Summary
Мы описываем протокол определить ключевые роли принимающей сигнальных молекул в литическая репликация вируса герпеса модели, гамма-герпесвирусов 68 (γHV68). Использование генетически модифицированных мышей штамма эмбриональных фибробластов и для γHV68 литической репликации, протокол позволяет как фенотипическая характеристика и молекулярно допроса вирус-хозяин взаимодействий в вирусную литической репликации.
Protocol
1. Мышь инфекции γHV68
- Шесть-восемь недель старые, соответствующего пола однопометница мышей (8 до 12 мышей / группа) используются для вирусной инфекции. Разрешить мышей, чтобы акклиматизироваться в течение четырех суток (96 часов) после отгрузки.
- Протокол шаги с помощью вируса должно осуществляться в кабинете биологической безопасности уровня 2 (BSL2) с использованием стандартных BSL2 меры предосторожности.
- Подготовка вирусной суспензии (40 к 1 х 10 5 бляшкообразующих единиц [PFU]) из γHV68 в 30 мкл стерильной PBS на мышь непосредственно перед экспериментом. Держите вирусной суспензии на льду.
- Подготовка кетамин / ксилазина решение (1,5 мг кетамина и 0,15 мг xylazine/20 г веса тела, 100 мкл / мышь) для мыши седативный эффект. Убедитесь, что мышь была седативные, выполняя ноги шнура.
- Sedate мышей с 1,5 мг кетамина и 0,15 мг ксилазина в 20 мг массы тела (100 мкл / мышь) внутри-перитонеального инъекции.
- Доставка вирусной суспензии (30 мкл / мышь) интраназально, в капляхмода, в одну ноздрю из седативные мышей.
- Положите мышь на одной стороне в течение 5 - 10 мин для облегчения дыхательных путей доставки вируса в легких.
- Место мышей обратно в клетку и монитор мышей, пока они не полностью оправился от седации.
- В разные дни после заражения, пожертвовать мышей CO 2 удушья и урожай легких после смерти обеспечение / потеря глубокого сознания. Место легких в стерильном 1,5 мл с завинчивающейся крышкой пробирки, содержащие 500 мкл 1,0 мм циркония / Silica бисера. Хранить трубы на льду. Магазин образцы при -80 ° C, если не переходить к следующему шагу в тот же день. Селезенки или печени ткани могут быть собраны в это время для анализа вирусной задержки в зависимости от срока эксперимента.
- Добавить 1 мл холодной бессывороточной DMEM в трубку и гомогенизации легкие борта избиения 30 секунд. Холод труб на льду в течение не менее 1 мин. Повторите эту процедуру один раз.
- Центрифуга легких лизатов при 16000 RCF при 4 ° С в течение 1 мин и использовать supernatant, чтобы определить титр вируса от налета методом с использованием NIH3T3 или BHK21 монослоя (см. раздел 5 подробнее).
2. Определить γHV68 многоступенчатой кинетики роста в мышиных эмбриональных фибробластов
- Расти дикого типа мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ), и те недостатки в принимающей гена к югу от сливной (около 80%) плотностью до покрытия клеток.
- Сплит MEFs в 24-луночный планшет на 10000 клеток / лунку по низкой multipilicity-о-инфекции (МВД) в день перед инфекцией. Эксперименты, как правило, осуществляется в трех повторах и в МВД от 0,001 - 0,05 обычно используется.
- Подготовка γHV68 суспензии, содержащей необходимое количество вируса (0,5 мл на лунку).
- Удалите среду и охватывает MEFs с 0,5 мл суспензии в γHV68 хорошо.
- Инкубировать в культуре ткани инкубатора, рок каждые 30 минут, и позволит инкубации проводили в течение 2 часов.
- Удалить вирусной суспензии, и покрывают клетки с 0,5 мл свежего сomplete DMEM среде, содержащей 8% эмбриональной телячьей сыворотки.
- В разные дни после заражения, урожай среды и клеток в стерильные пробирки на 1,5 мл центрифуги. Сразу замораживания труб при температуре -80 ° C.
- Выпуск γHV68 от MEFs путем замораживания при температуре -80 ° С, оттаивание в 37 ° С водяной бане и встряхивания. Три циклов замораживания и оттаивания, как правило, применяется к образцам.
- Определить титр вируса от налета методом с использованием NIH3T3 или BHK21 монослоя (см. раздел 5 подробнее).
- Прочитать титр вируса и земельный участок γHV68 многоступенчатой кривой роста на MEFs.
3. Молекулярная рассечение γHV68 литической репликации в мышиных эмбриональных фибробластов
- Выполните вирусной инфекции, как описано в шагах 2,1 до 2,6 раздела 2.
