Profiling di potassio voltaggio-dipendenti espressione di mRNA nei neuroni Canale nigral con singola cella di RT-PCR Tecniche

Summary

I neuroni vengono prima caratterizzata elettrofisiologico. Poi il citoplasma dal neurone registrato è aspirato e sottoposto a trascrizione inversa-PCR per rilevare l'espressione di mRNA per la sintesi degli enzimi dei neurotrasmettitori, canali ionici e recettori.

Abstract

Nel sistema nervoso centrale dei mammiferi, i diversi tipi di neuroni con diverse caratteristiche molecolari e funzionali sono mescolate tra loro, difficili da separare e anche non facilmente identificabili per la loro morfologia. Così, è spesso difficile analizzare l'espressione genica in un tipo specifico neurone. Qui documento di una procedura che combina a cellula intera tecniche di registrazione di patch clamp con cella singola invertire reazione a catena della polimerasi della trascrizione (SCRT-PCR) per profilo di espressione di mRNA in diversi tipi di neuroni nel nigra sostanziale. Tecniche elettrofisiologiche vengono prima utilizzate per registrare le proprietà neurofisiologiche e funzionali dei singoli neuroni. Poi, il citoplasma di singoli neuroni elettrofisiologico caratterizzato nigral è aspirato e sottoposto a SCRT-PCR per ottenere profili di espressione di mRNA per la sintesi degli enzimi dei neurotrasmettitori, recettori e canali ionici. L'elevata selettività e sensibilità rendono questo metodo particolarmente utile quando l'immunoistochimica non può essere utilizzata a causa della mancanza di anticorpi adatti o basso livello di espressione della proteina. Questo metodo è applicabile anche a neuroni in altre aree cerebrali.

Protocol

1. Cervello fetta preparazione

1. Giovani (15-40 giorni di età) maschili e femminili ratti Sprague-Dawley sono utilizzati. (Abbiamo anche utilizzare questo protocollo stesso nei topi.) Sotto anestesia uretano profondo, gli animali sono decapitati e il cervello è rapidamente sezionati fuori. Di 300 micron di spessore fette coronali del cervello che contiene la parte midrostral della substantia nigra sono tagliati su un vibratome Leica (VT-1200S). La fetta di taglio procedura viene eseguita in una gelida, saccarosio ossigenato di taglio soluzione contenente (in mm): 220 saccarosio, 2.5 KCl, 1,25 NaH ₂ PO _4, 25 NaHCO _3, 0,5 CaCl _2, 7 MgCl _2, 10 D- glucosio. Si tratta di bolle con una miscela di 95% di CO O ₂ / 5% da ₂ a mantenere ossigenato e mantenere il pH a 7,4. Mantenere la soluzione di taglio ghiacciato durante tutta la procedura.
2. Le sezioni di cervello sono incubati in una camera di incubazione riempiti con un liquido artificiale ossigenato cerebrospinale (aCSF) contenente (in mm): 125 NaCl, 2.5 KCl, 1,25 NaH ₂ PO _4, 25 NaHCO _3, 2,5 CaCl _2, 1,3 MgCl _2, 10 D-glucosio. Si tratta di bolle con una miscela di 95% di CO O ₂ / 5% da ₂ a mantenere ossigenato e mantenere il pH a 7,4. La temperatura di incubazione è di 34 ° C per 45 min e poi a temperatura ambiente fino a quando la fetta cervello è trasferita nella camera di registrazione.

