Summary
피부염의 herpetiformis (DH)는 이가와 표피 transglutaminase (eTG) 사이의 면역 반응을 특징으로 만성 염증성 조건입니다. DH는 글루텐에 민감한 및 / 또는 복강 환자의 아주 작은 부분에 개발하고 있습니다. 본 연구의 결과는 DH도 idiopatic 피부염의 증상으로 붉은 털원숭이 원숭이 호스트에서 개발할 수 있음을 나타냅니다.
Abstract
조직 transglutaminase 2 (tTG2)는 이미 부분적으로 소화식이 글루텐 예 : 글리아딘의 펩티드를 deamidates 장내 소화 효소이다. 유전자 predisposed 개인에 tTG2는 tTG2 항체와 작은 창자 벽 1,2에 자신의 직접 증착의 생산에 의해 특징 면역 응답을 트리거합니다. 이러한 항체의 존재는 복강 질환 (CD)의 주요 특징 중 하나를 구성합니다. 표피 transglutaminase (eTG)도 CD 환자의 소수에서 autoantigen로서 기능을 할 수 transglutaminase 가족의 다른 구성원입니다. 이러한 비교적 드문 경우에는, eTG는 임상적으로 피부염의 herpetiformis (DH)로 알려진 면역 반응 (피부 발진) 트리거합니다. CD 및 DH pathogenesis의 정확한 메커니즘이 잘 이해되지 않지만, 그것은 알려진 것이 tTG2와 CD와 DH 환자 3,4 모두에서 혈청 항체에 의해 인식된다 공유할 antigenic의 epitopes을 eTG.
(Macaca mulatta) (표 1, 그림. 1, 2)의 피부 병변의 생검 샘플의 공촛점 현미경 시험은 영향을받는 조직을 연구하는 데 사용되었다. 한 동물 (EM96)에서 이가와 tTG2 항체 (그림 3)의 스펙트럼 중첩을 보여주되었습니다. 이중 긍정적인 tTG2의 존재가 + 이가 + 세포는 피부 용의자 주변의 깊은 표피에 집중되었다. 이것은 DH 환자 3에서 설명한 병변과 일치합니다. EM96은 글루텐 - 무료 다이어트, 피부염뿐만 아니라에 배치되었을 때 tTG2 + 이가 + 예치금가 사라진과 (Figs. 1-3) 더 이상 감지되지 않았다. 피부염은 EM96의 식단 글루텐 (표시되지 않음)의 재 도입에 따라, 그러나 등장. 관련이없는 피부염과 동물 등 다른 원숭이에서 tTG2 + 이가 + 예금은 발견되지 않았습니다. tTG2의 존재와 함께 EM96에 피부염의 글루텐 무료 다이어트에 의존 죄사함 + 이가 +의 피부에 세포가 제안자가 면역 질환, DH 같은이 조건의 개발을위한 메커니즘. 이것은 모든 비 인간 영장류에서 DH 같은 피부염의 첫 번째 보고서입니다.
Protocol
1. 피부 생검 샘플 모음
- 이전 피부 생검 절차, 2.5 MG / tiletamine 하이드로 클로라이드와 zolazepam 염산염 telazol 혼합물 (포트 닷지 동물 건강, 포트 다지, IA)의 kg과 intramuscularly 동물을 마취. 드러누움까지 마취의 관리에서 동물을 모니터링하고 그들의 인클로저에서 제거합니다.
- 크기 40 블레이드 (Oster 전문 제품, 맥민빌, TN)와 Oster 골든 A5 싱글 속도 수의학 클리퍼를 이용 흥미 피부 영역에서 머리를 제거하고 무균 betadine 스크럽과 알코올을 교대로 준비합니다. 선택한 생검 사이트를 통해 살균 fenestrated의 드레이프를 확보.
- 악기 180도는 약간의 압력으로 시계 방향과 반대 방향으로 회전하면서 생검 펀치는 피하 TI에 피부 레이어를 통해 transects까지 살균 기술을 사용하여 피부에 대해 4.0 mm Miltex 펀치 피부 생검 악기 (Miltex, 요크, PA) 장소ssue. 생검 샘플을 제거하고 집게와 피하 조직에서 무료로 피부의 가로 부분을 파악.
- 십자 모양의 팔분의 삼 원형 절단 바늘 (Ethilon, Ethicon, 존슨 앤 존슨 의료 제한, 버크셔, 영국)에 연결된 3-0 나일론 봉합사로 피부 결함을 닫습니다. 모든 동물에게 게시물 수술 진통제에 대한 intramuscularly 0.01 밀리그램 / kg buprenorphine 하이드로 클로라이드 (Hospira, 레이크 포레스트, IL)를 제공합니다.
