Summary
Anne metabolizma atlar neurulation sırasında, fare embriyo doğrudan farmakolojik manipülasyonu için izin veren bir yöntem açıklanmıştır. Bu teknik, zaman noktası ve farmakolojik ajan değişen neurulation farklı yönlerini incelemek için adapte edilebilir.
Abstract
Genetik fare modelleri memeli nöral tüp kapanması çalışmada önemli bir araçtır (Gray & Ross, 2009; Ross, 2010). Ancak, in utero çalışmada fare embriyo doğrudan farmakolojik ilgi reaktif anne metabolizma etkileri izolasyon embriyoların işlemek için yetersizlik ile sınırlıdır. Onları embriyo ulaşmasını engel olabilecek vücut savunma çeşitli diyet yoluyla ya da enjeksiyon yoluyla, küçük bir molekülü, rekombinant protein veya siRNA, bu maddelerin anneye teslim olsun bu kararsız bileşikler tabi olacaktır. Bütün embriyolar kültürlerini geliştirme içsel fetal etkilerinin anne ayrı soruşturmalar kullanılabilir.
Burada, Diseksiyon sonra normal nöral tüp kapanması (Crockett, 1990) için izin veren bir rulo inkübatör cihazları zenginleştirilmiş medyayı kullanarak kültür fare embriyoları için bir yöntem sunuyoruz. Kültür, embriyolargeleneksel embriyoların hala in utero, aksi takdirde mümkün olmazdı in vitro teknikleri kullanarak manipüle edilebilir. Embriyo kardeşler (kranial ve kaudal kat neuropore sonuca E9.5-10 E7-7.5 oluşan neurulation (neurulation başlangıcından hemen önce nöral plak oluşumu,) farklı yönlerini incelemek için çeşitli zaman noktalarında toplanan olabilir kapatılması, Kaufman, 1992). Bu protokol, kranial neurulation çalışma için en uygun timepoints embriyolar diseksiyon yöntemi göstermektedir. Embriyolar, nöral tüp kapatma başladıktan sonra değil, öncesinde embriyo torna ve kranial sinir kat kapatılması, E8.5 (yaklaşık 10-12 somities) disseke ve E10 (26-28 somities) kadar kültürünü muhafaza olacak, kranial neurulation tamamlanmış olmalıdır.
Protocol
1. Kültür ortamının hazırlanması - Tüm reaktifler Tablo 1'de yer alan
- 37 çözülme erkek sıçan serum ° C
- 30 dakika için 55 sıçan serum Isı İnaktivasyon ° C
- Oda sıcaklığında 5 dakika 10K Santrifüj sıçan serum
- Fenol-kırmızı ücretsiz DMEM w / Yüksek Glikoz supernatant ve karıştırın 50:50 çıkarın
- 0.45 um şırınga filtresi kullanarak medya sterilize
- Medya / embriyonun en az 1ml hazırlanmalıdır
2. Hamile baraj rahim izolasyonu
- Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış prosedürlerini kullanarak, hamile baraj ilk anestezi ve sonra servikal dislokasyon ile sakrifiye
- Karın% 70 EtOH ile sterilize
- Büyük forseps ile sadece meme çizgi üstü, orta hat boyunca küçük bir deri yolu sıkın ve büyük bir makas ile forseps altındaki karın açmak. Herhangi bir iç yapıya zarar vermemek için dikkatli oluns
- Tüm karın açık olduğu için, farenin her iki tarafa doğru ilk açılışında yanal kesmek için makas kullanın.
