Neuralrørsdefekter Lukning i mus Hele Embryo Kultur

Summary

En metode giver mulighed for direkte farmakologisk manipulation af mus fostre under neurulation, der omgår maternel stofskifte er beskrevet. Teknikken kan tilpasses til at studere forskellige aspekter af neurulation ved at variere det tidspunkt og farmakologiske agent.

Abstract

Genetiske musemodeller er et vigtigt redskab i studiet af pattedyr neuralrøret lukning (Gray & Ross, 2009; Ross, 2010). Dog er studiet af musen embryoner i livmoderen begrænset af vores manglende evne til at direkte farmakologisk manipulere embryoner isoleret fra virkningerne af moderens stofskifte på reagens af interesse. Uanset om ved hjælp af et lille molekyle, rekombinant protein eller siRNA, levering af disse stoffer til moderen, gennem kosten eller ved injektion vil underlægge disse ustabile forbindelser til en række kropslige forsvar, der kunne forhindre dem i at nå fosteret. Undersøgelser i kulturer af hele embryoner kan bruges til at adskille moderen fra indre føtale effekter på udviklingen.

Her præsenteres en metode til dyrkning mus embryoner ved hjælp af højt beriget medier i en rulle inkubator apparat, der giver mulighed for en normal neuralrørsdefekter lukning efter dissektion (Crockett, 1990). Når du er i kulturen, embryoner kanblive manipuleret ved hjælp af konventionelle in vitro teknikker, som ellers ikke ville være mulig, hvis embryoner stadig var i livmoderen. Embryo søskende kan afhentes ved forskellige tidspunkter for at studere forskellige aspekter af neurulation, der opstår fra E7-7.5 (neurale plade dannelse, umiddelbart forud for indledningen af ​​neurulation) til E9.5-10 (ved afslutningen af ​​kranie gange og caudal neuropore lukning, Kaufman, 1992). I denne protokol, viser vi vores metode til at dissekere embryoner på tidspunkter, der er optimale for studiet af kranie neurulation. Embryoner vil blive dissekeret på E8.5 (ca. 10-12 somities), efter indledningen af ​​neuralrøret lukning, men forud for embryo drejning og kranielle neurale fold lukning, og vedligeholdes i kultur indtil E10 (26-28 somities), når kranie neurulation skal være komplet.

Protocol

1. Udarbejdelse af kultur medier - alle reagenser er angivet i tabel 1

1. Optø hanrotter serum ved 37 ° C.
2. Heat-inaktivere rotte serum i 30 minutter ved 55 ° C
3. Centrifugér rotte serum i 10K i 5 minutter ved stuetemperatur
4. Fjern supernatanten og bland 50:50 med phenol-røde fri DMEM m / Høj Glucose
5. Sterilisere mediet ved hjælp af et 0,45 um sprøjte filter
6. Mindst 1 ml af medier / embryo bør udarbejdes

2. Isolering af livmoderen fra den gravide mor

1. Ved hjælp af procedurer, der er godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC), den gravide mor er først bedøvet og derefter ofret ved dislokation af halsen
2. Sterilisere maven med 70% EtOH
3. Klem en lille sti af huden langs midterlinjen, lige over brystvorten linje, med store pincet og åbne maven under dine pincet med store sakse. Vær forsigtig ikke at beskadige nogen intern strukturs
4. Brug din saks til at skære lateralt fra den indledende åbning mod hver side af musen, så hele underlivet er åben
5. Tarme og overskydende fedt pads kan ofte obskure livmoderen, og disse bør flyttes til side, så toppen af ​​livmoderen og æggestokkene kan observeres på hver side
6. Knib toppen af ​​livmoderen under æggestokke og brug din saks til at adskille livmoderen fra fedt, skære fra den ene ende af livmoderen til den anden æggestok
7. Løft livmoderen med pincet og placeres i en petriskål med saltvand

3. Fjernelse af embryoner fra livmoderen

1. Skyl livmoderen med saltvand for at fjerne overskydende blod og trim overskydende fedt fra ydersiden
2. Overførsel til et rent fad med plads temp. Tyrodes saltvand for at forbedre visualisering
3. Ved hjælp af et stereomikroskop, Hvert embryon ved hjælp af enten en lille saks, eller hvis det er nødvendigt fine (# 5) pincet til at forsigtigt livmoderen fra hinanden adskilt.
<li> Indsæt fine tang ind i rummet mellem livmodervæggen og decidua og skræl tilbage livmodervæggen, og pas på ikke at stikke gennem embryo

4. Fjernelse af decidua fra embryoner

1. Vend decidua så den mørkere del (placenta) vender væk fra dig
2. Lav et snit med din tang langs den linje, der adskiller den mørke del af decidua fra den lettere del, og pas på ikke at skære for dybt
3. Komplet adskillelsen af ​​moderkagen fra toppen af ​​blommesækken, pas på ikke at rive ectoplacental kegle (EPC). På dette tidspunkt skulle du være i stand til at visualisere Reicherts membranen på blommesækken
4. Fortsæt med at fjerne hele decidua (lysere del) Pas på ikke at gennembore blommesækken
5. Klem forsigtigt og fjern Reicherts ved at trække den væk fra EPC. Hvis EPC er beskadiget eller adskilt fra blommesækken, vil embryoner undlader at vende normalt fra E8.5, E9.5

