डीएनए मेथिलिकरण: Bisulphite संशोधन और विश्लेषण

Summary

डीएनए मेथिलिकरण विश्लेषण के लिए सोने के मानक bisulphite परिवर्तित डीएनए के जीनोमिक अनुक्रमण है. इस विधि के साथ तुलना (5 MEC) 5 - मिथाइलसिटोसाइन अम्लीय शर्तों के तहत deamination bisulphite साइटोसिन की वृद्धि की संवेदनशीलता का लाभ लेता है. Unmethylated cytosines लक्ष्य जीनोमिक डीएनए पीसीआर प्रवर्धन के बाद methylated cytosines से प्रतिष्ठित किया जा सकता है.

Protocol

Bisulphite रूपांतरण प्रोटोकॉल

जीनोमिक डीएनए के 2 μg के रूपांतरण के लिए एक मानक प्रोटोकॉल नीचे वर्णित है. जीनोमिक डीएनए (100 पृ 200 μg) के छोटे या बड़ी मात्रा में भी सफलतापूर्वक इलाज bisulphite किया जा सकता है. इन स्थितियों की प्रतिक्रिया लगभग हर लक्ष्य डीएनए अनुक्रम ³ (99.5-99.7%) की पूरी रूपांतरण में परिणाम.

1. डीएनए तैयार

37 ° सी. नोट पर एक 1 घंटे के लिए 18 μl की कुल मात्रा में bisulphite डीएनए lysis बफर (μg 2 टी शाही सेना, 280 एनजी / μl proteinase कश्मीर, 1% एसडीएस) के साथ जीनोमिक डीएनए incubating नमूने तैयार: इस को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है नैदानिक ​​नमूनों से अलग है जहां अभी भी डीएनए के साथ जुड़े प्रोटीन हो सकता है डीएनए के साथ विशेष रूप से अधिक से अधिक bisulphite रूपांतरण.

2. डीएनए विकृतीकरण

1. Denature 2 20 μl के एक मात्रा में एक अंतिम ग हौसले से तैयार 3M NaOH के 2 μl जोड़कर μg डीएनए0.3M के oncentration.
2. 37 नमूनों में सेते ° सी, एक पानी के स्नान में 15 मिनट के लिए एक गर्मी ब्लॉक में 2 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन द्वारा पीछा किया. तुरंत बर्फ पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों जगह है.
3. 4 में ट्यूबों अपकेंद्रित्र ° 10,000 जी पर 10 एस सी, यह सुनिश्चित करने के लिए डीएनए ट्यूब के नीचे है.

3. Bisulphite Deamination

Sulphonation और hydrolytic Deamination

1. 10 मिमी Quinol और संतृप्त सोडियम Metabisulphite पीएच 5.0 (7.6 छ ना ₂ एस ₂ 10 एम NaOH के 464 μl के _साथ 5 हे, पानी के साथ 15 मिलीलीटर बनाया) के ताजा समाधान तैयार . न्यूनतम मिश्रण और वातन के साथ संतृप्त सोडियम bisulphite के समाधान धीरे inverting अभिकर्मक / एच ₂ हे मिश्रण द्वारा हासिल की है . यदि आवश्यक हो, तो 10 एम NaOH के साथ पीएच समायोजित, Metabisulphite नोट का पूरा विघटन के लिए: के रूप में यह एक संतृप्त हल है, छोटे गांठ अभी भी undissolved रह सकती है.
2. 208 में जोड़ेंμl संतृप्त Metabisulphite और 2.31M bisulphite/0.5mM Quinol, पीएच 5.0 के अंतिम एकाग्रता के लिए 240 μl के अंतिम मात्रा में विकृत डीएनए (20 μl) 10mm Quinol 12 μl,. धीरे 10 सेकंड के लिए सभी अभिकर्मकों और अपकेंद्रित्र मिश्रण करने के लिए सुनिश्चित करें बूंदों के सभी ट्यूब के नीचे हैं.
3. खनिज तेल के 200 μl के साथ नमूने ओवरले. 55 डिग्री सेल्सियस एक पानी के स्नान में, 4-16 बजे के लिए नमूने सेते हैं. bisulphite उपचार की लंबाई परिवर्तित किया जा डीएनए की मात्रा और गुणवत्ता पर निर्भर है. गरीब गुणवत्ता या अपमानित डीएनए के डीएनए के लिए, 4 बजे तक ऊष्मायन समय सीमा नोट: यह महत्वपूर्ण है कि है कि bisulphite रूपांतरण अंधेरे में जगह लेता है ऑक्सीकरण से बचने के लिए, इतना है कि अगर संभव लपेटो ट्यूबों पन्नी में ऊष्मायन से पहले नहीं है. .
4. उचित ऊष्मायन समय के अंत में, ट्यूब संक्षिप्त microcentrifuge में स्पिन करने के लिए सुनिश्चित करें के लिए सभी तरल ट्यूब के नीचे है.
5. Bisulphite इलाज डीएनए पुनर्प्राप्तसावधानी से ट्यूब के नीचे से डीएनए समाधान pipetting खनिज तेल के किसी भी लेने के बिना, से तेल की परत के नीचे से.