- Bağırsaklar ve aşırı yağ pedler genellikle rahim belirsiz olabilir ve bu rahim ve yumurtalıkların üst her iki tarafında görülebilir, böylece kenara hareket ettirilmelidir
- Yumurtalıklar altında rahim üst sıkın ve rahim rahim bir ucundan diğer yumurtalık kesme, yağ ayırmak için makas kullanmak
- Petri kabındaki tuzlu su ile forseps ve yeri ile rahim dışına kaldırın
3. Embriyolar rahim çıkarılması
- Herhangi bir aşırı kan kaldırmak ve dışarıdan herhangi bir aşırı yağ kırpmak için, tuzlu su ile rahim durulayın
- Oda sıcaklığında temiz bir çanak aktarın. Görselleştirme artırmak için tuzlu Tyrodes
- Bir stereomikroskopta kullanarak, dikkatli rahim dışında kabuğu, küçük bir makas ya da gerekli para cezası (# 5) forseps ya kullanarak her bir embriyo ayırın. <li> delmek embriyo dikkatli olmak, rahim duvarı ve desidua arasındaki boşluğa ve rahim duvarına geri kabuğu ince forseps Ekle
4. Embriyolardan desidua kaldırılması
- Orient desidua karanlık bölümü (plasenta) size dönük olduğunu
- Forseps ile hafif kısmı desidua karanlık bölümünü birbirinden ayıran hat boyunca bir kesi yapmak çok derin kesmek için dikkatli olmak,
- Ectoplacental konisi (EPC) gözyaşı dikkatli olmak, yolk kesesi üst plasenta ayrılması tamamlayın. Bu noktada yolk kesesi Reicherts zarı görselleştirmek için gerekir
- (Hafif kısmını) delmek sarısı kesesi dikkatli olmanın tüm desidua kaldırmak için devam edin
- Yavaşça çimdik ve EPC uzak soyma tarafından Reicherts kaldırmak. EPC hasarlı veya yolk kesesi ayrılmış ise, embriyoların normal E8.5-E9.5 açmak için başarısız olur
5. Kültür sistemi kurmak
- Bir embriyo, yolk kesesi zarar vermeden pipetlenebilir böylece açılması çapını artırmak için makas ile plastik bir transfer pipet ucu
- Medya embriyo ortalama 1 ml temiz silindir şişe doldurun. 3-6 embriyo en fazla kullanılan silindir şişe türüne bağlı olarak, her bir şişe yüklenebilir.
- Medya dolu silindir şişe kesim pipet kullanarak mümkün olduğunca az Tyrodes olarak üzerinde taşıyan embriyolar olarak medya sulandırmak için aktarma
- Kauçuk, cam rulo şişe üst fişini takın (tapa)
- Böylece sıkı bir mühür, fiş ve tambur arasında oluşan silindir kültür davul içine silindir şişe yerleştirin
- Tüm şişeleri bir kez takıldıktan ve davul herhangi bir boş yuva w mühürlü edilmiştiri. lastik tıpa, rulo etkinleştirin
- CO 2 ve O 2 tank açın ve böylece çıkış vanası saniyede bir kabarcık bırakmadan, yaklaşık 2 psi ayarlayabilirsiniz. E8.5-E10 embriyolar için,% 20 O 2 ve% 5 CO 2 kullanılmalıdır.
- Inkübatör 37 ayarlanmış olduğundan emin olun ° C ve kapağı veya embriyolar ışıktan korumalı olduğu için inkübatör yakın.
- Embriyolar, somities Ayrıca, ilerlemesi dönüm ve nöral tüp kapanması ölçüde onların gelişimini değerlendirmek için periyodik olarak kontrol edilmelidir
- 2-3 saat sonra kültür, medya farmakolojik inhibitörleri ya da diğer tedaviler eklenebilir
- Çalışmanın tasarımı, araç veya çalışma reaktifi inaktif analogları gibi kontroller, içermelidir.
6. Bütün embriyo kültür sonraki gelişimi değerlendirilmesi
- Gazı kapatın, rulo durdurmak, ve inkübatör şişe kaldırmak
- Transferi embriyolar geri Tyrodestereomicroscope altında değerlendirilmesi için bir Petri kabındaki veya PBS
- Yolk kesesi> 120 dakika başına atışlarda ve dolaşım belirgin olmalı, bir kalp atışı görünür ve kalp hızı olmalı, balon gibi görünmelidir
- Fotoğraf embriyolar önce yolk kesesi kaldırılması için gerekirse
- EPC yakın bir delik kesme ve embriyonun baş ve kıç üzerine yumurta sarısı kesesi ve amniyon saygısız embriyo yolk kesesi çıkarın.
- Yolk kesesi embriyo ayrı kesilmiş göbek kordonu ve yolk kesesi embriyo gerekirse genotipleme için kullanılabilir.