5. Opsætning af kultur-systemet

1. Klip enden af ​​en plastik overførselspipetten med en saks for at øge diameteren af ​​den åbning, således at et foster kan pipetteret uden at beskadige blommesækken
2. Fyld rent rullen flasker med 1 ml af medier pr foster. Afhængigt af hvilken type valse flasker brugt højst på 3-6 embryoner kan lægges i hver flaske.
3. Overfør embryoner ved hjælp af din skåret pipette til medierne fyldt rulle flaske, der rummer over så lidt Tyrodes som muligt, så for ikke at udvande medierne
4. Sæt gummiproppen (prop) til toppen af ​​glasset rulle flasken
5. Sæt rullen flasker ind i rullen kultur tromlen, således at en tæt forsegling er dannet mellem stikket og tromlen
6. Når alle flaskerne er blevet tilknyttet, og eventuelle tomme pladser i tromlen er blevet forseglet wed gummi propper, aktivere valsen
7. Åbn CO ₂ og O ₂ tanke og justere dem til omkring 2 psi, så udløbsventilen er frigive en boble i sekundet. For E8.5-E10 embryoner, skal 20% O ₂ og 5% CO ₂ anvendes.
8. Sørg for, at kuvøsen er indstillet til 37 ° C og dække eller lukke inkubatoren, således at embryonerne beskyttet mod lys.
9. Embryoner bør kontrolleres jævnligt for at vurdere deres udvikling ved tilsætning af somities, progression af at dreje, og omfanget af neuralrøret lukning
10. Efter 2-3 timer i kultur, kan farmakologiske hæmmere eller andre behandlinger blive tilføjet til medierne
11. Undersøgelsen design bør inkludere kontroller, såsom køretøjets eller inaktiv analoger af undersøgelsen reagens.

6. Evaluering af udviklingen efter hele embryo kultur

1. Sluk for gassen, stop rulle, og fjerne flasker fra inkubator
2. Overførsel embryoner tilbage til Tyrodes eller PBS i en petriskål til evaluering efter stereomikroskopet
3. Blommesækken skal vises ballon-lignende, et hjerteslag skal være synlig og pulsen bør være> 120 slag per minut, og omløb bør være tydelig
4. Foto embryoner før blommesækken udvisning, hvis nødvendigt
5. Fjern blommesækken fra foster ved at skære et hul nær EPC og spejlvende blommesækken og fosterhinden over hovedet og lår af fostrene.
6. Navlestrengen kan skæres at adskille blommesækken fra embryon, og blommesækken kan anvendes til genotypning embryoet hvis det er nødvendigt.
7. Undersøg embryo for somite nummer og neuralrørsdefekter, såsom åbne kranielle folder, ufuldstændig lukning af ansigt og / eller en åben caudale neuropore. Embryoner kan iscenesættes i henhold til Theiler klassificeringen af flere morfogenetiske ændringer ( http://www.emouseatlas.org/ EMAP / home.html ) Igen, en fotografisk registrering afembryo udvikling er nyttig.

7. Noter

1. En høj kvalitet dissektion er afgørende, fordi enhver nick eller tårer i blommesækken vil forhindre vellykket dreje og hæmme normal udvikling. EPC kan også blive beskadiget under fjernelsen af ​​Reichert er membran (RM), og hvis EPC er endnu delvist adskilt fra blommesækken, vil fostre ikke udvikle sig normalt. Dog kan en ufuldstændig fjernelse af RM årsagen embryoner til at hænge sammen og / eller RM celler kan overgrow i kultur og snøre blommesækken ekspansion, som begge ville forhindre normal udvikling.
2. Rene og skarpe pincet er hemmeligheden til at få en god dissektion, fordi sløve eller bøjet pincet gøre proceduren betydeligt vanskeligere. Protein indskud på instrumenter vil føre til vævsskader.
3. Ren, sterile glasflasker er også afgørende for at undgå embryoner klistrer til sidevæggen og blive beskadiget. Før igangsættelse af forsøget bør flasker være scrubbed med sæbe og vand, skylles i dH ₂ O, og microwaved med en lille mængde vand i hver flaske, indtil vandet koger. Flasker er derefter skylles med 70% EtOH og lov til at lufttørre.
4. Arbejde så hurtigt som muligt, fordi jo før jo embryo kan overføres til den kultur, medier og varmede tilbage til 37 ° C bedre overlevelse.
5. Komplet dissekere hele kuldet, inden du overfører nogen embryoner til at rulle flasker, så hver embryo er ved stuetemperatur i den samme mængde tid for at undgå at skabe eventuelle uoverensstemmelser i embryo vækst
6. Oprethold et sterilt miljø for at forhindre bakteriel forurening af kulturer. Vores kultur eksperimenter er blevet udført uden antibiotika, men mange laboratorier tilføje antibiotika til deres medier, for at undgå bakterievækst. De mellemlange skal vises så klar i slutningen af ​​eksperimentet, som den var i begyndelsen af ​​eksperimentet. Hvis medier er blevet uklar eller der er et synligt bundfald, er der sandsynligvis en conminering, der har inficeret din kultur.
7. Ineffektiv gasbørs kan også forsinke fostre udvikling, så sørg for at have en pålidelig regulator, der vil sikre en kontinuerlig levering.
8. Embryoner udvikle omkring 50% langsommere i ex vivo kultur, derfor er det vigtigt at tælle somites at sikre, at du har nået et passende stadium i udviklingen for afslutningen af forsøget.

