Summary
複数の発達段階におけるゼブラフィッシュの心臓の解剖と分離のための明確な、標準化された方法が説明されています。注釈と定量化の手法についても説明します。
Abstract
ゼブラフィッシュは、胚心臓の開発の研究のために有益で実用的なモデル生物となっています（最近のレビュー1-6を参照）、しかし、成人の心臓の開発を通じて、後の胚調べるが70から10に制限されて動作する。成熟と老化の心の変化形態を調べることは少年と大人の心をステージングし、単離するための利用可能な技術の不足によって制限されます。魚の寿命を介して心臓の開発を分析するために、我々は多数の段階でゼブラフィッシュの心臓を解剖し、さらなる分析の11のそれらを撮影する。心臓の形態学的特徴は、容易に定量化することができると、個々の心は、さらに標準的な方法のホストで解析することができます。ゼブラフィッシュは、可変レートで成長し、成熟は、魚の成熟のゲージのようなので、後固定、我々の写真と測定の魚の長さを年齢よりも魚のサイズとのより良い相関する。このプロトコルは、30mmのSLとVL 1mm以上大きいと、大人に100μmの心室の長さの心（VL）と幼虫3.5ミリメートルの標準長さ（SL）に至るまでゼブラフィッシュの2つの異なる、サイズ依存解剖の技術を、、説明しています。仔魚と成魚では全く異なる身体や臓器の形態を持っている。幼虫は唯一大幅に小さくはない、彼らは以下の顔料を持っており、各器官は視覚的に識別することは非常に困難です。このような理由から、我々は明確な解剖の技術を使用してください。
我々は安楽死の直後に解剖の心には、次の固定を除去心と比較して心房のような非常に緩いとバルーンで、より多くの変数形態を持っていることを発見したように我々は、事前に解剖の固定手順を使用する。前の解剖に固定された魚は、 生体の形態とチャンバーの位置（データは示さず） に保持されます。私たちは、心臓全体を視覚化できるとするときに心臓の開発の初期段階で特に有用であるtwu34（12）、：加えて、デモンストレーションの目的のために、我々は、心臓（心筋）特定のGFPトランスジェニックTgは（GFP myl7）を活用する形態は、周囲の組織から少なく明瞭である。心臓の解剖は、in situハイブリダイゼーション、免疫組織化学、RNAの抽出または後の胚ゼブラフィッシュで簡単に他の分析方法で使用して心臓の開発と成熟の根底にある細胞と分子生物学のさらなる分析を行います。このプロトコルは、心臓の開発の成熟と老化の研究のための貴重なテクニックを提供します。
Protocol
ゼブラフィッシュは、28時クイーンズ大学の動物施設での13個の標準プロトコル℃を用いて提起された個々の魚のペアまたはグループの交配は、あらかじめ形成し、その結果胚は、洗浄し、28℃のインキュベーターに格納する必要があります。魚の健康状態を毎日検討する必要があります。 5日後の受精（DPF）で、魚は10-15魚の密度でタンクに区切る必要がありますし、魚の施設の保育園を締結した。 15、30、45、60、90、180 DPF：ここで紹介するプロトコルのためにゼブラフィッシュは、成体の段階を経て幼虫で回収された。
1。ゼブラフィッシュの主題のコレクションと固定
- 麻酔は0.2％Tricaineでネットと場所を使用して、生息地のタンクから魚を取り外します。
- 安楽死させる15分間氷水で麻酔した魚を置きます。
- 1Xリン酸緩衝食塩水（PBS）で新鮮な4％パラホルムアルデヒド（PFA）を作る。
- 4℃で一晩室温で1-2時間、4％PFAで収集された魚をインキュベートしますパラフィルムでラップされたペトリ皿でC。これは魚のフラットを保持し、後で解剖が容易になります。
- 固定後、ツイーン（PBT）をPBSで2回すすいでください。魚は、最大10日間4℃でPBTしてくださいすることができます。
2。魚や解剖の測定
- ペトリ皿の半分に代わり、単一の魚は新鮮なPBSで満たされ、その右側に置きます。
- デジタルミリメートルキャリパー（図1）を使用していないテールフィンを含む、鼻から尾の付け根（尾柄部）への魚の測定の長さ、、。これは標準の長さ（SL）です。
- それぞれの魚は後で分析するために追跡する個々の魚と結果の解剖、心臓を可能にするために数値/文字の組み合わせを割り当てることができます。親の株式の数、固定時の年齢、SLの測定を含むデータは、スプレッドシートに入力され、これらのラベルに基づいて組織された。
- 割り当てられている追跡番号を持つ郭清、ラベルPCRチューブストリップの前に、さらなる分析のために適切なPBTまたは他の溶液を満たす。
- オリエントペトリ皿の上の魚腹側眼と鰓（図2）の間に頭部を保持して鉗子で体を安定化しながら。
小さ な魚（12ミリメートルSLよりも小さい）。
- ピンホルダーの急激な鉗子を使用して）、またはマイクロ針、心を明らかにするためにボディから胸筋とフィンを削除します。解剖時に鉗子の一定の動きは、魚を移動するPBTの電流を引き起こす可能性があります。これは、このように、マイクロ針が胸筋とフィンを削除し、体腔を開くために使用できる、小型魚のために特に問題です。
