マウス全胚培養における神経管閉鎖

Summary

母体の代謝をバイパスする神経胚形成の間にマウス胚の直接の薬理学的操作を可能にする方法が記載されている。技術は時間のポイントと薬剤を変えることによって、神経胚形成の異なる側面を研究するために適応させることができます。

Abstract

遺伝的マウスモデルでは、哺乳類の神経管閉鎖の研究において重要なツールです（グレー＆ロス、2009;ロス、2010）。しかし、 子宮内でマウスの胚の研究は、直接薬理学的に興味のある試薬で母体の代謝の影響から分離して胚を操作するために私達の無力によって制限されます。食事を介して、または注射により、小分子、組換えタンパク質、またはsiRNA、母親へのこれらの物質の配信を使用するかどうかは、それらが胚に達するのを妨げる可能性のある身体の防御の様々なこれらの不安定な化合物を加えないでしょう。全体の胚の培養物における調査は、開発上の本質的な胎児の影響から母体を分離するのに使用できます。

ここでは、郭清後の通常の神経管閉鎖（クロケット、1990）を可能にするローラーインキュベーター装置で高濃縮媒体を用いて培養マウス胚のための手法を提案する。かつて文化の中で、胚ができます胚が子宮内に残っていた場合以外の場合は不可能なインビトロ技術で 、従来使用して操作する。胚の兄弟は、E7 - 7.5（神経板の形成、神経胚形成の開始直前に）から頭蓋倍と尾側神経孔の終了時E9.5 - 10（に発生、神経胚形成の異なる側面を研究するために種々の時点で収集することができます閉鎖、カウフマン、1992）。このプロトコルでは、我々は、頭蓋神経胚形成の研究に最適なタイムポイントで胚を解剖ための私達の方法を示しています。胚は、神経管閉鎖の開始後、前の胚の転換と頭部神経倍閉鎖へ、E8.5（約10〜12 somities）で解剖し、E10（26-28 somities）まで培養によって維持されるときに頭蓋神経胚形成が完了されるはずです。

Protocol

1。培地の調製 - すべての試薬を表1に記載されています

1. 37雄ラットの血清を融解℃を
2. 55℃30分間熱不活性化するラットの血清° C
3. 室温で5分のための10Kでの遠心ラットの血清
4. 上清を除去し、フェノールレッドを含まないDMEM W /高グルコースで50:50を混ぜる
5. 0.45 UMシリンジフィルターを使用してメディアを滅菌
6. メディア/胚の少なくとも1ミリリットルを用意する必要があります

2。妊娠ダムから子宮の単離

1. 動物実験および使用委員会（IACUC）によって承認された手順を使用して、妊娠中のダムは最初の麻酔ですし、頚椎脱臼により屠殺
2. 70パーセントエタノールで腹部を消毒する
3. 大規模な鉗子で、ちょうど乳首のラインの上に、正中線に沿って皮膚の小さなパスをつまんで、大きなハサミを使って鉗子の下に腹部を開きます。任意の内部構造を傷つけないように注意してくださいの
4. 腹部全体が開いているように、マウスの各側に向かって最初の開口部から横方向にカットするあなたのはさみを使用して、
5. 腸と余分な脂肪パッドはしばしば子宮を隠蔽したりすることができますし、これらは、子宮と卵巣の上部は両側に観察できるように脇に移動する必要があります
6. 卵巣下子宮の上部をつまんで、他の卵巣に子宮の一方の端からカット、脂肪から子宮を分離するためにあなたのはさみを使用して
7. 生理食塩水とペトリ皿の中であなたの鉗子と場所と子宮を持ち上げ

3。子宮から胚の除去

1. 余分な血液を除去し、外から余分な脂肪をトリミングする生理食塩水で子宮をすすぐ
2. 室温で清潔な皿に移す。可視化を改善するために生理食塩水Tyrodes
3. 実体顕微鏡を使用して、慎重に離れて子宮の皮に小さなハサミまたは必要に応じて細かい場合（＃5）鉗子のいずれかを使用してそれぞれの胚を区切ります。
<LI>胚ではないピアスに注意して、子宮壁と脱落膜と背面皮子宮壁との間の空間に微細な鉗子を挿入

4。胚からの脱落膜の除去

1. オリエント暗い部分（胎盤）はあなたから離れて手前にして脱落膜
2. あまりにも深く切らないように注意しながら、軽い部分から脱落膜の暗い部分を分ける線に沿って鉗子で切開を加えます
3. 栄養膜の円錐（EPC）を引き裂くように注意しながら、卵黄嚢の上から胎盤の分離を完了。この時点で、卵黄嚢にReicherts膜を可視化することができるはずです
4. ではないピアス卵黄嚢に注意して全体の脱落膜の（軽い部分）を削除し続けます
5. そっとつまみ、EPCから、それを離れて剥離によってReichertsを削除します。 EPCが損傷したり、卵黄嚢から分離されている場合は、胚はE8.5 - E9.5から正常にオンに失敗します。