- В разные дни после заражения, отбросить супернатант. Промойте клетки с холодным PBS и trypsinize клеток. Гранул клеток центрифуг в 1000 RCF при комнатной температуре в течение 1 мин. Удалите супернатант иМагазин клеток при -80 ° C.
- Извлечение общей ДНК (хозяин и вирусного генома) и суммарной РНК в соответствии с ранее опубликованными методами 5,6.
- Выполните ПЦР в реальном времени с использованием совокупного ДНК и праймеров, специфичных для вирусных литического стенограммы, таких как RTA (ORF50), ORF57 и ORF60. Определить относительное количество внутриклеточных γHV68 генома со ссылкой на ген хозяин домашнего хозяйства (например, β-актин).
- Для удаления геномной ДНК, лечение РНКазы ДНКазой имеет решающее значение для подготовки кДНК с общей РНК и олиго (дТ) 11-19 грунт. См. ссылку 5 для более подробной информации об извлечении, РНК, включая лечение РНКазы ДНКазой и RT-PCR. Выполните ПЦР в реальном времени с использованием кДНК и грунтовки, как указано выше, чтобы определить относительное количество вирусных стенограммы ссылку на этот принимающих гена домашнего хозяйства.
4. Создание рекомбинантной γHV68 с использованием бактериальных искусственных хромосом
Метог описанные здесь используется для введения мутаций в гене γHV68, которые участвуют в хост-вирус взаимодействия.
- Подготовить фрагмент ДНК (около 1,5 КБ) последовательность дикого типа или последовательности проведения желаемой мутации в центральном регионе с помощью ПЦР.
- Подготовка бактериальные искусственные хромосомы (BAC), который содержит вставки транспозона 7 вокруг мутации сайт, который специально инактивирует ген интересующего гена, по миди-шкалу очистки (OriGene). Магазин алкоголя в крови ДНК при температуре 4 ° C (во избежание замораживания / оттаивания BAC ДНК).
- BAC трансфекции ДНК и ПЦР продукт, содержащий желаемый мутации гена интереса в клетках (например, NIH3T3 или BHK21), которые отличаются высокой разрешительной к γHV68 литической репликации, с Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
- Держите разбиение ячеек до цитопатического эффекта (CPE) появляется в монослое. Сбор, содержащих вирус супернатант и, при необходимости, усилить вируса в NIH3T3 или BHK21 клеток.
- Infect NIH3T3 клетокрекомбинантный вирус путем центрифугирования при 1800 оборотов в минуту, 30 ° С в течение 30 мин.
- Урожай γHV68-инфицированных NIH3T3 клетки и подготовить circularized вирусного генома использованием протокола Hirt в 8,9.
- Преобразование Electro-MAX DH10B компетентных клеток (Invitrogen) путем электропорации и экран для колоний, которые являются устойчивость к хлорамфеникол (см), но чувствительны к канамицин (Кан) (Cm-ген устойчивости в основу BAC, в то время как Кан-ген устойчивости в транспозона вставку).
- Рост колоний Cm R S Кан в среде, содержащей chlorophenicol и подготовить BAC ДНК с мини-или миди-шкалу очистки (OriGene).
- Проверка нужную мутацию в гене-мишени с помощью ПЦР, используя праймеры, специфичные для флангового регионов мутации сайте, и секвенирования.
- Подтвердите не хромосомных перестроек в BAC путем переваривания выбранных ферментов рестрикции и пульс поле гель-электрофореза.
- Трансфекции рекомбинантной BAC в NIH 3T3 или BHK21 клеток с Lipofectamine2000 (Invitrogen) для подготовки рекомбинантного γHV68.
- Держите пассажей клеток до CPE проявляется в монослой. Сбор, содержащих вирус супернатант и усиливают рекомбинантного γHV68 в NIH3T3 или BHK21 клеток.
- Определить титр рекомбинантных вирусов и вирусных характеризуют рост свойствами бывших естественных условиях и в естественных условиях, как описано в разделах 1 и 2.
5. Определить титр вируса от бляшек
- Расти NIH3T3 клетки к югу от сливной (около 80%) плотностью до покрытия клеток.
- Сплит NIH3T3 в 24-луночный планшет на 20000 клеток / лунку в день перед инфекцией.
- Подготовка 10-кратный серийно разбавленных супернатанты вируса с DMEM среде, содержащей 8% новорожденных телячьей сыворотки (NCS).
- Удалите среду и охватывает NIH3T3 клеток с 0,5 мл γHV68 подвески.