- a）はゆっくりと吹き抜けの下からキャビティから心臓をえぐり出すために鉗子を使用する。交互に、いくつかの魚では静かに球根状の外に引き出し、心の残りが続くことによって心臓を削除することができます。それは簡単に破損することができるようにこのテクニックを使用している場合はアトリウムの位置に注意してください。心に付属している余分な組織がある場合、それは素晴らしいですし、後にクリアすることができます。
- 魚はそのようなTG（myl7として蛍光心臓マーカーが含まれている場合はA）：GFP）twu34を 、解剖用蛍光スコープを使用し、蛍光（図3）により、心臓の除去を確認してください。
- 心臓後）は空洞から削除され、心臓の外から余分な非心臓組織と心外膜ライニングを削除するには、心臓やマイクロ針を保持するために鉗子を使用する。
大きな魚（12ミリメートルSLよりも大きい）。
- b）の春は、マイクロはさみを処理する使用は、深さ1mm未満の三切開して：1 - 鰓2を介して横方向のカット - 前腹3での横方向のカット - カット（図4）の両方を接続する腹側矢状カット。
- B）鋭いピンセットを使用して体腔を開くためにボディから胸筋とフィンを削除し、心膜（図5A）の銀色の組織を明らかにする。この心膜組織を切除すると心臓が（図5B）見えるようになります。
- b）の中心に優れた位置球根状の動脈に接続されている動脈を、カットするマイクロはさみを使用してください。この動脈が切断されると、アトリウムの下に鉗子先端を入れて、空洞の中心をかき出すために鉗子を使用する。心に付属している余分な組織がある場合、それは素晴らしいですし、後で削除することができます。
- 心が空洞から削除されたらb）に、余分な、非心臓組織を除去するために心臓やマイクロ針を保持するために心を保持し、余分な組織を削除するには2つの鉗子を使用して、または鉗子の一組。そっとティッシュをこすることによって、必要に応じて、その黒い色素沈着によって明らか心外膜ライニングは、心臓の外側から削除することができます。
3。心の写真
- 23グラム/ L寒天培地をペトリ皿を準備し、PBSで固化した寒天をカバー。
- 鉗子を使用して、心臓が撮影のために所望の配向で休むことができる寒天でよくすること。
- リムーバブルしっかりと鉗子と球根状の先端部を保持することによってPCRチューブからのEは心臓。寒天料理で心を置きます。
- 写真の寒天のオリエントの中心。サンプルは、全ての可能な方向（図6）に、各ピクチャの後に回転させることができる。
- 心を撮影するためにオーバーヘッドが光と短い露光時間を使用してください。最高の写真を得るために、必要に応じて露光を用いて光質のための調整を行います。
4。代表的な結果：
よく解剖クリーン心臓の例を図6に複数の向きで表示されます。それぞれの心には、全体的な形態のいくつかの違いがあるわけだが、心はそのまま心室、心房と球根状の動脈を含む、完全なはずです。全体的な形態におけるこの変化のいくつかの例を図7に示されています。黒い斑点心外膜組織はまた、心臓から削除できます。
図1鼻からデジタルミリメートルキャリパーを使用して、尾柄部に魚を測定します。
図2：目と鰓の間にピンセットで魚を持ちます。
図3のようTG（myl7：GFP）などの心臓特異的蛍光遺伝子組換えマーカー。ここに示されているtwu34は 、、小さな魚から摘出心を視覚化に役立ちます。
図4胸筋と皮膚を除去するための3つの切開部：1 -鰓2を介して横方向のカット-前腹3での横方向のカット-両方のカットを結ぶ腹側矢状カット。。
。球根状の動脈（BA）、心室（V）、およびアトリウム（）： 図5ブラック文字は、心臓の室にラベルを付けます。
大文字体腔は心膜の銀色の組織を表示する開いている。
B -後に心膜を除去し、心は目に見えると簡単に削除です。
心臓の図6。異なる方向が表示されます。球根状の動脈（BA）、心室（V）、およびアトリウム（）：黒い文字は、心臓の室にラベルを付けます。 、（）前方後方（P）、背側（D）、腹側（V）、左（L）、右（R）：グレーの矢印は、体内での正常な位置への参照の中心の位置と方向を示している。スケールバーは400μmを示しています。
心臓の腹ビュー
心臓のB -背ビュー
左サイドからのC -側面図
右側からD -側面図
図7。異なるサイズの心臓の形態が示されています。球根状の動脈（BA）、心室（V）、およびアトリウム（）：黒い文字は、心臓の室にラベルを付けます。スケールバーは400μmであることを示した。
AC -ハーツ未満12ミリメートルSLを持つフォームの魚
DF -ハーツ12ミリメートルを超えてSLを持つフォームの魚
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Discussion
後胚魚のゼブラフィッシュの心臓の解剖のためのこれらのメソッドは、無傷の心を完全に除去することができます。この手法は単純で、心臓の損傷を防止する外部削減のためのガイドを提供していますが、着実に手は小さい魚のために不可欠です。