5。文化システムのセットアップ

1. 胚の卵黄嚢に損傷を与えることなくピペッティングすることができるように、開口部の直径を大きくするハサミでプラスチック製トランスファーピペットの先端をカット
2. 胚あたりのメディアの1 mlのクリーンローラーボトルを埋める。 3月6日胚の最大が使用されてのローラーボトルの種類に応じて、それぞれのボトルにロードすることができます。
3. できるだけ少ないTyrodesとして繰り越し、メディア充填ローラーボトルに、カットのピペットを用いて胚のようにメディアを希薄化しないように転送する
4. ガラスのローラーボトルの上部にゴム製のプラグ（栓）を添付する
5. タイトなシールがプラグとドラムの間に形成されるようにローラー培養ドラムにローラーボトルを挿入
6. 一度、すべてのボトルが添付されており、ドラム内の任意の空のスロットは、wを封印されているi番目のゴム製ストッパー、ローラーを活性化
7. CO ₂とO ₂タンクを開き、出口弁1秒に泡を放出されるように、約2 psiにそれらを調整する。 E8.5 - E10胚の場合、20％O ₂および5％CO _2を使用する必要_があります。
8. インキュベーターを37に設定されていることを確認℃、覆ったり、胚を光から遮蔽されるようにインキュベーターを閉じる。
9. 胚はsomitiesのほか、回転の進行、および神経管の閉鎖の程度によって、その発展を評価するために定期的に点検してください
10. 文化の中で2〜3時間後に、薬理学的阻害剤または他の治療は、培地に添加することができます
11. 研究デザインは、車両や研究試薬の不活性類似体などのコントロールを含める必要があります。

6。全胚培養の後に開発を評価する

1. ガスの電源をオフにし、ローラーを停止し、インキュベーターからボトルを取り外し
2. タイロードに戻す胚を転送する実体顕微鏡下で評価のためのペトリ皿の中のsまたはPBS
3. 卵黄嚢は、風船のようなハートビートが見えるはずと心拍数が> 120分あたりの拍数、および流通が明らかでなければならないはず表示されます
4. 必要に応じて、卵黄嚢除去の前に写真の胚
5. EPCの近くに穴を切削し、胚の頭部と臀部を介して卵黄嚢と羊膜を反転させる胚から卵黄嚢を削除します。
6. 臍帯は、胚から卵黄嚢を分離するためにカットすることができます、と卵黄嚢は、必要に応じて胚を遺伝子型に使用することができます。
7. 体節の数と、オープン頭蓋ひだのような神経管欠損、顔面及び/またはオープン尾側神経孔の不完全閉鎖のための胚を調べます。胚は（複数の形態形成変化のタイラーの分類に応じてステージングできます遊んで住む/ home.htmlのをhttp://www.emouseatlas.org/~~V 、アゲイン）の写真記録を胚の開発に便利です。

7。ノート

1. どんなニックネームや卵黄嚢に涙が成功した転換を防ぎ、正常な発達を阻害するので、高品質の解剖は、不可欠です。 EPCは、ライヒェルトの膜（RM）の除去中に損傷することができる、とEPCが部分的にでも卵黄嚢から分離されている場合、胚は正常に発育しません。しかし、RMの不完全な除去胚は、および/またはRMセルを一緒に固執する原因となるには正常な発達を妨げるような、どちらも、文化に生い茂ると卵黄嚢の拡張を収縮させることができる。
2. 鈍いや曲がり鉗子の手順が著しく困難になるため、クリーンでシャープな鉗子は、良好な解剖を取得するための秘密です。楽器の蛋白質の堆積物は、組織の損傷につながる。
3. クリーン、無菌ガラスびんはまた、側壁に付着し、損傷から胚を防ぐために不可欠です。実験を開始する前に、ボトルには、SCRにする必要があります、石鹸と水でubbedのdH ₂ Oで洗浄し、水の沸騰するまで、各ボトルに少量の水でマイクロ波処理。瓶は、その後70％エタノールでリンスし、空気乾燥を許可されます。
4. 早く胚を培養培地に転送することができる、37に戻っ° Cより良い生存を暖めているため、可能な限り迅速に動作する。
5. それぞれの胚が胚の成長の矛盾の発生を防ぐために、同じ時間、室温になるようにローラーボトルに、任意の胚を転送する前に全体のゴミを解剖完了
6. 文化の細菌汚染を防ぐために無菌環境を維持する。私たちの培養実験は、抗生物質なしで行われますが、多くのラボでは、細菌の増殖を防ぐために、彼らのメディアへの抗生物質に追加されています。それは実験開始時だったので培地は実験終了時に明確に表示されます。メディアが白濁しているか、目に見える沈殿物がある場合は、CONがある可能性がありますあなたの文化に感染しているtamination。
7. 効果のないガス交換には、胚の発達を遅らせるので、連続的な配信を保証する信頼性の高いレギュレータを持っていることを確認することができます。
8. 胚は、ex vivoでの培養で約50％遅く、開発、従ってそれはあなたが実験の完了のための開発の適切な段階に達していることを保証するために体節を数えるために不可欠です。

