Summary
Een methode voor het metaboliet extractie van microbiële gemeenschappen plankton wordt gepresenteerd. Hele gemeenschap bemonstering wordt bereikt door middel van filtratie op speciaal geprepareerde filters. Na lyofilisatie worden waterige oplosbare metabolieten geëxtraheerd. Deze aanpak maakt het voor de toepassing van milieu-metabolomics tot de trans-omics onderzoek van de natuurlijke of experimentele microbiële gemeenschappen.
Abstract
Milieu-metabolomics is een opkomend gebied dat nieuwe inzicht is het bevorderen van de manier waarop organismen reageren op en interageren met de omgeving en elkaar op de biochemische niveau 1. Nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie is een van de verschillende technologieën, zoals gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS), met veel belofte voor dergelijke studies. Voordelen van NMR is dat het geschikt is voor ongerichte analyses, biedt structurele informatie en spectra kunnen worden opgevraagd in kwantitatieve en statistische manieren tegen de laatst beschikbare databases van individuele metaboliet spectra 2,3. Daarnaast kunnen NMR spectrale data worden gecombineerd met gegevens uit andere omics niveaus (bijv. transcriptomics, genomics) om een meer omvattend begrip van de fysiologische reacties van taxa op elkaar en het milieu 4,5,6 te geven. Echter, NMR is minder gevoelig dan andere metaboloom technieken, waardoor het moeilijk is aplagen aan de natuurlijke microbiële systemen waar steekproefpopulaties kan een lage dichtheid en metaboliet concentraties laag in vergelijking met metabolieten van goed gedefinieerde en gemakkelijk winbare bronnen zoals hele weefsels, biovloeistoffen of cel-culturen. Bijgevolg hebben de weinige directe milieu metabolietvorming van microben tot nu toe uitgevoerde beperkt tot cultuur-gebaseerd of gemakkelijk te definiëren met hoge dichtheid ecosystemen zoals host-symbiont systemen, gebouwd co-culturen of manipulaties van de darm omgeving waar stabiele isotopen de etikettering kunnen worden tevens worden gebruikt ter verbetering NMR signalen 7,8,9,10,11,12. Methoden dat de concentratie en verzamelen van het milieu metabolieten vergemakkelijken concentraties voor NMR ontbreken. Sinds de recente aandacht is besteed aan de milieu-metabolomics van organismen in het aquatisch milieu, waar veel van de energie-en materiaalstroom wordt gemedieerd door de planktonische gemeenschap 13,14, hebben we een methode ontwikkeld voor de concentratieTIE en extractie van hele gemeenschap metabolieten van planktonische microbiële systemen door middel van filtratie. Handel verkrijgbare hydrofiele poly-1 ,1-difluoroethene (PVDF) filters speciaal behandeld voor het verwijderen extraheerbare, die anders kunnen als verontreinigingen in de daaropvolgende analyse. Deze behandelde filters worden vervolgens gebruikt om milieu-of experimentele monsters van belang te filteren. Filters met de natte monstermateriaal gevriesdroogd en waterige oplosbare metabolieten direct geëxtraheerd voor conventionele NMR spectroscopie een gestandaardiseerde kaliumfosfaatbuffer extractiebuffer 2. De gegevens zijn afgeleid van deze methoden kan worden geanalyseerd statistisch betekenisvolle patronen te identificeren, of geïntegreerd met andere omics niveaus voor uitgebreide kennis van de gemeenschap en ecosysteem functie.
Protocol
1. Filter Voorbereiding op extraheerbare verwijderen
- Gebruik van 25 mm diameter 0,22 pm poriegrootte Durapore PVDF hydrofiele filters (Millipore). Plaats filters in een schone 500 ml Pyrex beker met een pincet. Voorspoeling drie maal met gedestilleerd water. Werveling en u spoelen de filters te hechten aan elkaar. Voeg 300 ml Milli-Q (Millipore) of gelijkwaardig water van hoge kwaliteit. Autoclaaf volledige verwijdering van extraheerbare vergemakkelijken van de filters.