8. Repræsentative resultater:

Fremkomsten af ​​embryoner præ-og post-Roller kultur er illustreret i figur 1. På tidspunktet for dissektion, bør embryoner være i et uvendt konfiguration (Fig. 1A, D), hvor halen er bag hovedet folder. Efter 36 timer i kultur, skulle fostre er afsluttet drejning, så de er i C-buede, fosterstilling, hvor halen er i forreste del af hovedet (Fig 1B, C, E, F). Farmakologisk manipulation med RhoA kinase hæmmer (Y-27632), en kendt hæmmer af konvergent forlængelse underneurulation (Ybot-Gonzalez, 2007), resulterer i en afkortning af embryoner langs deres rostralt-caudale akse (fig. 1E, F) og hæmmer kranielle neural fold lukning. Vores data viser, at stigende doser af Y-27632 gradvist svækker kraniel fold lukning (Figur 2A) og forkorter kroppens akse (Fig. 2B), i overensstemmelse med den rolle downstream RhoA signalering i kranielle neurulation og konvergent forlængelse.

Figur 1. Udseende kulturer embryoner og manipulation med den farmakologiske inhibitor Y-27632. (A, D) dissekeret embryoner på E8.5 forud for hele embryo kultur (B, E) Embryoner på E10 med blommesækken stadig er intakt, efter at 36hrs af rulle kultur. (C, F) blommesækken er blevet fjernet for at illustrere succesfulde drejning og neuralrøret lukning. Fostre, der blev behandlet med Rho kinase inhibitor Y-27632 (E, F) undlod at gennemgå ordentlig konvergerende udvidelse og illustrereen forkortet krop akse.

Figur 2. Effekt af RhoA kinase inhibitor på kraniel neuralrørsdefekter lukning og akse forlængelse. (A) Den procentdel af embryoner, der var i stand til at lukke deres kranie folder (% NTC = procentdel neuralrørsdefekter lukning) er sammenlignet med den dosis af Y-27632 føjet til kultur medier. (B) Afstanden mellem de eksotiske vesikel og forelimb blev reduceret signifikant ved stigende doser af Y-27632 (p <0,05).

Discussion

Evnen til at adskille moderen, intrauterin faktorer fra dem, der er uløseligt forbundet med embryo i løbet af dets udvikling er et vigtigt redskab til at studere alle faser af embryogenese. Her har vi analyseret effekten af et lille molekyle hæmmer af RhoA kinase om kraniel neurulation ex livmoderen og derved fjerne den variable af maternelle metabolisme af lægemidlet. Denne farmakologiske manipulation har en dybtgående indvirkning på kraniel neurulation og konvergent forlængelse. Følsomhed over for dette stof kan sammenlignes mellem forskellige genetiske musen mutanter. Metoden præsenteres her kan også anvendes til studier af andre molekylære veje i udviklingen, så den direkte manipulation af cellulære funktion i fostre ved hjælp af forskellige reagenser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope for Dissection	Leica Microsystems	M165
Precision Incubator	BTC Engineering	BTC 001
Rotating Bottle Culture Unit	BTC Engineering	BTC 003
Glass Bottles for Rotating Unit	BTC Engineering	BTC 005
Silicone Rubber Bung	BTC Engineering	BTC 007
Silicone Rubber Cork	BTC Engineering	BTC 008
Gas Bubbler Inlet	BTC Engineering	BTC 012
Gas Bubbler Inlet Trap	BTC Engineering	BTC 013
Gas Bubbler Outlet	BTC Engineering	BTC 014
Gas Cylinder	Tech Air		20% O2, 5% CO2
Gas Regulator	Tech Air
Male Rat Serum	Harlan Laboratories	4520
DMEM w/o phenol red	Invitrogen	31053
10 mL Syringe	BD Biosciences	309604
Syringe Filter	Nalge Nunc international	190-2545
Large Dissecting Scissors (Blunt tip)	VWR international	82027-594
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Dumot #5 forceps	Fine Science Tools	11252-50
Tyrode’s Saline			As described in Cockroft 1990
10 cm Disposable Petri Dish	BD Biosciences	351029