Summary
En metod för metabolit extraktion från mikrobiella planktoniska samhällen presenteras. Hela samhället provtagning åstadkommas genom filtrering på speciellt beredd filter. Efter lyofilisering, är vatten-lösliga metaboliter extraheras. Detta tillvägagångssätt möjliggör tillämpningen av miljövänlig metabolomik till trans-Omics undersökningar av naturliga eller experimentell mikrobiella samhällen.
Abstract
Miljö metabolomik är ett framväxande fält som främjar ny förståelse i hur organismer svara på och interagera med omgivningen och varandra på biokemisk nivå 1. Kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi är en av flera tekniker, inklusive gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS), med stor lovande för sådana studier. Fördelar med NMR är att den är lämplig för oriktade analyser, ger strukturell information och spektra kan söka i kvantitativa och statistiska sätt mot senast tillgängliga databaser för enskilda metaboliten spektra 2,3. Dessutom kan NMR-data kombineras med data från andra Omics nivåer (t.ex. transkriptomik, genomik) för att ge en mer heltäckande förståelse av de fysiologiska svaren från taxa till varandra och miljön 4,5,6. Emellertid är NMR mindre känsliga än andra metabolomic tekniker, vilket gör det svårt att apskikt av naturliga mikrobiella system där prov populationer kan vara låg densitet och metabolit koncentrationer låg jämfört med metaboliter från väl definierade och lätt extraherbara källor som hela vävnader, Biofluids eller cell-kulturer. Följaktligen har de få direkta miljö metabolomic studier av mikrober som utförts hittills varit begränsad till kultur-baserade eller enkelt definieras med hög densitet ekosystem som värd-symbiont system, konstruerade co-kulturer eller manipulationer av tarmen miljö där stabila isotopen märkning kan dessutom användas för att förbättra NMR signaler 7,8,9,10,11,12. Metoder som underlättar koncentrationen och samlingen av miljömässiga metaboliter vid koncentrationer som är lämpliga för NMR saknas. Eftersom den senaste tidens uppmärksamhet har ägnats åt de miljömässiga metabolomik för organismer i vattenmiljön, där mycket av den energi och materialflödet förmedlas av plankton samhället 13,14, har vi utvecklat en metod för koncentrationenning och utvinning av hela samhället metaboliter från system planktoniska mikrobiella genom filtrering. Kommersiellt tillgängliga hydrofila poly-1 ,1-difluoroethene (PVDF)-filter är speciellt behandlad för att fullständigt avlägsna extraherbara, som annars kan förekomma som föroreningar i efterföljande analyser. Dessa behandlade filtren används sedan för att filtrera miljö eller experimentella prover av intresse. Filter innehåller det våta provet materialet är frystorkat och vattenlösliga metaboliter utvinns direkt för konventionella NMR-spektroskopi med hjälp av en standardiserad kaliumbuffert fosfat utvinning 2. Uppgifter som härrör från dessa metoder kan analyseras statistiskt för att identifiera meningsfulla mönster eller integreras med andra Omics nivåer för förståelse av gemenskap och ekosystemens funktion.
Protocol
1. Filter Förberedelse att ta bort Extraherbara
- Använd 25-mm diameter 0,22 um por-storlek Durapore PVDF hydrofila filter (Millipore). Placera filter i en ren 500 ml Pyrex bägare med pincett. Förspolning tre gånger med destillerat vatten. Swirl och du sköljer för att förhindra att filtren fastnar vid varandra. Tillsätt 300 ml Milli-Q (Millipore) eller ekvivalent vatten av hög kvalitet. Autoklavera för att underlätta fullständig borttagning av extraherbara från filtren.
- Häll av Milli-Q och åter tredubbla skölj filtren, den här gången med Milli-Q. Med pincett placera enskilda filter på en ren och torr yta (t.ex. aluminiumfolie) och antingen torka till en rimlig temperatur (t.ex. 37 ° C) eller lufttorka. Filtren är nu redo att användas.
2. Filtrering av provmaterial
- För att visa detta protokoll, ett Millipore rostfritt stål 3-plats-filter grenrör med 25-mm mikroanalys filter kolonner med glas stöderoch en mekanisk pump används. Använd aseptisk teknik, placera en 25-mm-filter på filtret kolumnen basen, tillämpa kolumnen och klämma ihop.
- Ladda 15 ml av provet till kolonnen, öppna avstängningsventilen på filtret grenröret och slå på pumpen. Filtrera under försiktigt tryck för att minimera cellsprängning (<5 kPa). Andra pumpar, såsom hand eller en peristaltisk pump kan anpassas till detta protokoll. För lägre densitet prover kan successiva tillsatser av vatten vara nödvändigt, låt inte filtret sinar under en längre tid mellan tillsatser av vatten.