- Giet de Milli-Q en weer drie spoelen van de filters, dit keer met Milli-Q. Behulp van een pincet plaats individuele filters op een schone, droge ondergrond (zoals aluminium folie) en ofwel droog bij een redelijke temperatuur (bv. 37 ° C) of de lucht drogen. De filters zijn nu klaar voor gebruik.
2. Filtratie van Sample Materiaal
- Voor het aantonen van dit protocol, een Millipore RVS 3-plaats-filter spruitstuk met 25-mm microanalyse filter kolommen met glazen ondersteunten een mechanische pomp gebruikt. Met behulp van aseptische techniek, een 25-mm filter te plaatsen op het filter kolom basis, gelden de kolom en klem samen.
- Laad 15 ml van het monster in de kolom, open de afsluiter op het filter spruitstuk, en zet de pomp. Filtreer onder zachte druk naar cel breuk (<5 kPa) te minimaliseren. Andere pompen, zoals met de hand of een peristaltische pomp kan worden aangepast aan dit protocol. Voor een lagere dichtheid monsters, de opeenvolgende toevoegingen van water nodig kan zijn, laat de filter drogen gaan voor een langere tijd tussen de toevoegingen van water.
- Voor monsters op zee, nadat je hebt gefilterd je steekproef, kunt u een optionele zoet water te spoelen om de resterende paramagnetische ionen te verminderen in uw monster en op het filter. Dit kan helpen met meer precieze afstemming van de spectrometer magneet. Gewoon voorzichtig voeg een kleine hoeveelheid water en filtreer door uw verzamelde monster aan het eind.
- Als het filteren is voltooid, schakelt u de pomp, en laat de klep open dus er is nog steeds negatieve druk onder het filter. Verwijder de klem en het filter kolom.
- Met de ene hand, gebruik dan schone pincet om greep te houden met het filter. Vouw het filter over zich, maar niet kreukt. Met uw andere hand gebruik maken van de lip van een steriele 2-ml microcentrifugebuis Houd de filter. Laat vervolgens de pincet gebruiken om opnieuw greep beide randen van het filter. Regrip in een hoek van 45 ° naar de kudde.
- Plaats de filter in de 2-ml-buis en laat dus het wordt geopend met het monster kant naar binnen. U kunt maximaal twee filters in de steriele 2 ml microcentrifugebuis op deze manier. Bij gebruik twee filters, zodat ze elkaar overlappen zo min mogelijk. Onmiddellijk invriezen (tenminste -30 ° C).
3. Extractie van Waterige oplosbare Metabolieten
- Lyophilize uw monsters 's nachts of gedurende ten minste 10 uur.
- Na het vriesdrogen, voeg een roestvrij stalen breker aan elke buis (Tokken). Voeg 750 ul gestandaardiseerde kaliumfosfaat NMR buffer in deuteriumoxide (2 H> 90%) met een 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonaat (DSS)-norm (KPI's, 38,3 mM KH 2 PO 4, 61,7 mM K 2 HPO 4, DSS 0.1 mM, pH 7,0, 90% D 2 O) 2.
- Sonificeer de monsters gedurende 5 minuten bij 4 ° C in een water sonicator (Bioruptor, Diagenode) het celmateriaal uit het filter. Verwijder de filters met schoon pincet.
- Breek de cellen met behulp van een molen crusher (1600 rpm) gedurende 5 minuten.
- Incubeer bij 65 ° C met schudden (1400 rpm) op een bank-top schudmachine (Eppendorf) gedurende 15 minuten.
- Verwijder de metalen varken met schone pincet, en centrifugeer de steekproef bij 13.000 g gedurende 5 minuten.
- Laat de supernatant rechtstreeks naar een NMR buis NMR spectroscopie.
4. NMR-spectroscopie en data-analyse
- Laad je monster in een NMR-spectrometer (hier, een Bruker DRX-500 spectrometer uitgerust met eenTXI sonde met triple-as gradiënt bestuurd door een computer met xwin-NMR).
