinyalizasyon alt tipi özel mAChR önceden tanınmayan rolleri soruşturma izin verir. Bu yöntem ayrıca nörotrofik faktörler ve farmakolojik ajanların etkilerini test etmek için faydalı olacaktır. Örneğin, laboratuar Silier Nörotrofik Faktör (CNTF) yetişkin farelerde neredeyse tüm LAL sinir terminallerinden çimlenme yol açtığını 1 . Bu sonuç ca az çimlenme orta bildirdi CNTF ile tedavi edilen arka bacak kasları, önceki çalışmalarla tezat. Gluteus ve yanal gastroknemius kavşaklar 3% 9% 13-33. Biz tutarsızlık arka bacak kasları daha LAL içinde CNTF sinir terminalleri daha düzgün ve uzun süreli maruz kalma nedeniyle olduğuna inanıyorum. Gerçekten de, yanal gastroknemius ve tibialis anterior kaslar, yaygın hemen hemen tüm LAL NMJs çimlenme ortaya çıkardı aynı protokolü kullanarak CNTF uygulandığında, zayıf tercihen enjeksiyon yerleri yakınında bulunan NMJs sadece mütevazı bir çimlenme gözlemlenmiştir. Hindlimb NMJs CNTF maruz kalma Görünüşe göre, önceki bir çalışmada da belirtildiği gibi, sınırlı ve düzensiz olmuştur 2 . Öte yandan, CNTF subdermal bağ dokusu ve LAL fasya arasında enjekte edilen, ama arka bacak kas içine CNTF subkutan enjekte değil, vasküler reabsorbsiyonu önce en az bir saat için kalıcı bir yerel, subdermal şişlik oluşmuş. Ayrıca, CNFT veya mAChR antagonistleri enjeksiyon sıklığı günde dört kat kadar artmıştır bile, biz CNTF ve mAChR antagonistleri özellikle katkı etkileri gözlemlemek vermedi dikkat çekicidir. Buna ek olarak, uygun enjeksiyon işlemi gerçekleştirilir ise, doğrudan herhangi bir kas hasar meydana olacağını olası değildir. Biri yaptı sinir terminali ya da düğümler aksonal filizlenme Ancak, enjeksiyon prosedürü sırasında kas zarar ve / veya kas lifi dejenerasyonu 1,8 görülebiliyor. Özetle, LAL kasların, kas içinde nispeten kolay ve hızlı prosedürler tüm NMJs tekdüze, uzun süreli maruz kalma izin veren benzersiz bir hazırlıktır.
LAL bir kas dar kaudal kısmı geniş rostral bölümü (2-3 kas lifi kalınlığında) daha (kalın 3-5 kas lifleri) kalın. Buna göre, derin kaudal LAL konumlandırılmış kas lifleri ile ilişkili NMJs genellikle ya wholemount immün etiketli veya sadece, küçük boyutu ve nAChRs için yüksek afinite nedeniyle antikorlar daha derinden nüfuz α-bungarotoxin etiketli değildir. Bu NMJs kaybolan sinir terminalleri veya uygulanan ilaçların spesifik etkileri nedeniyle Schwann hücrelerinin sahip olarak yanlış yorumlanabilir. Bu nedenle bu kavşaklar sadece kaudal LAL gözlenen olup olmadığını not etmek önemlidir, ve NMJs veya kas lifleri yüzeysel veya derin olup olmadığını, yüzeysel konumlandırılmış kas lifleri genellikle derin yerleştirilmiş liflerden çok daha yüksek arka plan immünofloresan ile ilişkili. Alternatif olarak, bir wholemount analiz LAL kaudal şerit derin yerleştirilmiş NMJs atlayabilirsiniz.
LAL sinirlerin tam transeksiyonu nispeten kolaydır ve denerve kaslar mAChR inhibisyon etkilerini incelemek için izin vermesine karşın, boyutu ve erişilebilirlik LAL sinirlerin cerrahi yaklaşımlar araştırılmalıdır türlerini sınırlamak. Örneğin, kısmen LAL sinir zarar LAL bir kas kısmi denervasyon ikna etmek için teknik olarak oldukça zor görünüyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Müsküler Distrofi Derneği, NIH (NS062320) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ketamine | Hospira Inc. | NDC0409-2051-05 | Dose: 120mg/kg |
| xylazine | Lloyd, Inc. | LA33806 | Dose: 8mg/kg |
| atropine | Sigma-Aldrich | A0132 | (>98% purity); Dose: 0.2mg/kg — 20mg/kg |
| atropine | Voigt Global Distribution | AT105 | Pharmaceutical grade |
| Methoctramine | Sigma-Aldrich | M105 | Dose: 100 - 400M |
| 4-DAMP | Sigma-Aldrich | D142 | Dose: 2.5mg/kg |
| AFDX-116 | Tocris Bioscience | 1105 | 250M |
| AFDX-384 | Tocris Bioscience | 1345 | 50M - 500M |
| MT 7 | Peptides International | PMT-4340-s | 0.1M - 1M |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353-500 | Make 10% solution first by dissolving 10g/100mL de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| Sodium pentobarbitol | Virbac Animal Health | NDC-051311-050-01 | Dose: 390mg/kg |
| Sylgard | Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit, can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Use at concentration of 1:200 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI312 | Use at concentration of 1:1000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Use at concentration of 1:10 |
| S100 | Dako | Z0311 | Use at concentration of 1:400 |
| FITC- goat anti-mouse IgG1 | Roche Group | 03117731001 | Use at concentration of 1:200, but if background is high, try 1:400 |
| Alexa-Fluor 647 conjugated goat anti-rabbit | Invitrogen | A21244 | Use at concentration of 1:200 |
| Vectashield fluorescent mounting media | Vector Laboratories | H-1000 | This is not a hard-set media, you will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 |
References
- Wright, M. C., Son, Y. J. Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice. Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).
- Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).
- Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction. J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).
- Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses. J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).
- Lanuza, M. A. Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase. C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).
- Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).
- Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin. J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).
- Wright, M. C. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors. J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).
- Dorje, F. Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes. J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).
- Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors. Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).