2. Fingerprinting elettrofisiologiche dei neuroni nigral

1. Una fetta cervello è trasferito in una camera di registrazione di patch clamp continuamente perfuso con la aCSF ossigenato a 32 ° C.
2. Pipette di patch sono prelevate dalla autoclave borosilicato (KG-33) tubo capillare di vetro (1,10 mm di diametro, 1,65 mm di diametro, il re di precisione Vetro, Claremont, CA) utilizzando un PC-10 estrattore (Narishige, Tokyo, Giappone) e riempite con soluzione intracellulare preparati con DNase RNase-free-acqua (Fisher Scientific) (contenente 135 mM KCl, 0,5 mM EGTA, 10 HEPES mM, 1,5 mM MgCl _2, pH regolato a 7,3). Le pipette patch sono resistenze di 2-3 MΩ nella vasca da bagno.
3. Substantia nigra è identificata in base alla sua posizione anatomica distinti (Fig. 1A1-2). Sotto la guida visiva di un microscopio video (Olympus BX51W1) dotata di ottiche Nomarski e 60X lente immersione in acqua, grandi cellule nella substantia nigra pars compacta (SNC) e substantia nigra pars reticulata (SNR) (possibile neuroni DA e neuroni GABA) vengono selezionati per la registrazione. Convenzionali giga ohm stretto sigillo a cellula intera configurazione si ottiene (Fig. 1B1). Attuale analisi Morsetto e tensione possono essere eseguite. Per minimizzare la degradazione dell'mRNA, registrazione elettrofisiologica dovrebbe essere breve (≤ 5 min). Una possibilità è quella di registrare solo la membrana e le proprietà spiking di fornire le impronte digitali elettrofisiologiche per i neuroni di interessi (Fig. B2-3). Questa breve registrazione richiede solo circa 1 min.

3. Citoplasma aspirazione

1. Dopo le impronte digitali elettrofisiologici e caratterizzazione di SNR GABA e neuroni DA, aspirazione bocca dolce viene applicato per aspirare il citoplasma. Il nucleo della cellula può anche essere aspirato, con conseguente contaminazione da DNA genomico. La tenuta non deve essere spezzato; detriti altrimenti extracellulare tra mRNA può essere risucchiata nella pipetta di patch e contaminare il contenuto della cella. L'integrità della tenuta è buona fino a quando l'aumento della corrente di mantenimento a -70 mV non superi i 100 pA.
2. Poi il contenuto della cella aspirato viene espulsa in un tubo di 0,2 ml PCR rompendo la punta della pipetta e una piccola pressione positiva. Contenuto di una cella è raccolto in una provetta PCR. Dopo aver accettato il contenuto della cella, il tubo di raccolta PCR, pre-raffreddata su ghiaccio, è immediatamente posto in un congelatore a -20 ° C.
3. Per escludere la contaminazione dei detriti extracellulare che può contenere mRNA, la pipetta di patch è abbassato nel tessuto senza realmente aspirare citoplasma e poi il contenuto della pipetta è sottoposto a RT-PCR.

4. Trascrizione inversa (RT)

1. Dopo aver raccolto il contenuto delle celle da un ragionevole numero di neuroni, di solito 10-20, RT dovrebbe iniziare immediatamente per ridurre al minimo la degradazione del mRNA.
2. Dal momento che la quantità del contenuto della cella da un singolo neurone è troppo piccolo, procedura di isolamento del RNA non viene eseguita. Per rimuovere il DNA genomico potenziale contaminazione, il contenuto della cella aspirato viene prima digerito da DNasi I (5 microlitri DNasi I e 1,6 microlitri DNasi I buffer, 5 min a 25 ° C). Poi DNasi I è inattivato con l'aggiunta di 1,2 microlitri 25 mM EDTA e incubazione a 75 ° C per 5 min.
3. cDNA viene sintetizzato con il SuperScript III della trascrittasi inversa a base di cellule-Direct cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, tabella 1). Primo filone cDNA viene sintetizzato a 50 ° C per 50 minuti, poi la reazione è inattivato da incubazione a 85 ° C per 5 minuti e 1 ml RNasi H è aggiungereed per digerire mRNA (37 ° C per 20 min). Il singolo filamento del DNA è conservato a -20 ° C per l'amplificazione PCR in seguito.
4. La rimozione completa del DNA genomico è stato verificato mediante RT-minus di controllo in cui si omette la trascrittasi inversa, mentre tutti gli altri componenti della reazione sono stati esattamente gli stessi.