- För prover från havet, efter att du har filtrerat ditt prov, kan du utföra en valfri sötvatten skölj att minska kvarvarande paramagnetiska joner i provet och på filtret. Detta kan hjälpa till med mer exakt inställning av spektrometern magneten. Bara försiktigt lägga till en liten volym vatten och filtrera genom din samlade prov på slutet.
- När filtrering är klar, stäng av pumpen och lämna ventilen OPEn så finns det fortfarande ett negativt tryck under filtret. Ta bort klämman och filter kolumn.
- Med ena handen, använd rena pincett för att ta tag i filtret. Vik filter över sig, men inte veck. Med den andra handen använder läppen av en steril 2-ml mikrocentrifugrör att hålla ner filtret. Släpp pincetten sedan använda dem för att åter gripa båda kanterna av filtret. Regrip vid en 45 ° vinkel mot vecket.
- Placera filtret i 2-ml rör och release så den öppnas med provet vänd inåt. Du kan placera upp till två filter i den sterila 2 ml mikrocentrifugrör detta sätt. Om du använder två filter, se till att de överlappar så lite som möjligt. Omedelbart frysa (åtminstone -30 ° C).
3. Extraktion av vattenlösliga Metaboliter
- Lyofilisera dina prover natten eller i minst 10 timmar.
- Efter lyofilisering, tillsätt en rostfri kross till varje rör (Tokken). Lägg 750 xl standardiserad kaliumfosfat NMR buffert i deuteriumoxid (2 H> 90%) med 2,2-dimetyl-2-silapentan-5-sulfonat (DSS) standard (KPI, 38,3 mM KH 2 PO 4, 61,7 mM K 2 HPO 4, DSS 0,1 mM, pH 7,0, 90% D2O) 2.
- Sonikera proverna under 5 minuter vid 4 ° C i en vatten sonikator (Bioruptor, Diagenode) för att avlägsna cellen materialet från filtret. Ta bort filter med rena pincett.
- Sönderdela cellerna med användning av en kvarn kross (1600 rpm) under 5 minuter.
- Inkubera vid 65 ° C med skakning (1400 rpm) på en bänk skakapparat (Eppendorf) under 15 minuter.
- Avlägsna metall gris med rena pincett, och centrifugera provet vid 13000 g under 5 minuter.
- Dra bort den överstående direkt till ett NMR-rör för NMR-spektroskopi.
4. NMR-spektroskopi och dataanalys
- Ladda ditt prov till en NMR-spektrometer (här, en Bruker DRX-500 spektrometer utrustad medTXI sond med trippel-axel gradient styrs av en dator som kör XWIN-NMR).
- Skaffa 1D 1 H NMR-spektra med lämpliga tidigare publicerade metoder 2,15 från XWIN-NMR gränssnitt. I föreliggande studie 1 H-NMR-spektra registrerades på en DRX-500 spektrometer som verkade vid 500,03 MHz på 298 K. Kvarvarande vatten signaler undertrycks av Watergate pulssekvens, med en repetitionstid av 1,2 s. 128 transienter samlades för att erhålla 32.000 datapunkter per spektrum.
- Överför NMR uppgifter kataloger till en dator installerad NMRPipe program 16. Bearbeta rådata och DSS set som 0 ppm referens sedan manuellt fas spektra. Digitalisera de spektrala data i en uppsättning av diskreta värden genom att integrera eller "binning" dem med program som rNMR, Automics, eller använda den allmänt tillgängliga FT2B paket från ECOMICS webbplats ( https://database.riken.jp/ecomics/ ) 3,17. I: teär exempel har spektra integrerad mellan 0,5 och 10,5 ppm över 0,032 ppm integrerade regioner med ECOMICS och normaliserade till antingen DSS eller total signalstyrka. Utdata kan nu användas för efterföljande statistisk analys som huvudsakliga beståndsdelar analys (PCA) med hjälp av gratis programvaror som R 18.