- Инкубировать в культуре ткани инкубатора, рок каждые 30 минут, и позволит приступить инкубациив течение 2 часов.
- Удалить вирусной суспензии и крышку клетки с 0,5 мл DMEM среде, содержащей 2% NCS и 0,75% метилцеллюлозы (Sigma).
- Инкубировать в культуре ткани инкубатора. Граф бляшек на 6-й день после заражения. Окрашивание монослоя, например, с фиолетовым кристаллом, может способствовать доска счета.
- Рассчитать титр вируса в неразбавленном лизатов тканей или клеточных лизатов с помощью следующей формуле: Титр (PFU / мл) = D х N х 1000 мкл / мл ÷ V мкл. N, среднее количество налета на соответствующее разведение, D, разведение раза (например, 5, 10, 100 .....) V (мкл), объем серийно разбавленного супернатанта добавил на лунку.
6. Представитель Результаты:
Три представителя цифры показанные здесь, в том числе γHV68 литической репликации в легких дикого типа и Mavs - / - мыши 10, γHV68 литического фенотипов репликации в мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) и рекомбинацииМуравей γHV68, несущих мутации в сайтах фосфорилирования, что модулируются MAVS-зависимых IKKβ. Эти три подтверждающих экспериментов представляет собой схему для определения роли врожденного иммунитета компонентов в γHV68 литической репликации в естественных условиях и бывших естественных условиях.
Рисунок 1 γHV68 нагрузки в легких Mavs + / + и Mavs -. / - Мышей. А) два основных врожденных сигнальные пути вниз по течению от MAVS. MAVS адаптер молекулы реле сигнализации от цитозольной RIG-I-подобными рецепторами для активации NFκB и интерферон регуляторных факторов (ИСО), которая, в свою очередь, до-регулирующие экспрессию генов провоспалительных цитокинов и интерферонов. B) Mavs + / + и Mavs - / - мыши были заражены с 40 PFU γHV68 интраназально и вирусной нагрузки в легких по указанной моменты времени были сдерживать деляется бляшек использованием NIH3T3 монослоя. Каждый символ представляет собой мышь.
Рисунок 2. ΓHV68 литического кинетики репликации в эмбриональных фибробластов мыши (МЭФ). Литической репликации γHV68 на Mavs + / + и Mavs - / - MEFs оценивали по многоступенчатой кривые роста (A) и количественный ПЦР в реальном времени (B). Для обоих экспериментах, равное количество MEFs и количество γHV68 были использованы для вирусной инфекции при множественности-о-инфекции (МВД) 0,01. (А) Клетки и супернатанты собирают в указанных точках времени и в зависимости от бляшек, чтобы определить вирусные титры. (B) Тотальная РНК была извлечена из γHV68-инфицированных MEFs и проанализированы количественные ПЦР в реальном времени с праймерами, специфичными для отдельных литического транскриптов (RTA, ORF57, и ORF60).
ig3.jpg "/>
Рисунок 3. Литическая кинетика репликации рекомбинантного γHV68, несущих мутации в домене трансактивации RTA, которые отменяют фосфорилирования IKKγ. (A) Многоступенчатая кривые роста рекомбинантным вирусом дикого типа (γHV68.wt) и вирус-мутант (γHV68.mut) в Mavs + / + и Mavs - / - MEFs клеток (MOI = 0,01). MEFs были инфицированы γHV68 в МВД 0,01. Клетки и супернатанты собирают в указанных точках времени и вирусные титры были определены бляшек использованием NIH 3T3 монослоя. (B) γHV68 RTA уровне мРНК в γHV68-инфицированных NIH3T3 клеток (MOI = 0,01). В 30 ч после заражения, общей РНК была извлечена из γHV68-инфицированных NIH 3T3 клетки и проанализированы количественные ПЦР в реальном времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В ответ на вирусную инфекцию, MAVS зависит от врожденной иммунной сигнальных путей, которые активируются, чтобы содействовать производству антивирусных цитокинов 10-14. Использование мышиный γHV68 в качестве модели вируса саркомы связанных вирус герпеса человека онкогенных Капоши и вирус Эпштейна-Барр 3,4, мы обнаружили, что γHV68 узурпирует MAVS-IKKβ пути к содействию вирусной репликации литического через активацию транскрипции 5. Применение генетически модифицированных MEFs и методы в молекулярной вирусологии, этот протокол позволяет эффективно идентификации сигнальных компонентов конкретного пути, которые важны для γHV68 литической репликации. Как таковой, этот протокол предусматривает в естественных условиях заражение, экс естественных условиях литической репликации, а также вскрытие врожденной иммунной сигнального пути. Чтобы очертить молекулярный механизм, дополнительные процедуры, в том числе бактериальные искусственные хромосомы для создания рекомбинантных герпесаЭксперименты вирусов и молекулярной биологии являются необходимыми. Кроме того, нокаут мышей штаммами и фибробласты являются ключевыми для этих экспериментов. При большом количестве нокаутом мышей штаммами доступны, этот протокол позволит молекулярных рассечение хозяин сигнальных путей и вирусных вмешательства их. В том случае, мышах и MEFs не доступны (например, в связи с летальностью), RNAi / ShRNA-обусловленный нокдаун может быть запрошена. Дополнительные ограничения этого протокола являются: 1) перекрестные помехи между сигнальными путями, 2) дублирование функций кандидата вирусные факторы, 3) потенциальную смертельную влияние на γHV68 репликации мутаций. Хотя этот протокол применяется непосредственно к выявлению роли врожденного иммунитета компонентов в γHV68 литической репликации, в частности, подобные стратегии могут быть использованы для определения важных ролей выбранного компонента в других принимающих сигнальные пути при вирусной инфекции в естественных условиях и бывших естественных условиях.