Desalting

5. एक desalting कॉलम के माध्यम से गुजर रहा है और 50 milli-Q पानी ₍₂ हे MQH) के μl में eluting के द्वारा किसी भी मुक्त bisulphite आयनों निकालें . और जीनोमिक डीएनए की मात्रा और गुणवत्ता पर और कैसे यह तैयार है निर्भर करता है, विभिन्न desalting स्तंभों में इस्तेमाल किया जा सकता है. हम नियमित उपयोग Promega विज़ार्ड स्तंभों साफ़, के रूप में इन स्तंभों को हमेशा हटाने की एसडीएस डीएनए की तैयारी में रूपांतरण के लिए पहले प्रयोग किया जाता के लिए उपयुक्त हैं.

क्षार Desulphonation

6. bisulphite अभिवर्तन uracil अंगूठी से desulphonation द्वारा हटा दिया जाता है. 0.3M की एक अंतिम एकाग्रता हौसले से तैयार 3M NaOH के 5.5 μl जोड़कर Desulphonate, तो 37 डिग्री 15 मिनट के लिए सेते सी नमूने.
7. संक्षिप्त अपकेंद्रित्र और टी शाही सेना (10 मिलीग्राम / एमएल) की 1 μl जोड़ें.
<li> अमोनियम एसीटेट के 33 μl (राष्ट्रीय राजमार्ग ₄ हे एसी), 3M के अंतिम एकाग्रता के लिए 7.0 पीएच के अलावा द्वारा हल बेअसर.
8. इथेनॉल - वेग बर्फ के ठंडे 100% इथेनॉल के 330 μl जोड़कर डीएनए उलटा द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से. एक घंटा के लिए रात भर के लिए 20μC - छोड़ो. 4 में 15 मिनट के लिए 14,000 ग्राम पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस निकालें सतह पर तैरनेवाला और हवा के सभी निशान ~ 20 मिनट के लिए उपजी डीएनए सूखी.
9. 50 ते 0.1 (Tris - एचसीएल 10mm, 0.1mm EDTA, पीएच 8.0) या एच ₂ ओ के μl / μg में डीएनए गोली पुनः निलंबित लगभग 2hrs के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें. कभी कभी भंवर ट्यूब सुनिश्चित करने के लिए डीएनए भंग है, एक त्वरित अपकेंद्रित्र द्वारा पीछा किया.
10. तुरंत पीसीआर प्रवर्धन, -20 डिग्री सेल्सियस पर या दुकान के लिए 1-10 साल के लिए डीएनए की मात्रा और गुणवत्ता पर निर्भर करता है का उपयोग करें.

4. पीसीआर प्रवर्धन

प्राइमर डिजाइन

1. पीसीआर bisulphite रूपांतरण विशिष्ट प्राइमरों के प्रभावी डिजाइन crucia हैकि कुशल, पूरी तरह से परिवर्तित डीएनए की निष्पक्ष प्रवर्धन सुनिश्चित करने के लिए मैं होता है. निम्नलिखित दिशानिर्देशों प्राइमर डिजाइन सहायता के लिए उपयोग किया जाता है.