5. Representativa resultat
Ett exempel på en H-NMR-spektra erhölls med användning av de ovan nämnda metoderna, visas i figur 1. Dessa prover från två tidpunkter i en mikrokosmos experiment visar tydliga skillnader på grund av alger metaboliska aktiviteter. Dagen 4-spektrum visar avsevärd förekomst av toppar, i synnerhet i 3-4 ppm-området jämfört med dag 1 prov. Dessa toppar kan hänföras till socker som produceras av blommar kiselalger i mikrokosmos. I ett liknande experiment jämför tillväxten av naturliga planktonsamhällen i konstgjorda eller naturliga havsvatten, statistiska metoder sn sådan som huvudkomponent (PCA) viktad plot härledd från binned NMR-spektra kan användas för att visa klara metaboliska skillnader mellan de två behandlingarna (Fig. 2), medan laddning kurvorna kan identifiera toppar i spektrumet som formar fördelningen av datan . Sådana resultat kan jämföras med data från andra Omics nivåer, t ex från genomiska fingeravtryck metoder (Fig. 3). Dessa NMR toppar kan frågas individuellt (t.ex. vid BMRB, http://www.bmrb.wisc.edu/ ) 19, eller hela spektra kan analyseras statistiskt (t.ex. med SpinAssign på http://prime.psc.riken. jp /? action = nmr_search ) 2. I detta exempel fanns skillnader mellan behandlingarna på grund ett överflöd av toppar i socker-regionen (3,39 ppm till 4,04 ppm) av spektra från naturliga planktonsamhället metaboliter, och flera toppar karakteristiska för de artificiella havsvattnet samhällena var experimentellt identified som laktat och formiat med användning SpinAssign.
Figur 1. Representativa 1 H-NMR-spektra erhölls från bearbetade proverna med användning av detta förfarande. Mikrokosmos togs före (dag 1) och under (dag 4) en intensiv kiselalger Bloom. NMR-experiment utfördes på en Bruker DRX-500 med signaler normaliserades till den interna standarden topphöjden (DSS; 0 ppm).
Figur 2. Principal Component Analysis (PCA) viktad plot för binned NMR-spektra från metabolom av naturligt härledda samhällen mikrobiella planktoniska odlade i mikrokosmos med naturlig (öppna romber) eller artificiella (svarta cirklar) havsvatten. Tydliga metaboliska skillnader kan observeras i spridningsdiagram. En laddning kurva från en sådan analys kan sedan användas för att identifiera distinkta toppar av betydelse isystemet, kan dessa toppar analyseras ytterligare vid behov.
Figur 3. Ett exempel på multi-omics analys genom NMR med genomiska data. Samfundet komposition baserad på denaturerande gradientgel-elektrofores av 18S (vänster) och 16S (höger)-rRNA-gener från samma prover som analyserats i Fig. 2 visar också olika mönster mikrobiella mellan naturliga (öppna romber) och artificiella (svarta cirklar) havsvatten mikrokosmer. Sådan korrespondens mellan metabolome och arvsmassan från naturliga system visar nyttan av denna strategi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Filtrering och metabolit extraktionsmetod visas här möjliggör mikrobiell planktoniska biomassa som skall samlas in i tillräcklig mängd för NMR metabolomik. Medan endast extraktion av vattenlösliga metaboliter med KPI och 1D 1 H-NMR visas, kan andra extraktionsmedel och spektroskopiska metoder användas. Ett användbart exempel är användningen av deutererad metanol som ett halvfast polärt lösningsmedel, som har visat sig ge överlägsen NMR-spektra från heterogena prov och är mindre känslig för kontamination av paramagnetiska joner som finns i prover från havet 15. I sådana fall bör den pelleten från extraktionen ovan sparas för successiva extraktioner. Vårt tidigare arbete har visat stabilitet spektra under sådana inkubationstider och temperaturer och lämpligheten av direkt vattenextraktion för NMR-spektroskopi 15,20. Men forskare kan också föredra att modifiera extraktion steg, till exempel genom att använda en denaturering steg för att inaktivera enzymerna före extraktion, eller genom användning av snabb-släckande metoder som skiljer sig från att endast frysa cellerna som visas här. Dessutom, medan de metoder som presenteras här är bäst lämpade för att observera proportionella förändringar i metaboliter över behandlingar, om så önskas, kan filter i förväg vägs och vägs sedan igen efter prov filtrering och frystorkning för att få torra vikt eller volym av provet filtreras kan användas för att få mer kvantitativa metaboliter källdata.
Ytterst är nyttan av NMR för planktoniska prov begränsas av den mängd massa som kan framgångsrikt in, även med hög densitet kulturer kan kräva stora volymer (> 100 ml) för att erhålla tillräcklig torr biomassa. Men inom en experimentell ram, stabil isotop märkning i mikro-eller mesokosmförsök, 2D 1 H-13 C-heteronukleär enkel kvantkoherensspektroskopi (HSQC) tillvägagångssätt är möjliga. Vidare har vi använt dessutom 47 -mm filter och 5-ml rör polypropylen för att öka mängden biomassa som kan samlas in för extraktion, eftersom även större volymer kan det vara nödvändigt (dvs> 2 L) för naturliga gemenskaper från, t ex näringsfattiga vatten där celldensiteter är låga.