- Hücre gruplarının sayısı ve açık kafatası kıvrımları, yüz ve / veya açık bir kaudal neuropore eksik kapatılması gibi nöral tüp defekti, embriyo inceleyin. Çok morfogenetik değişiklikleri Theiler sınıflandırma (göre sahnelenen Embriyolar olabilir eMap / anasayfa.html http://www.emouseatlas.org/ Tekrar), fotoğrafik bir rekorembriyo gelişimi yararlıdır.
7. Notlar
- Herhangi bir nick veya yolk kesesi gözyaşları başarılı dönüm önlemek ve normal gelişimini engeller, çünkü yüksek kaliteli diseksiyonu esastır. EPC Reichert membran (RM) çıkarılması sırasında zarar ve EPC kısmen de olsa yolk kesesi ayrılmış ise, embriyoların normal gelişmez. Ancak, RM eksik kaldırma embriyolar veya RM hücreler kültür ortamında büyümek ve yolk kesesi genişlemesi, her ikisi de normal gelişimini önlemek sıkmak birbirine yapışmasına ve / neden olabilir.
- Temiz ve keskin bir forseps, mat ya da katlanmasını forseps prosedür çok daha zor hale getirir, çünkü iyi bir diseksiyon almak için gizli. Enstrümanlar Protein yatakları, doku hasarına yol açacaktır.
- Temiz, steril cam şişeler de embriyolar yan duvarına yapışmasını ve zarar görmesini önlemek için gereklidir. Deney başlamadan önce, şişeler scr olmalıdır, ubbed dH 2 O sabun ve su ile durulanır, ve her şişede su kaynar kadar küçük bir miktar su ile mikro. Şişeler, daha sonra% 70 EtOH ile durulanır ve kuru hava için izin verilir.
- Embriyo kültür ortamları ne kadar erken transfer edilebilir ve 37 ° C daha iyi sağkalım geri ısındı çünkü, mümkün olduğunca çabuk çalışın.
- Her embriyo zaman aynı miktar için herhangi bir embriyonun büyüme farklılıklar yaratarak önlemek için oda sıcaklığında, böylece silindir şişe herhangi bir embriyolar transfer olmadan önce tüm çöp diseksiyon tamamlayın
- Kültürleri bakteriyel kontaminasyonu önlemek için steril bir ortam sağlama. Bizim kültür deneyler antibiyotik yapılır ama bakteri gelişimini engellemek için birçok laboratuvar medya antibiyotik eklemek var. Deneyin başında olduğu gibi orta deney sonunda net olarak görünür. Medya bulutlu haline gelmiştir veya görünür bir çökelti varsa, con muhtemeldir.kültür bulaşmış tamination.
- Etkisiz gaz alışverişi embriyoların gelişimi geciktirebilir, bu nedenle sürekli olarak yayınlanmasını sağlayacak güvenilir bir düzenleyici olduğundan emin olabilirsiniz.
- Embriyolar ex vivo kültür yaklaşık% 50 daha yavaş gelişir, bu nedenle deney tamamlanması için uygun gelişme aşamasına ulaşmış olmasını sağlamak için Somitlerin saymak esastır.
8. Temsilcisi sonuçları:
Embriyoların görünümü öncesi ve sonrası rulo kültürü Şekil 1'de gösterilmiştir. Diseksiyon zamanda, embriyolar, kuyruk, baş kıvrımları arkasında bir bütün yolları yapılandırma (Şekil 1A, D) olmalıdır. Kültür ortamında 36 saat sonra, embriyolar kuyruk başın önünde (Şekil 1B, C, E, F) C-eğri, cenin pozisyonunda olduğunu dönüm tamamlanmış olması gerekir. Farmakolojik manipulasyon sırasında yakınsak uzantısı bilinen bir inhibitörü RhoA kinaz inhibitörü (Y-27.632)neurulation (Ybot-Gonzalez, 2007), embriyo ve rostral-kaudal ekseni boyunca (Şekil 1E, F) kranial sinir kat kapatılması engeller bir kısalma sonuçları. Bizim verilerimiz, kademeli olarak artan dozlarda Y-27.632 kafatası kat kapatılması bozar (Şekil 2A) ve mansap RhoA kafatası neurulation ve yakınsak uzatma sinyali rolü ile tutarlı vücut ekseni (Şekil 2B) kısaltır.