5. Due stadio di amplificazione PCR

1. Primer sono stati progettati secondo le sequenze in GenBank. Quando possibile, introne-spanning coppie di primer sono state utilizzate che consentono di rilevare la contaminazione di DNA genomico. Sequenze di coppia di primer sono elencati nella Tabella 2. L'efficacia delle coppie di primer deve essere prima verificato da mRNA intero cervello che producono prodotti positivo. Tutti i primer sono sintetizzati dal Integrated Technologies DNA (Iowa City, Iowa, USA).
2. Nella prima fase, 5 ml di i 30 microlitri cDNA viene amplificato per 35 cicli in presenza di coppia di primer (Tabella 2). Il protocollo cicli termici del termociclatore (Mastercycler, Eppendorf, Tabella 1) è di 2 min a 94 ° C per la denaturazione iniziale, poi 35 cicli di 15 s a 94 ° C per denaturare, 30 s a 55 ° C per temprare, e 45 s a 72 ° C per estendere, seguita da 7 min per una estensione finale. Taq DNA polimerasi, deossinucleotidi trifosfati (dNTPs), e tutti gli altri componenti necessari per l'amplificazione PCR sono forniti da un super mix PCR (Invitrogen, tabella 1)
3. Nella fase di PCR secondo, il prodotto di 1 microlitri dal palco del 1 ^° amplificazione PCR è usato come modello e la coppia di primer stesso utilizzato nella prima fase viene utilizzato (Tabella 2). 40 cicli vengono eseguiti con il tempo di estensione ridotta a 30 s. Lo stesso mix di super-PCR è usato.
4. Prodotti di PCR di amplificazione della 2 ^° fase sono separati da 2,5% elettroforesi su gel di agarosio, visualizzati con bromuro di etidio (0,05 mg/100 ml gel) o gelgreen ai raggi UV, e fotografato (fig. B4). Le bande positive vengono poi tagliati fuori, estratto utilizzando un kit di estrazione Qiagen (Tabella 1) e sequenziato, e confrontati con le sequenze pubblicate di geni bersaglio.

6. Rappresentante dei risultati:

L'(DA) neuroni dopaminergici nella substantia nigra pars compacta e pars reticulata ei neuroni vicini proiezione GABA nella substantia nigra pars reticulata sono distinte caratteristiche elettrofisiologiche (Zhou et al 2006;. Ding et al 2011.). Come mostrato in fig. 1B2, SNR neuroni GABA mostra spiking alta frequenza spontanea di circa 10 Hz. Le punte hanno una durata base di circa 1 ms. Su iperpolarizzante iniezione di corrente, SNR neuroni GABA visualizzare un abbassamento debole depolarizzante in risposta a iperpolarizzante iniezione di corrente, che indica una debole espressione di I _h attuali in questi neuroni (Fig. 1B2). Al contrario, i neuroni nigral DA presentano bassa frequenza (circa 2 Hz), picchi spontanei che hanno una durata base di circa 3 ms. Neuroni DA mostrano anche un abbassamento pronunciato in risposta a iperpolarizzante iniezione di corrente, che indica una forte espressione della corrente I _h (Fig. 1B3) (Zhou et al 2006;.. Ding et al 2011).

SCRT-PCR rilevato mRNA per acido glutammico decarbossilasi 1 (GAD1, l'enzima chiave per la sintesi del GABA e un marker per i neuroni GABA) in elettrofisiologico identificato Snr GABA neuroni, ma non in DA neuroni (Fig. 1B4, 5). Al contrario, SCRT-PCR rilevato mRNA per tirosina idrossilasi (TH, enzima chiave per la sintesi di dopamina e un marker di neuroni DA) in elettrofisiologico identificato Snc e SNR neuroni DA, ma non in neuroni GABA (Fig. 1B4, 5). Così SCRT-PCR risultati confermano l'identificazione elettrofisiologiche dei neuroni. Successivamente, SCRT-PCR è stato utilizzato per il profilo l'espressione di tensione ad attivazione KV3 subunità del canale, Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 e Kv3.4. Queste subunità contribuiscono a formare voltaggio-dipendenti K ⁺ canali di proprietà diverse a seconda della composizione subunità (Ding et al. 2011). Nell'esempio SNR GABA neurone mostrato in fig. 1B4, mRNA per Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 e Kv3.4 sono stati rilevati. Nell'esempio SNR DA neurone mostrato in Fig.1B5, solo Kv3.2, Kv3.3 e Kv3.4 sono stati rilevati. Nel nostro pool di dati, Kv3.1 era più frequentemente rilevata nel SNR neuroni GABA che in nigral neuroni DA, indicando un alto livello di espressione del Kv3.1 in rapida spiking SNR neuroni GABA (Ding et al. 2011).