- Zorg voor 1D 1 H NMR-spectra met behulp van passende eerder gepubliceerde methoden 2,15 uit de xwin-NMR-interface. In deze studie 1H NMR spectra werden opgenomen op een DRX-500 spectrometer werkend op 500,03 MHz bij 298 K. restwater signalen zijn onderdrukt door de Watergate pulssequentie een herhalingstijd van 1,2 s. 128 passanten werden verzameld tot 32.000 meetpunten per spectrum te verkrijgen.
- Breng de NMR-gegevens mappen op een pc geïnstalleerde software NMRPipe 16. Verwerk de ruwe data en stel DSS als 0 ppm referentie handmatig fase van de spectra. Digitaliseer de spectrale gegevens in een set van discrete waarden door de integratie van of 'binning' met software zoals rNMR, Automics, of gebruik van de openbare FT2B pakket van de ECOMICS website ( https://database.riken.jp/ecomics/ ) 3,17. In eis bijvoorbeeld, werden spectra geïntegreerd tussen de 0,5 en 10,5 ppm meer dan 0.032 pagina's per minuut integraal regio's met behulp van ECOMICS, en genormaliseerd op een DSS of totale intensiteit van het signaal. Output gegevens kunnen nu worden gebruikt voor downstream-statistische analyse zoals principale componenten analyse (PCA) met behulp van gratis software zoals R 18.
5. Representatieve resultaten
Een voorbeeld van een H NMR spectra met de bovenstaande methoden aangegeven in figuur 1. Deze monsters, van twee keer de punten van een microkosmos experiment vertonen duidelijke verschillen te wijten aan algen metabolische activiteiten. De dag 4 spectrum toont aanzienlijke overvloed van pieken in het bijzonder 3-4 ppm gebied vergeleken met dag 1 monster. Deze pieken kunnen worden toegeschreven aan suikers geproduceerd door bloeiende diatomeeën in de microkosmos. In een soortgelijk experiment het vergelijken van de groei van natuurlijk plankton gemeenschappen in kunstmatig of natuurlijk zeewater, statistische benaderingen sUch als principaal component analyse (PCA) score perceel afgeleid van weggegooid NMR-spectra kunnen worden gebruikt om duidelijke metabole verschillen tussen de twee behandelingen (afb. 2) laten zien, terwijl de belasting plots kunnen pieken te identificeren binnen de spectra die de vorm van de verdeling van de gegevens . Dergelijke resultaten kunnen vergeleken worden met andere omica niveau, zoals uit genomisch vingerafdrukken methoden (Fig. 3). Deze NMR-pieken kunnen individueel worden opgevraagd (bijv. bij de BMRB; http://www.bmrb.wisc.edu/ ) 19, of complete spectra kunnen statistisch worden geanalyseerd (bijvoorbeeld met SpinAssign op http://prime.psc.riken. jp /? action = nmr_search ) 2. In dit voorbeeld verschillen tussen de behandelingen waren door een overvloed van pieken in de suikers regio (3,39 ppm 4,04 ppm) spectra van natuurlijke plankton gemeenschap metabolieten, verschillende pieken die kenmerkend zijn de kunstmatig zeewater gemeenschappen waren voorzichtig identified als lactaat en formiaat met SpinAssign.
Figuur 1. Representatieve 1H NMR spectra verkregen van bewerkte monsters deze procedure. Microkosmos werden monsters genomen voor (dag 1) en tijdens (dag 4) een intense diatomeeën bloei. NMR experimenten werden uitgevoerd op een Bruker DRX-500 met signaal dat van de interne standaard hoogte (DSS, 0 ppm).
Figuur 2. Principal component analyse (PCA) score plot voor binned NMR-spectra van metabolomes van natuurlijk afgeleid microbiële gemeenschappen plankton gegroeid in een microkosmos met natuurlijke (open ruiten) of kunstmatige (zwarte cirkels) zeewater. Duidelijke metabole verschillen kunnen worden waargenomen in de scatterplot. Een geladen plot van deze analyse kan dan worden gebruikt om verschillende pieken van belang zijn voor hethet systeem deze pieken kan verder worden geanalyseerd nodig.