解剖時の重要なステップは、心臓がこの嚢に直接そのまま銀色の心膜を特定することです。心膜を視覚化することはボディの空洞を発見し、最終的に心臓のフォームを削除するための重要なマーカーを提供する。さらに、球根状の動脈に優れた動脈をカットすると、心臓の他の部分から球根状の不注意による削除を防止します。大きい魚では、解剖時の心臓の安定を含む頭部や上半身を保つために体の下の部分を削除するために必要な場合があります。これは、はさみで体腔と背骨を通して低く横カットを継続することによって行うことができます。
ゼブラフィッシュの心臓の解剖は、私たち自身の成熟の解析と同様の研究に有用ではありませんが、ゼブラフィッシュの病気の状態、心に、そして心を利用して他の分析研究におけるRNAの分離の研究に役に立つかもしれません。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
マリーBirne、Areti Tsiola、JaymieベスとArelysウリベのおかげ。この作品は、CUNY研究財団、ハワードヒューズ医学研究所のグラントのサマープログラム学部生用（平）とNIH RO3 41702-00-01によって部分的にサポートされていました。研究はまた、クイーンズカレッジによってサポートされていましたし、実験の一部は、イメージングのための中核施設、クイーンズ大学で細胞分子生物学からの機器で行われた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | EMD Millipore | PX0055 | .04g/mL in PBS |
| Forceps #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Micro-needles | Fine Science Tools | 10130-10 | |
| Nutrient Agar | BBL | 11472 | 23g/L in distilled H2O |
| Petri dishes | BD Biosciences | 351029 | |
| PCR 8-tube strips | USA Scientific, Inc. | 1402-2500 | |
| Digital Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 |
References
- Ahmad, N., Long, S., Rebagliati, M. A southpaw joins the roster: the role of the zebrafish nodal-related gene southpaw in cardiac LR asymmetry. Trends Cardiovasc Med. 14, 43-49 (2004).
- Armstrong, E. J., Bischoff, J. Heart valve development: endothelial cell signaling and differentiation. Circ Res. 95, 459-470 (2004).
- Bakkers, J., Verhoeven, M. C., Abdelilah-Seyfried, S. Shaping the zebrafish heart: from left-right axis specification to epithelial tissue morphogenesis. Dev Biol. 330, 213-220 (2009).
- Glickman, N. S., Yelon, D. Cardiac development in zebrafish: coordination of form and function. Semin Cell Dev Biol. 13, 507-513 (2002).
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin Cell Dev Biol. 18, 27-35 (2007).
- Beis, D. Genetic and cellular analyses of zebrafish atrioventricular cushion and valve development. Development. 132, 4193-4204 (2005).
- Lepilina, A. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127, 607-619 (2006).
- Wills, A. A., Holdway, J. E., Major, R. J., Poss, K. D. Regulated addition of new myocardial and epicardial cells fosters homeostatic cardiac growth and maintenance in adult zebrafish. Development. 135, 183-192 (2008).
- Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238, 2975-3015 (2009).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (1995).