प्राइमर डिजाइन दिशानिर्देश

Thermocyling

2. Methylated और unmethylated डीएनए के आनुपातिक पीसीआर प्रवर्धन के लिए परीक्षण करने के लिए, एक 50:50 methylated / Unmethylated पूरी तरह से bisulphite परिवर्तित नियंत्रण नमूना का उपयोग करें और अनुकूलित पीसीआर स्थितियों की प्रतिक्रिया (चित्रा 3) के तहत bisulphite रूपांतरण विशिष्ट प्राइमरों के साथ बढ़ाना. 50:50 methylated के लिए: नियंत्रण Unmethylated, इन विट्रो SssI डीएनए methylated और या तो पूरे जीनोम प्रवर्धित (WGA) डीएनए या पूरे रक्त डीएनए में उपयोग करें . कृपया ध्यान रखें है कि कुछ जीन स्वाभाविक रूप से रक्त में methylated हो जाएगा और इसलिए इन मामलों में यह सबसे अच्छा है केवल "Unmethylated" नियंत्रण के रूप में WGA डीएनए का उपयोग.
3. 100 और मीटर में पीसीआर प्रवर्धन प्रतिक्रिया मिश्रण की तैयारीयू, एल bisulphite परिवर्तित जीनोमिक डीएनए, 200 सुक्ष्ममापी dNTP, 1 सुक्ष्ममापी प्राइमरों, 1.5 मिमी ₂ MgCl, 50 मिमी KCl, 10mm Tris - एचसीएल, पीएच 8.3 और 0.15 μl Taq पोलीमरेज़ के 2 μl युक्त aliquots.
4. 3 डिग्री सेल्सियस Tm प्राइमर की भविष्यवाणी से भर में 10 ट्यूब - एक तापमान ढाल thermocycler में एक ढाल में चलाने के लिए प्रतिक्रिया + / सेट

5. परीक्षण है कि methylated और unmethylated amplicons अनुपात में परिलक्षित किया गया है, amplicon 1 Taq (TCGA) के रूप में एक जानकारीपूर्ण प्रतिबंध एंजाइम, कि डीएनए methylated पचा के साथ पचा जा सकता है लेकिन जब प्रतिबंध एंजाइम साइट है पचाने में नहीं unmethylated डीएनए bisulphite TTGA करने के लिए रूपांतरण के बाद बदल दिया. पाचन की हद तक agarose जेल वैद्युतकणसंचलन (चित्रा 3A) के द्वारा visualized किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, SYBRGreen (1:1000 कमजोर पड़ने का 0.2 μl) पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए जोड़ा जा सकता है औरमेथिलिकरण की हद तक एक वास्तविक समय पीसीआर thermocycler (3B चित्रा) में गर्मी हदबंदी भूखंडों प्रदर्शन द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है.
6. पीसीआर रिएक्शन MgCl ₂ एकाग्रता और thermocycling शर्तों सहित मिश्रण करने के लिए पीसीआर दक्षता बढ़ाने या methylated और unmethylated पीसीआर टुकड़े के आनुपातिक पीसीआर प्रवर्धन सुनिश्चित करने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकता है.
7. एक बार पीसीआर स्थितियों को अनुकूलित कर रहे हैं, पीसीआर प्रवर्धन bisulphite परिवर्तित नमूने पर प्रदर्शन किया जा सकता है नोट: एक बार Tm एक तापमान ढाल पीसीआर अनुकूलित है इस्तेमाल किया जा जरूरत नहीं है.