Figuur 3. Een voorbeeld van multi-omics analyse combinatie met NMR genomische data. Gemeenschap samenstelling op basis van denaturerende gradiënt gel elektroforese van 18S (links) en 16S (rechts) rRNA genen van dezelfde monsters zoals geanalyseerd in Figuur 2 laat ook verschillende microbiële gemeenschap patronen tussen natuurlijke (open ruiten) en kunstmatige (zwarte cirkels) zeewater microkosmossen. Deze briefwisseling tussen metaboloom en genoom van natuurlijke systemen zien het nut van deze aanpak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De filtratie en metaboliet extractiemethode aangetoond hier zorgt voor microbiële plankton biomassa kan worden geïnd in voldoende hoeveelheid voor NMR metabolomics. Terwijl slechts extractie van water-oplosbare metabolieten met behulp van KPI en 1D 1 H NMR is aangetoond, kunnen andere extractiemiddelen en spectroscopische methoden worden gebruikt. Een goed voorbeeld is het gebruik van gedeutereerde methanol als semi-polair oplosmiddel, dat is aangetoond dat superieure NMR spectra produceren van heterogene monsters en is minder gevoelig voor vervuiling door paramagnetische ionen zoals gevonden in mariene monsters 15. In dergelijke gevallen moet de pellet van de extractie hoger worden gehandhaafd opeenvolgende extracties. Ons eerdere werk is gebleken dat de stabiliteit van spectra onder zulke incubatie tijden en temperaturen en de geschiktheid van de directe extractie met water voor de NMR-spectroscopie 15,20. Echter onderzoekers ook extractiestappen veranderen, bijvoorbeeld door een voorkeur Denastructurering stap enzymen te inactiveren vóór extractie of door snelle afkoeling methoden die verschillen van alleen het bevriezen van de cellen getoond. Bovendien, terwijl de methode hier gepresenteerde meest geschikt voor het waarnemen proportionele veranderingen in metabolieten in behandelingen, desgewenst filters worden afgewogen en daarna opnieuw gewogen na monster filtratie en lyofilisatie van droge gewicht of het volume van het monster gefiltreerd kan verkrijgen gebruikt om meer kwantitatieve metaboliet brondata te verkrijgen.
Uiteindelijk wordt het nut van NMR voor plankton monsters beperkt door de hoeveelheid massa die met succes kunnen worden verzameld, ook high-density culturen kan het nodig grote hoeveelheden (> 100 ml) om voldoende droge biomassa te verkrijgen. Echter, binnen een experimenteel kader, stabiele isotoop etikettering in micro-of mesocosmosexperimenten, 2D 1 H-13 C heteronucleair enkele quantum coherentie (HSQC) benaderingen zijn mogelijk. Verder hebben we tevens worden gebruikt 47 -mm filters en 5-ml polypropyleen buizen om de hoeveelheid biomassa die kan worden verzameld voor extractie, want zelfs grotere volumes te verhogen kan het nodig zijn (dwz> 2 L) voor de natuurlijke gemeenschappen van bijvoorbeeld oligotrofe wateren waar celdichtheden laag zijn.