Filtrering är fördelaktig jämfört med centrifugering då det är vår observation att en del mindre mikrobiell taxa (särskilt små heterotrofa bakterier) ofta inte gör pellets bra. Filtrering kan utföras manuellt i fält, och de filtrerade volymer begränsas endast av antalet filter tillgängligt. Dessutom kan överskott av medium eller vatten kan avlägsnas på detta sätt, och proverna kan sköljas om så behövs. Naturligtvis även med filtrering, kommer gemenskapen som samlats in skall begränsas till en storleksfraktion ner till filtret cutoff, som i detta exempel är 0,22 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna forskning stöds delvis av Grants-i-Stöd till vetenskaplig forskning för att utmana explorativ forskning (JK), och vetenskaplig forskning (A) (JK och SM) från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik, Japan . En RIKEN FPR gemenskap (RKS) gav ytterligare stöd. Författarna uttrycker sin tacksamhet till Dr. Eisuke Chikayama, Yasuyo Sekiyama och Mami Okamoto för tekniskt bistånd med NMR och statistiska analyser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm hydrophilic Durapore PVDF filters, 25 mm | EMD Millipore | GVWP02500 | |
| Microanalysis Filter Holder, 25 mm, fritted glass support | EMD Millipore | XX1002500 | |
| 3-place manifold, 47 mm, stainless steel | EMD Millipore | XX2504735 | |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-04245 | |
| K2HPO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 164-04295 | |
| Deuterium oxide, 2H > 90% | Campridge Isotope Laboratoties | DLM-4 | |
| DSS | Fluka | 92754 | |
| Automill | Tokken | TK-AM4 | Stainless steel crushers included |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Vacuum evaporator | EYELA | CVE-3100 | |
| NMR | Bruker Corporation | DRX-500 with 5 mm-TXI probe | |
| Spectral binning tool | Originally developed | FT2DB | https://database.riken.jp/ecomics/ |
| Metabolite annotation tool and database | Originally developed | SpinAssign | http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search |
References
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: a critical review and future perspectives. Metabolomics. 5, 3-21 (2008).
- Chikayama, E., et al. Statistical indices for simultaneous large-scale metabolite detections for a single NMR spectrum. Anal. Chem. 82, 1653-1658 (2010).
- Lewis, I. A., Schommer, S. C., Markley, J. L. rNMR: open source software for identifying and quantifying metabolites in NMR spectra. Magn. Reson. Chem. 47, S123-S126 (2009).
- Li, M., et al. Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2117-2122 (2008).
- Mochida, K., Furuta, T., Ebana, K., Shinozaki, K., Kikuchi, J. Correlation exploration of metabolic and genomic diversity in rice. BMC Genomics. 10, 568 (2009).
- Fukuda, S., et al. Bifidobacteria can protect from enteropathogenic infection through production of acetate. Nature. 469, 543-547 (2011).
- Kikuchi, J., Hirayama, T. Practical aspects of stable isotope labeling of higher plants for a hetero-nuclear multi-dimensional NMR-based metabolomics. Methods Mol. Biol. 358, 273-286 (2007).
- Martin, F. P., et al. A top-down systems biology view of microbiome-mammalian metabolic interactions in a mouse model. Mol. Syst. Biol. 3, 112 (2007).
- Mahrous, E. A., Lee, R. B., Lee, R. E. A rapid approach to lipid profiling of mycobacteria using 2D HSQC NMR maps. J. Lipid Res. 49, 455-463 (2008).
- Fukuda, S., et al. Evaluation and characterization of bacterial metabolic dynamics with a novel profiling technique, real-time metabolotyping. PloS ONE. 4, e4893 (2009).
- Date, Y., et al. New monitoring approach for metabolic dynamics in microbial ecosystems using stable-isotope-labeling technologies. J. Biosci. Bioeng. 110, 87-93 (2010).
- Nakanishi, Y., et al. Dynamic omics approach identifies nutrition-mediated microbial interactions. J. Proteome Res. 10, 824-836 (2011).
- Falkowski, P., Barber, R., Smetacek, V. Biogeochemical controls and feedbacks on ocean primary production. Science. 281, 200-207 (1998).
- Viant, M. R. Metabolomics of aquatic organisms: the new 'omics' on the block. Mar. Ecol. Prog. Ser. 332, 301-306 (2007).
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Evaluation of a semipolar solvent system as a step toward heteronuclear multidimensional NMR-based metabolomics for 13C-labeled bacteria, plants, and animals. Anal. Chem. 83, 719-726 (2011).
- Delaglio, F., et al. NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR. 6, 277-293 (1995).
- Wang, T., et al. Automics: an integrated platform for NMR-based metabonomics spectral processing and data analysis. BMC Bioinformatics. 10, 83 (2009).
- The R Project for Statistical Computing. , Available from: http://www.r-project.org/ (2010).
- Eldon, L., et al.
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Profiling polar and semipolar plant metabolites throughout extraction processes using a combined solution-state and high-resolution magic angle spinning NMR approach. Anal. Chem. 82, 1643-1652 (2011).