5. प्रतिनिधि परिणाम:

Bisulphite पीसीआर प्रवर्धन अनुकूलन का एक उदाहरण 3 चित्र में दिखाया गया है. इष्टतम पीसीआर प्रवर्धन शर्तों के अनुपात में और पूर्वाग्रह के बिना methylated और unmethylated amplicons बढ़ाना चाहिए. चित्रा 3A तापमान 50% methylated और unmethylated डीएनए का एक मिश्रण से ढाल पीसीआर प्रवर्धन प्रोफ़ाइल के साथ एक agarose जेल से पता चलता है. गुई पीसीआर amplicons प्रतिबंध एंजाइम, 1 Taq (TCGA), (एम) है कि methylated पचाने में होगा डीएनए के साथ इलाज किया गया है लेकिन डीएनए (यू) को पचाने नहीं unmethylated के रूप में प्रतिबंध एंजाइम साइट bisulphite TTGA करने के लिए रूपांतरण के द्वारा बदल दिया है. कटौती और काटा हुआ पीसीआर उत्पाद के एक बराबर राशि अगर methylated और unmethylated डीएनए अनुपात में परिलक्षित होता है की उम्मीद है. यह इस जेल पर देखा जा सकता है कि गैर पूर्वाग्रह प्रवर्धन के लिए इष्टतम thermocyling शर्तों 56.1 पर है डिग्री सेल्सियस (टी). Bisulphite डीएनए की पूरी रूपांतरण भी साइटोसिन साइट HPA III (CCGG) के रूप में विशेष एंजाइम के साथ पाचन से विश्लेषण किया जा सकता है HPA क्ष्क्ष्क्ष् केवल यदि रूपांतरण विफल रही है पचाने में, प्रतिबंध साइट के रूप में बनाए रखा जाएगा. यदि रूपांतरण पूरा हो गया है प्रतिबंध साइट TCGG या डीएनए के मेथिलिकरण राज्य पर निर्भर करता है TTGG परिवर्तित हो जाएगा. पूरा bisulphite डीएनए रूपांतरण चित्रा 3A (एच) में देखा जा सकता है.

चित्रा 3B एक वास्तविक समय हदबंदी साजिश से पता चलता है किनिर्धारित करने के लिए कि क्या वहाँ किसी भी प्रवर्धन के तापमान पर आधारित है जिस पर अलग अणुओं को अलग कर देना होगा पूर्वाग्रह है के लिए एक उपकरण के रूप में भी इस्तेमाल किया जा सकता है. इस आंकड़े में यह देखा जा सकता है कि पीसीआर प्रवर्धित methylated (एम) और unmethylated डीएनए (यू) पूरी तरह से methylated और unmethylated डीएनए के नियंत्रण प्रवर्धन जो 82.1μC में अलग कर देना की तुलना में 50% methylated और unmethylated डीएनए के मिश्रण से अनुपात में कर सकते हैं और क्रमशः 78.9μC.

Thermocyling और प्रतिक्रिया की स्थिति के अनुकूलन के बाद Bisulphite इलाज के नमूने कतरा या तो एक एकल या अर्द्ध नेस्टेड पीसीआर प्रतिक्रिया में विशिष्ट और bisulphite विशिष्ट प्राइमरों के साथ परिलक्षित किया जा सकता है. परिणामस्वरूप पीसीआर टुकड़े agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा कल्पना की है और या तो सीधे (चित्रा -4 ए) या क्लोनिंग और अनुक्रमण द्वारा अनुक्रम किया जा सकता है. क्लोनिंग और अलग - अलग अणुओं की मेथिलिकरण राज्य अनुक्रमण के बाद एक bisulphite नक्शा (4B चित्रा) में हो सकता है, सारणीबद्ध कर सकते हैं, की विविधता कल्पनामेथिलिकरण.

उच्च throughput के मात्रात्मक मेथिलिकरण विश्लेषण Sequenom EpiTYPER विधि द्वारा उपयोग के रूप में इस तरह की तकनीक का उपयोग preformed किया जा सकता है है. इस पद्धति का उपयोग करके, bisulphite परिवर्तित डीएनए bisulphite विशिष्ट पीसीआर प्राइमरों के साथ परिलक्षित होता है और एक proprietry विपाटन प्रक्रिया द्वारा पीछा किया. परिणामस्वरूप टुकड़े विशिष्ट methylated cytosines (चित्रा 5A) की उपस्थिति पर निर्भर स्पेक्ट्रम के साथ MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा quantitated हैं. नमूने में मेथिलिकरण अनुपात का एक सारांश तो एक सूक्ति (चित्रा 5 ब) या मेथिलिकरण साजिश (चित्रा 5C) ​​के रूप में extrapolated किया जा सकता है.