ЭтоВажно отметить, что наш подход рекомбинации в трансфицированных клетках обходит рабочую интенсивные шаги, необходимые для определения концентрации алкоголя в крови рекомбинантного в E.coli, позволяющий эффективно внедрять мутаций в гене, из интереса. В частности, гомологичной рекомбинации между BAC и ПЦР-продукты, содержащие предназначены мутации производит инфекционных клонов BAC, что, в свою очередь, приводит к рекомбинантным γHV68. Тем не менее, этот протокол опирается на существенную генов и мутаций, которые не должны полностью инактивирует вирус. Если мутации полностью инактивируют γHV68, трансфекций не ожидается для создания рекомбинантных вирусов. Мы понимаем, что информация, полученная из мышиных γHV68 не может применяться одинаково для человека KSHV и ВЭБ. Тем не менее, стратегии, чтобы анализировать вирусных иммунной уклонения и эксплуатации механизмы могут быть применены к этим патогенам человека использовании культивированных клеток. Наши данные, полученные из мышиных инфекции γHV68 таким образом, будет инструктировать нас гesigning лучше эксперименты по изучению человеческого KSHV и ВЭБ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Джеймса (Zhijian) Чэнь (UT Southwestern, молекулярная биология) для обеспечения основных реагентов, в том числе Mavs - / - мышей, и д-р Рене Sun (Калифорнийский университет в Лос-Анджелесе, фармакологии и молекулярной медицины ) для обеспечения бактериальные искусственные хромосомы γHV68 для данного исследования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Electro-MAX DH10B competent cells | Invitrogen | 18290-015 | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| POWERPREP HP Plasmid Miniprep System | OriGene | NP100004 | |
| POWERPREP HP Plasmid Midiprep System | OriGene | NP100006 |
References
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124, 783-801 (2006).
- Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449, 819-826 (2007).
- Speck, S. H., Virgin, H. W. Host and viral genetics of chronic infection: a mouse model of gamma-herpesvirus pathogenesis. Curr. Opin. Microbiol. 2, 403-409 (1999).
- Speck, S. H., Ganem, D. Viral latency and its regulation: lessons from the gamma-herpesviruses. Cell Host Microbe. 8, 100-115 (2010).
- Dong, X. Murine gamma-herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to initiate lytic replication. PLoS Pathog. 6, e1001001-e1001001 (2010).
- Strauss, W. M. Preparation of genomic DNA from mammalian tissues. Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel, F. M. , John Wiley & Sons, Inc. 2-2 (1998).
- Song, M. J. Identification of viral genes essential for replication of murine gamma-herpesvirus 68 using signature-tagged mutagenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 3805-3810 (2005).
- Hirt, B. Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures. J. Mol. Biol. 26, 365-369 (1967).
- Zhao, S., Stodolsky, M. Cloning of β-herpesvirus genomes as bacterial artificial chromosomes. Methods in Molecular Biology. , Humana Press Inc. 256-256 (2004).
- Sun, Q. The specific and essential role of MAVS in antiviral innate immune responses. Immunity. 24, 633-642 (2006).
- Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122, 669-682 (2005).
- Kawai, T. IPS-1, an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated type I interferon induction. Nat. Immunol. 6, 981-988 (2005).
- Meylan, E. Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus. Nature. 437, 1167-1172 (2005).
- Xu, L. G. VISA is an adapter protein required for virus-triggered IFN-beta signaling. Mol. Cell. 19, 727-740 (2005).