2. 샘플 처리
- 만성 피부염과 건강한 컨트롤에서 피부 생검 샘플 작업은 붉은 털원숭이 원숭이. 2-3 (직경 4mm)가 각 동물에서 샘플을 생검 구합니다.
- 24 시간 동안 (Z - 수정, Anatech (주), 배틀 크릭, MI) 아연 포르말린의 첫 번째 예제를 수정, ASP300 Leica 조직 프로세서 (Leica 마이크로 시스템즈 주식 회사로, 30 분 물에 세척 70 % 에탄올에 잠시 씻고, 장소 , 조직의 70 %, 80 %, 95 % 100 % 에탄올 48 오름차순 성적 탈수있다 버팔로 그로브, KS)크실렌의 두 가지 변경 사항 (피셔) 다음 각 (피셔 과학, 피츠버그, PA)를 분.
- 상온에서 장기 저장을위한 파라핀 미디어 (피셔)에 삽입할 수 있습니다. 장소 이전 sectioning 20 분에 - 20oC. 로터리 마이크로톰을 (HM325, Microm 국제, 월도프, 독일)를 사용하여 6 μm의 섹션을 준비합니다. 충전 슬라이드 (피셔)와 하룻밤 60oC에서 건조 공기의 장소 섹션. hematoxylin 및 eosin (H & E) 표준 방법 (아래 설명)에 얼룩.
- 상온에서 30 분 2 % paraformaldehyde (USB 사, 클리블랜드, OH)에 두 번째 예제를 수정, 인산의 세 번 씻어 염분은 (PBS, Gibco - Invitrogen, Carlsbad, CA)를 30 % 자당 (피셔)의 장소, 버퍼 4 시간 그리고 OCT 냉동 매체 (사쿠라 Finetek, Torrence, CA)에 포함. 이전 sectioning 20 분 - 80oC에서 보관. 그라 이오 스탯을 (HM560, 열 과학, 칼라 마주, MI)를 사용하여 15 μm의 섹션을 준비합니다.
3. H & E 염색법
- 소스를 Deparaffinize백퍼센트 세 변경, 95 %의 두 가지 변경 사항 하나 80 % 변화와 증류수, 2 분 각각 세 xylenes (피셔)의 변화와 등급 ethanols 통해 rehydrate 통해 됐나요 섹션.
- 한 분 hematoxylin (리차드 - 알란 과학, 칼라 마주, MI)와 얼룩과 수돗물을 실행에 간단한 세척으로하십시오.
- 6 분 eosin (시그마)와 Counterstain.
- 이 2 분 각각의 변화와 다음 xylenes 세 변화에 분명 3 분 각각 95 %와 절대 에탄올로 얼룩진 조직을 탈수.
- H & E - 스테인드 조직 섹션을 통해 Cytoseal 장착 매체를 사용하여 마운트 coverglass (리처드 - 앨런 과학).
4. Histopathological 평가
스팟 통계 디지털 카메라 (디지털 인스 트루먼 트의 주식, 미시간, 미국)와 40x 배율과 Leica 현미경 - H & 4를 사용하여 가벼운 현미경 E - 스테인드 생검 피부 섹션을 검사합니다.
5. Immunofluorescent 안녕 -닝
- immunofluorescent 얼룩에 대한 월 임베디드 스킨 섹션과 함께 작동합니다. 전에 얼룩에, PBS에서 20 분 트리톤 X - 100 (시그마)는 OCT를 제거하고 조직을 permeabilize하기 위해 0.1 %와 0.2 % 생선 껍질 젤라틴 (FSG, 시그마)이있는을위한 만끽해보세요.
- 슬라이드를 세척 후 humidified 슬라이드 챔버에서 상온에서 1 시간 동안 PBS - FSG에 희석 10% 정상 염소 혈청 (NGS, 시그마)와 부화.
- 이가와 tTG2 항체의 증착을 시각화하기 위해 1 시간 10 % NGS - PBS - FSG의 희석 방지 붉은 털원숭이 이가와 tTG2 차 항체와 슬라이드를 품어.
- 10 분 PBS - FSG 다음 10 분, 위해 PBS - FSG - 트리톤 X - 100 (시그마)로 씻으십시오.
- 1:1,000 희석에 알렉사 형석 fluorochrome 488 (녹색), 568 (빨간색) 또는 633 (파란색) (분자 프로브 - Invitrogen)로 태그가 보조, isotype 특정 항체와 함께 품어. 핵 DNA를 시각화하는 ToPro - 3 염료를 사용합니다. 항체 희석액으로 10 % NGS - PBS - FSG를 사용합니다.