चित्रा 1. सामान्य कोशिका में methylated CPG योजनाबद्ध, प्रमोटर - जुड़े CPG द्वीपों मुख्य रूप से unmethylated (ग्रे) जबकि जीन शरीर के भीतर CPG साइटों विरल है और आम तौर पर methylated (लाल ) हैं. दाईं तरफ पैनल आणविक संरचना का विस्तारएक व्यक्ति CPG साइट पर डीएनए के ure और साइटोसिन के 5 कार्बन पर एक CH3 अणु के साथ मेथिलिकरण से पता चलता है.

चित्रा 2. . विकृतीकरण, bisulphite रूपांतरण, पीसीआर प्रवर्धन और विश्लेषण, रासायनिक रूपांतरण डीएनए मेथिलिकरण के योजनाबद्ध विश्लेषण में चार मुख्य चरण के रूप में दिखाया शामिल हैं. राइट पैनल में, साइटोसिन अणु है कि bisulphite रूपांतरण के दौरान होने के लिए संशोधन चित्रित कर रहे हैं.

चित्रा 3. पीसीआर प्रवर्धन ए के अधिक उपयोग तापमान 50% methylated और unmethylated डीएनए का एक मिश्रण से ढाल पीसीआर प्रवर्धन प्रोफ़ाइल के साथ agarose जेल वैद्युतकणसंचलन. टुकड़े या तो (टी) Taq1 या HpaIII (एच), जो क्रमशः डीएनए methylated और गैर bisulphite परिवर्तित डीएनए को पचाने के साथ पचा गया है. बी हीट हदबंदी वक्र विश्लेषण से पता चलता है एक equamethylated और unmethylated डीएनए (लाल रेखा 50/50 मिश्रण) के एल अनुपात की तुलना में पूरी तरह methylated के नियंत्रण प्रवर्धन (गुलाबी लाइन, एम) और unmethylated (ग्रीन लाइन, यू) डीएनए जो 82.1 डिग्री सेल्सियस और 78.9 डिग्री सेल्सियस क्रमशः अलग कर देना.

चित्रा 4. प्रत्यक्ष अनुक्रमण का उदाहरण और एक bisulphite नक्शा ए. CPG पीले रंग में प्रकाश डाला साइटों के साथ तीन अलग सेल लाइनों से अनुक्रम ट्रेस. सेल लाइन एक्स सभी तीन CPG साइटों के 100% मेथिलिकरण प्रदर्शित करता है जबकि सेल लाइनों वाई और जेड मेथिलिकरण की डिग्री बदलती जी / एक संकेतों के अतिव्यापी द्वारा देखा के रूप में दिखाने के. बी प्रतिनिधि bisulphite मेथिलिकरण का घनत्व (लाल डॉट्स) व्यक्तिगत CPG साइटों पर दिखा रहा है, के रूप में व्यक्तिगत क्लोन के प्रत्यक्ष अनुक्रमण द्वारा निर्धारित नक्शे.

चित्रा 5. उच्च throughput डीएनए मेथिलिकरण Sequenom ए विश्लेषण का उपयोग स्पेक्ट्रम देखने Sequenom epiTYPER प्रौद्योगिकी का उपयोग. डीएनए टुकड़े विशिष्ट स्पेक्ट्रा प्रदर्शन, डीएनए मेथिलिकरण वर्तमान की मात्रा पर निर्भर करता है. चार अलग अलग सेल लाइनों के लिए प्रत्येक CPG साइट पर बी सूक्ति डीएनए मेथिलिकरण के प्रतिशत के सारांश. सी. मेथिलिकरण साजिश सारांश Sequenom सूक्ति से व्युत्पन्न.