Şekil 1 farmakolojik inhibitörü Y-27.632 ile kültürler embriyoların ve manipülasyon görünümü. Önce (A, D) bütün embriyo kültürü E8.5 Dissected embriyolar (B, E) yolk sac rulo kültür 36hrs hala bozulmamış, sonraki E10 Embriyolar. (C, F) yolk kesesi, başarılı torna ve nöral tüp kapanması göstermek için kaldırıldı. Rho kinaz inhibitörü Y-27.632 (E, F) ile tedavi edildi Embriyolar geçmesi ve düzgün yakınsak uzatma göstermek için başarısız oldukısaltılmış bir vücut ekseni.
Şekil 2. kranial nöral tüp kapanması ve eksen uzama RhoA kinaz inhibitörü etkisi. (A) Y-27.632 doz yüzdesi (% NTC = yüzde nöral tüp kapanması) kafatası kıvrımları başarıyla kapatmak için mümkün olan embriyoların karşılaştırıldığında kültür ortamı ekledi. (B) otik vezikül ve ön ayakları arasındaki mesafe, artan dozlarda Y-27.632 (p <.05) önemli ölçüde azalmıştır.
Discussion
Embriyo gelişimi sırasında içsel anne, intrauterin faktörler ayrı yetenek embriyogenez tüm aşamalarında eğitim için önemli bir araçtır. İşte biz böylece ilacın anne metabolizma değişken çıkarırken kafatası neurulation ex utero RhoA kinaz küçük bir moleküldür inhibitörü olan etkilerini analiz ettik. Bu farmakolojik manipülasyon, kafatası neurulation ve yakınsak uzantısı üzerinde derin bir etkisi vardır. Bu bileşiğin Duyarlılık farklı genetik fare mutantlar arasında mukayese edilebilir. Burada sunulan yöntem, diğer moleküler geliştirme yollarının çalışmalar, çeşitli reaktifleri kullanılarak embriyolar hücresel fonksiyonunun doğrudan manipülasyon izin de uygulanabilir olabilir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
A. Hadjantonakis (Sloan-Kettering Enstitüsü) ve L. Niswander (Colorado-Denver U) laboratuvar laboratuar Biz diseksiyonu ve kültür teknikleri ile yararlı öneriler için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, L. Niswander ve J. Nadeau (Sistem Biyolojisi Enstitüsü) ile işbirliği içinde MER'e JDG ve RO1NS05897 NRSA NS059562 tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope for Dissection | Leica Microsystems | M165 | |
| Precision Incubator | BTC Engineering | BTC 001 | |
| Rotating Bottle Culture Unit | BTC Engineering | BTC 003 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | BTC Engineering | BTC 005 | |
| Silicone Rubber Bung | BTC Engineering | BTC 007 | |
| Silicone Rubber Cork | BTC Engineering | BTC 008 | |
| Gas Bubbler Inlet | BTC Engineering | BTC 012 | |
| Gas Bubbler Inlet Trap | BTC Engineering | BTC 013 | |
| Gas Bubbler Outlet | BTC Engineering | BTC 014 | |
| Gas Cylinder | Tech Air | 20% O2, 5% CO2 | |
| Gas Regulator | Tech Air | ||
| Male Rat Serum | Harlan Laboratories | 4520 | |
| DMEM w/o phenol red | Invitrogen | 31053 | |
| 10 mL Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe Filter | Nalge Nunc international | 190-2545 | |
| Large Dissecting Scissors (Blunt tip) | VWR international | 82027-594 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dumot #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Tyrode’s Saline | As described in Cockroft 1990 | ||
| 10 cm Disposable Petri Dish | BD Biosciences | 351029 |
References
- Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. (1990).
- Gray, J. D., Ross, M. E. Mechanistic insights into folate supplementation from Crooked tail and other NTD-prone mutant mice. Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 85, 314-321 (2009).
- Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. , Academic Press Limited. San Diego. (1992).
- Ybot-Gonzalez, P., Savery, D., Gerrelli, D., Signore, M., Mitchell, C. E., Faux, C. H., Greene, N. D., Copp, A. J. Convergent extension, planar-cell-polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure. Development. 134, 789-799 (2007).
- Ross, M. E. Gene-environment interactions, folate metabolism and the embryonic nervous system. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2, 471-480 (2010).