- 스테인드 조직 섹션을 탑재 방지 칭 솔루션 (시그마)를 사용합니다.
6. 공촛점 이미징
488 NM에서 아르곤 - 크립톤 레이저 (녹색), 568 nm의에서 크립톤 레이저 (세 가지 레이저 (해당 여기 6 라인)이 장착된 Leica TCS SP2 진정한 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (Leica, Wetzlar, 독일)와 이미징을 수행 빨간색)과 스펙트럼의 멀리 붉은쪽으로 보이는부터 기간 633 NM (파란색)에서 헬륨 - 네온 레이저. 비 분류 조직 아키텍처 평가에 대한 기록 차등 간섭 대비 (DIC) 이미지.
7. 대표 결과
tTG2와 이가 항체 모두에 의해 eTG의 긍정적인 인식의 예제는 그림에 표시됩니다. 3A. 인간 환자의 상황과 붉은 털원숭이 원숭이에서도 글루텐 감도 CD와 같은보다 DH 같은 피부염의 훨씬 낮은 유행으로 인해과 일치, 피부 생검 샘플의 대부분은 우 것으로 예상된다w tTG2 항체가 아니라 tTG2 + 이가 + 이중 긍정 세포 (그림 4)의 존재없이 긍정적인 반응. 미생물 원산지 피부염 사례를 포함하여 이러한 DH - 무관한 경우, 상피 아래에 흩어져있는 몇 가지 단일 긍정적인 이가 +는 세포를 공개하지만 tTG2과 이가 표시된 마커 (Figs. 3B 4) 사이 없습니다 스펙트럼 중복됩니다. 것입니다 따라서 histopathological 평가 (그림 2)와 다른,보다 일반적인 피부염 유발 대리인이 식별 수 없습니다 경우에만, 공촛점 다음 임상 시험 (그림 1) 시작, 제안된 테스트 절차의 순서를 유지하는 것이 중요합니다 tTG2와 이가에 대한 얼룩진 피부 biopsies의 현미경 시험은 보증됩니다. 혼자 임상 및 / 또는 histopathological 평가이 조건의 긍정적인 진단에 충분하지 않습니다. 이러한 경우에는 때 두 번 긍정적인 (tTG2 + 이가 +) 세포가 피부 용의자의 주변 지역 식별, DH 같은 피부염 진단이 발행하실 수 있습니다. 식이 글루텐 이러한 경우에는 탈퇴그리고 글루텐없는 다이어트의 관리는 피부염의 증상을 완화하기 위해 권장합니다.
그림 1. 전에 EM96 짧은 꼬리 원숭이의 사타구니 지역 (A)과 후 (B) 5 주 동안식이 글루텐의 취소. 식이 글루텐의 Reintroduction는 피부염의 재현 (C)가 동시에.
그림 2. 그가 전에 수집 EM96 짧은 꼬리 원숭이 피부 biopsies의 얼룩 (A)과 후 (B) 9 주 동안식이 글루텐의 취소. A :의 상피는 hyperkeratotic 세포의 두꺼운 표면 지각 degenerating의 neutrophils과 침투와 (과 상피 세포의 7-15 층) 두꺼워입니다. Neutrophils는 상피 내부에도 나타납니다 lymphocytes, 플라즈마 세포, 그리고 상부 진피에있는 adnexa 주변 histiocytes의 적당한 번호를 혼합하고 있습니다. B : 어떤 hyperkeratosis가 여전히 존재하는, 상피 두께는 상부 진피에 최소한 lymphoplasmacytic 침투와 함께 (4-7 층) 표준입니다. C : 아니요 lymphoplasmacytic 침투와 FR56 짧은 꼬리 원숭이에서 일반 복부 피부, 비교 포함되어 있습니다. 확대 20x.
그림 3. 이전에 수집된 EM96 짧은 꼬리 원숭이 피부 biopsies의 공촛점 현미경 이미지 (A)과 후 (B) 9 주 동안식이 글루텐의 취소. A : 이가의 얼룩 (녹색), tTG2 (적색) 및 ToPro - 3 핵 DNA 마커 (파란색). 이가와 tTG2의 공동 지방화는 피부 papilae의 주위 노란색으로 나타납니다. B : 스킨 샘플이 9 주 후에 촬영 글루텐이없는 일부 subepithelial 이가이, (녹색) 여전히 tTG2 (적색) 및 ToPro - 3 핵 DNA 마커 (파란색) 존재하는 동안 다이어트 상피 이내에 이가를 보여줍니다 없습니다.