Figura 1. Identificazione elettrofisiologiche dei neuroni GABA Snr e nigral neuroni DA A:.. Aree nigral possono essere identificati dalla loro posizione anatomica distinte A1 mostra la posizione del SNC e SNR in una coronale Nissl macchiato di sezione catturate con un obiettivo 1X. L'area è stata scatola captured con un obiettivo 10X e visualizzati nel mezzo come indicato dalla freccia. La cella ricca di SNC e cellule poveri SNR sono chiaramente visibili. A2 mostra la posizione del SNC e SNR in un live, senza macchia sezione coronale catturate con un obiettivo 4x. La cella ricca di SNC e cellule poveri SNR sono chiaramente identificabili. VTA, nell'area ventrale tegmentale. B1 mostra un SNR GABA cerotto neurone essere bloccato in cellula intera modalità. B2 mostra le proprietà elettrofisiologiche tipiche di SNR neuroni GABA in modalità di registrazione corrente morsetto. Questi incendi spontanei neuroni ad alta frequenza potenziale azione di breve durata e hanno un debole I _h-mediata abbassamento iperpolarizzante iniezione di corrente. B3 mostra tipica proprietà elettrofisiologiche di neuroni DA nigral in modalità di registrazione corrente morsetto. Sparano spontaneo a bassa frequenza dei potenziali di azione di lunga durata e hanno un rilievo I _h-mediata sag (testa di freccia) risposta a iperpolarizzante iniezione di corrente. Così, SNR neuroni GABA e neuroni dopaminergici nigral sono chiaramente identificati elettrofisiologico. B4 mostra un quadro di gel SCRT-PCR prodotti da un elettrofisiologico identificato Snr GABA neurone. Glutammato decarbossilasi 1 (GAD1) ​​mRNA ma non tirosina idrossilasi (TH) mRNA è stato rilevato. mRNA per Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 e Kv3.4 sono stati individuati in questo GABA Snr neurone. B5 mostra SCRT-PCR rilevazione di mRNA neuronali canale KV3 in un DA Snr neurone. MRNA TH ma non GAD1 mRNA è stato rilevato in un elettrofisiologico identificato Snr DA neurone. mRNA per Kv3.2, Kv3.3 e Kv3.4 sono stati individuati in questo DA Snr neurone. B6 mostra i dati raccolti.

7. I potenziali risultati falsi negativi e falsi positivi

Sulla base della nostra esperienza, diversi fattori possono portare a falsi negativi SCRT-PCR risultati. Questi fattori includono fallimento in quantità sufficiente aspirazione del citoplasma grazie alla patch di intasamento punta della pipetta, contaminazione da RNasi, e inefficiente primer PCR. Patch intasamento puntale di solito può essere visto sul monitor video e indicati dalla resistenza maggiore accesso. Contaminazione da RNasi può essere evitato con lo spegnimento completo e guanti. Efficacia di PCR dovrebbero essere testati utilizzando RNA totale da tessuto cerebrale pugno (Zhou et al 2008;.. Ding et al 2011).

Dato che usiamo sempre DNasi per il trattamento di prima i nostri campioni prima di RT, non abbiamo incontrato risultati falsi positivi. Teoricamente, senza digestione DNase, contaminazione da DNA genomico, e quindi falsi positivi possono verificarsi quando il gene è intronless o la coppia di primer non copre l'intera regione introne.

Discussion

La combinazione di registrazione patch clamp in fetta cervello con SCRT-PCR abbiamo dimostrato qui fornire un metodo eccellente per studiare i profili di espressione dell'mRNA per canali ionici, recettori ed enzimi chiave per la sintesi dei neurotrasmettitori in neuroni individualmente caratterizzato. Ciò è particolarmente utile quando la proteina in questione non può essere rilevato e localizzato utilizzando altri metodi, come l'immunoistochimica a causa di bassi livelli di espressione e / o mancanza di anticorpi adatti (Surmeier et al 1996;.. Zhou et al 2009). L'alta sensibilità e selettività di SCRT-PCR permette la rilevazione di mRNA poco abbondanti (Surmeier et al. 1996). Inoltre, questo metodo consente la correlazione di espressione genica con proprietà elettrofisiologiche e funzionali nei neuroni individualmente caratterizzato (Liss et al 2001;. Zhou et al 2008, 2009;. Ding et al 2011.). Sulla base delle evidenze della letteratura e della nostra esperienza, questo metodo è applicabile a tutti i tipi di neuroni nel sistema nervoso.

Materials

Table 1. Key reagents and equipment

Table 2. Primer pairs for rat neuronal Kv3 channel, tyrosine hydroxylase (TH) and glutamic acid decarboxylase 1 (GAD1) mRNAs for scRT-PCR