8。代表的な結果：

胚の出現前後のローラーの培養は、図1に図示されています。解剖の時に、胚は尾が頭のひだの背後にあるあらゆる手段を設定した（図1A、D）で指定する必要があります。文化の36時間後、胚は、彼らは尾は頭部の前面（図1Bを、C、E、F）になっているC -カーブ、胎児の位置、になるように回し完了しておく必要があります。 RhoAのキナーゼ阻害剤（Y - 27632）、中に収斂伸長の既知の阻害剤と薬理学的操作神経胚形成（Ybot -ゴンザレス、2007）、それらの吻側 - 尾側軸に沿った胚の短縮の結果（図1E、F）および頭蓋神経襞閉鎖を阻害する。私たちのデータは、Y - 27632の増量は徐々に頭蓋倍クロージャを損なう（図2A）と下流型RhoAは頭蓋神経胚形成と収斂伸長におけるシグナル伝達の役割と一致して体の軸（図2B）を、短縮することを示している。

図1。薬理学的阻害剤Y - 27632と文化の胚と操作の外観。前の全胚培養へのE8.5で（、D）ディテールに秘められた胚（B、E）ローラーの文化の36hrsに続いて、まだそのまま卵黄嚢とE10での胚。 （C、F）卵黄嚢が成功した転機と神経管閉鎖を説明するために削除されています。 Rhoキナーゼ阻害剤Y - 27632（E、F）で処理した胚は、適切な収斂伸長を受け、説明するために失敗しました。短縮体軸。

図2。頭部神経管閉鎖と軸の伸長に対するRhoAのキナーゼ阻害剤の効果。 （A）その頭蓋ひだ（％NTC =パーセンテージ神経管閉鎖）を正常に閉じることができた胚の割合は、培養培地に添加Y - 27632の投与量と比較されます。 （B）耳胞と前肢の間の距離が大幅にY - 27632の増量（P <0.05）で減少した。

Discussion

その開発中に胚に固有なものから母体、子宮内の要因を分離する能力は、胚発生の全段階を研究するための重要なツールです。ここでは、それによって薬剤の母体の代謝の変数を削除し、頭蓋神経胚形成の元の子宮内でのRhoAのキナーゼの小分子阻害剤の効果を分析した。この薬理学的操作では、頭蓋神経胚形成と収斂伸長に大きな影響を与える。この化合物に対する感受性が異なる遺伝的変異マウスの間で比較することができます。ここで紹介する方法は、試薬のさまざまな方法を使って胚の細胞機能を直接操作できるように、開発中の他の分子経路の研究にも適用できます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope for Dissection	Leica Microsystems	M165
Precision Incubator	BTC Engineering	BTC 001
Rotating Bottle Culture Unit	BTC Engineering	BTC 003
Glass Bottles for Rotating Unit	BTC Engineering	BTC 005
Silicone Rubber Bung	BTC Engineering	BTC 007
Silicone Rubber Cork	BTC Engineering	BTC 008
Gas Bubbler Inlet	BTC Engineering	BTC 012
Gas Bubbler Inlet Trap	BTC Engineering	BTC 013
Gas Bubbler Outlet	BTC Engineering	BTC 014
Gas Cylinder	Tech Air		20% O2, 5% CO2
Gas Regulator	Tech Air
Male Rat Serum	Harlan Laboratories	4520
DMEM w/o phenol red	Invitrogen	31053
10 mL Syringe	BD Biosciences	309604
Syringe Filter	Nalge Nunc international	190-2545
Large Dissecting Scissors (Blunt tip)	VWR international	82027-594
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Dumot #5 forceps	Fine Science Tools	11252-50
Tyrode’s Saline			As described in Cockroft 1990
10 cm Disposable Petri Dish	BD Biosciences	351029