그림 4.
| 동물 태그 | 섹스 [M / F] | 나이 [년] | 임상 증상 | 플라즈마 tTG2 항체 | 다이어트 [1,2] * |
| HJ71 | F | 1.3 | 건강한 | - | 일 |
| HD13 | M | 1.4 | 건강하고, 가끔 설사 | + | 일 |
| FR56 | M | 5.4 | 만성 특발성의 설사 | - | 일 |
| EM96 | F | 5.0 | 만성 피부염 | + / - (경계선) | 1, 2 |
| GI24 | F | 4.6 | 만성 피부염 | - | 일 |
표 1. TNPRC는 붉은 털원숭이 피부 biopsies를 수집 이용 원숭이
* 다이어트 1 - 일반 원숭이 차우 (글루텐 함유) 다이어트 2 - 글루텐 무료 다이어트
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Discussion
글루텐 민감도 우리의 새로 설립이 아닌 인간의 영장류 모델은 최근에식이 글루텐 5,6에 의해 트리거 장의 투자율 변화를 연구하는 데 사용되었다. 플라즈마 tTG2 항체뿐만 아니라 창자 tTG2 + 이가 + 보증금 일부 글루텐에 민감한 짧은 꼬리 원숭이에서 발견되었습니다. 우리가 최근 붉은 털원숭이 식민지에 일반 (신진 대사 / 전염성) 병인가 설립되지 수 원숭이를 특발성 피부염의 희귀한 사건을 확인 때문에, 본 연구의 목적은 평가에 있었다면 tTG2 + 이가 + 항체 예금은 이러한 드문 경우에서 피부 샘플에 포착할 수 피부염의 (표 1).
1:70와 1:200 7 일 사이 CD 범위 나타내는 아르 tTG2 autoantibodies의 유행. 글루텐에 민감한 원숭이와 함께 우리의 연구는 포로에서 tTG2 항체의 유행을 나타내는 것은 붉은 털원숭이 인간의 인구에서보고되는 유사한을 원숭이. 범위 O에 영향을있을 차 환경 및 유전적 요인인간과 원숭이 모두에서 F 이러한 유행은 8,9를 understudied 있습니다. CD보다는 DH (1:400으로 1:10,000)의 낮은 유행과 연관된 요인도 알려져 있지 않습니다. 따라서보다 엄격한 연구는 CD와 DH의 pathogenesis를 공부하기 위해 필요합니다. 이 보고서가 아닌 인간의 영장류에서 DH 같은 피부염의 존재를 보여주는 가장 먼저입니다. DH 같은 피부염의 유행에도 불구하고 또한 짧은 꼬리 원숭이의 글루텐에 민감한 enteropathy의 유행보다 훨씬 낮은 것으로 나타나, 제출 결과는 DH 같은 피부염과 함께 추가적인 동물 식별됩니다 가정, 미래 연구에 대한 희망을 제공합니다. 이중 긍정적인 tTG2의 감지 + 이가 + 공촛점 현미경에 의해 영향을 동물의 피부 biopsies의 세포가 이러한 노력을 계기한다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 기술 지원 아만다 Tardo, 닥터 모스 타파 Bouljihad, 스테파니 지내요, 필리, 캐롤 Coyne 박사 에린 Ribka 박사 피터 디디와 도로시 Kuebler 감사하고 싶습니다. 이 작품은 NIH 보조금 R01 - DK076653 및 KS에 3R01 - DK076653 - 02S1과 TNPRC RR000164의 기본 운영 부여에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Human IgA-FITC * | Sigma-Aldrich | F-5259 | 1:100 working dilution |
| Anti-Human tTG2 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | MS-300-P1ABX | 1:100 working dilution |
| Anti-Mouse IgG1 ** | Invitrogen | A-21124 | 1:1,000 working dilution |
| ToPro-3 DNA probe *** | Invitrogen | T-3605 | 1:1,000 working dilution |
| Zinc Formalin (Z-fix) | Anatech Ltd., Battle Creek, MI | 171 | |
| OCT Freezing Medium | Sakura Finetek | 4583 | |
| Cytoseal Mounting Medium | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Anti-Quenching Solution | Sigma-Aldrich | P 3130 | |
| Ethilon (Nylon Suture) | Ethicon Inc. | 663G | |
| Miltex Punch Dermal Biopsy Instrument | Miltex Inc. | NA | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with a size 40 blade | Oster Professional Products | 78005-050 | |
| Leica Tissue Processor | Leica Microsystems | ASP300 | |
| Rotary Microtome | Microm International | HM325 | |
| Cryostat | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HM560 | |
| Confocal Microscope | Leica, Wetzlar | TCS SP2 | |
| * Fluorescein isothiocyanate ** Secondary (Alexa Fluor 568-conjugated) antibody used after tTG2 primary antibody ** Dye |
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References
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