Filtratie is voordelig dan centrifugering zoals het is onze observatie dat sommige kleinere microbiële taxa (met name de kleine heterotrofe bacteriën) vaak niet te doen pellet goed. Filtratie kan handmatig worden uitgevoerd in het veld en gefiltreerd de volumes worden alleen beperkt door het aantal beschikbare filters. Bovendien kan dan water media of worden verwijderd deze wijze en de monsters worden gespoeld indien nodig. Uiteraard zelfs filtratie wordt verzameld gemeenschap worden beperkt tot een deeltjesgrootteverdeling beneden de filterafsnijfrequentie, in dit voorbeeld 0,22 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd mede ondersteund door subsidies-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek voor de aanhouding van verkennend onderzoek (JK), en Wetenschappelijk Onderzoek (A) (JK en SM) van het ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie, Japan . Een RIKEN FPR fellowship (RCE), mits extra ondersteuning. De auteurs uiten hun dankbaarheid aan Drs. Eisuke Chikayama, Yasuyo Sekiyama en Mami Okamoto voor technische bijstand met behulp van NMR en statistische analyses.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm hydrophilic Durapore PVDF filters, 25 mm | EMD Millipore | GVWP02500 | |
| Microanalysis Filter Holder, 25 mm, fritted glass support | EMD Millipore | XX1002500 | |
| 3-place manifold, 47 mm, stainless steel | EMD Millipore | XX2504735 | |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-04245 | |
| K2HPO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 164-04295 | |
| Deuterium oxide, 2H > 90% | Campridge Isotope Laboratoties | DLM-4 | |
| DSS | Fluka | 92754 | |
| Automill | Tokken | TK-AM4 | Stainless steel crushers included |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Vacuum evaporator | EYELA | CVE-3100 | |
| NMR | Bruker Corporation | DRX-500 with 5 mm-TXI probe | |
| Spectral binning tool | Originally developed | FT2DB | https://database.riken.jp/ecomics/ |
| Metabolite annotation tool and database | Originally developed | SpinAssign | http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search |
References
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: a critical review and future perspectives. Metabolomics. 5, 3-21 (2008).
- Chikayama, E., et al. Statistical indices for simultaneous large-scale metabolite detections for a single NMR spectrum. Anal. Chem. 82, 1653-1658 (2010).
- Lewis, I. A., Schommer, S. C., Markley, J. L. rNMR: open source software for identifying and quantifying metabolites in NMR spectra. Magn. Reson. Chem. 47, S123-S126 (2009).
- Li, M., et al. Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2117-2122 (2008).
- Mochida, K., Furuta, T., Ebana, K., Shinozaki, K., Kikuchi, J. Correlation exploration of metabolic and genomic diversity in rice. BMC Genomics. 10, 568 (2009).
- Fukuda, S., et al. Bifidobacteria can protect from enteropathogenic infection through production of acetate. Nature. 469, 543-547 (2011).
- Kikuchi, J., Hirayama, T. Practical aspects of stable isotope labeling of higher plants for a hetero-nuclear multi-dimensional NMR-based metabolomics. Methods Mol. Biol. 358, 273-286 (2007).
- Martin, F. P., et al. A top-down systems biology view of microbiome-mammalian metabolic interactions in a mouse model. Mol. Syst. Biol. 3, 112 (2007).
- Mahrous, E. A., Lee, R. B., Lee, R. E. A rapid approach to lipid profiling of mycobacteria using 2D HSQC NMR maps. J. Lipid Res. 49, 455-463 (2008).
- Fukuda, S., et al. Evaluation and characterization of bacterial metabolic dynamics with a novel profiling technique, real-time metabolotyping. PloS ONE. 4, e4893 (2009).
- Date, Y., et al. New monitoring approach for metabolic dynamics in microbial ecosystems using stable-isotope-labeling technologies. J. Biosci. Bioeng. 110, 87-93 (2010).
- Nakanishi, Y., et al. Dynamic omics approach identifies nutrition-mediated microbial interactions. J. Proteome Res. 10, 824-836 (2011).
- Falkowski, P., Barber, R., Smetacek, V. Biogeochemical controls and feedbacks on ocean primary production. Science. 281, 200-207 (1998).
- Viant, M. R. Metabolomics of aquatic organisms: the new 'omics' on the block. Mar. Ecol. Prog. Ser. 332, 301-306 (2007).
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Evaluation of a semipolar solvent system as a step toward heteronuclear multidimensional NMR-based metabolomics for 13C-labeled bacteria, plants, and animals. Anal. Chem. 83, 719-726 (2011).
- Delaglio, F., et al. NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR. 6, 277-293 (1995).
- Wang, T., et al. Automics: an integrated platform for NMR-based metabonomics spectral processing and data analysis. BMC Bioinformatics. 10, 83 (2009).
- The R Project for Statistical Computing. , Available from: http://www.r-project.org/ (2010).
- Eldon, L., et al.
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Profiling polar and semipolar plant metabolites throughout extraction processes using a combined solution-state and high-resolution magic angle spinning NMR approach. Anal. Chem. 82, 1643-1652 (2011).