Discussion

डीएनए मेथिलिकरण विश्लेषण bisulphite परिवर्तित डीएनए के जीनोमिक अनुक्रमण द्वारा एक अच्छी तरह से स्थापित है और बहुमुखी तरीका है कि पहचान और एकल nucleotide संकल्प पर डीएनए मेथिलिकरण की मात्रा का ठहराव की सुविधा है. हालांकि, bisulphite रूपांतरण और बाद में विश्लेषण के आधार पर निर्भर करता है कि डीएनए पूरी तरह से हर unmethylated साइटोसिन uracil deaminated जा रहा है और केवल methylated cytosines संयुक्त राष्ट्र के प्रतिक्रियाशील शेष के साथ परिवर्तित किया गया है. यदि रूपांतरण अपूर्ण है, समस्याओं के विश्लेषण के साथ पैदा बाद से बेबदल unmethylated cytosines गलत methylated cytosines के रूप में व्याख्या की जा सकता है. Bisulphite रूपांतरण विभिन्न स्तरों पर अनुकूलित किया जा सकता है के लिए रूपांतरण के प्रतिशत को अधिकतम. के लिए डीएनए पूरी तरह से परिवर्तित किया जा यह पहली एकल इतना है कि साइटोसिन अवशेषों bisulphite आयनों को उजागर कर रहे हैं चाहिए फंसे. पहला कदम, डीएनए विकृतीकरण, महत्वपूर्ण है और अधूरा रूपांतरण के स्रोत हो सकता है अगर डीएनए पूरी तरह से विकृत नहीं है सकते हैं. सुनिश्चित करने के लिएकि डीएनए पूरी तरह से विकृत है यह महत्वपूर्ण है कि हटाने, सभी जुड़े प्रोटीन की उचित नमक एकाग्रता, ऊष्मायन तापमान और समय सहित प्रतिक्रिया मापदंडों एकल असहाय रचना में डीएनए को बनाए रखने के लिए उपयुक्त हैं. यह महत्वपूर्ण है के लिए ताजा 3M NaOH का उपयोग और पर्याप्त ऊष्मायन समय की अनुमति है. यदि डीएनए विकृतीकरण विरोध है, 30 मिनट के लिए ऊष्मायन समय विस्तार या डीएनए fragmenting विकृतीकरण के लिए पहले सहित प्रोटोकॉल के लिए कुछ संशोधनों डीएनए विकृतीकरण सुविधा हो सकती है. इसके अलावा, एकल असहाय डीएनए (ssDNA) bisulphite रूपांतरण प्रतिक्रिया के दौरान असहाय डीएनए (dsDNA) डबल फिर से पानी रखना हो सकता है. या तो समय समय पर, या bisulphite प्रतिक्रिया के दौरान लगातार एक उच्च तापमान (90-95 डिग्री सेल्सियस) पर प्रतिक्रिया का भार उठाते ssDNA के रखरखाव में सहायता कर सकते हैं. हालांकि, यह महत्वपूर्ण है पता है कि डीएनए गिरावट बहुत इन उच्च तापमान पर त्वरित हो. विभिन्न अभिकर्मकों भी वीं के फिर annealing को बाधित करने के लिए जोड़ा जा सकता हैई यूरिया के रूप में डीएनए strands.

डीएनए और इसकी गुणवत्ता की एकाग्रता भी bisulphite प्रतिक्रिया और अंतिम पीसीआर उपज की दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं. डीएनए गिरावट bisulphite रूपांतरण प्रोटोकॉल की एक सीमा है. डीएनए के रासायनिक उपचार ssDNA में विभिन्न भूग्रस्त टूटता है और कठोर उच्च bisulphite एकाग्रता, लंबी ऊष्मायन बार डीएनए गिरावट तेज कर सकते हैं सहित पूरा bisulphite रूपांतरण के लिए आवश्यक शर्तों के कुछ परिचय. मानक प्रतिक्रिया वर्णित शर्तों के तहत, डीएनए क्षरण एक आम समस्या है लेकिन नहीं है, यदि प्रोटोकॉल संशोधनों पेश कर रहे हैं, जैसे दृश्यों कि रूपांतरण के लिए आग रोक कर रहे हैं के लिए, टेम्पलेट्स है कि अपमानित या FFPE नमूने के रूप में ऐसे गरीब गुणवत्ता के हैं डीएनए के लिए, तब डीएनए गिरावट एक महत्वपूर्ण सीमा बन सकता है.

Formalin तय आयल, (FFPE) एम्बेडेड और अपमानित डीएनए नमूने प्रभावी ढंग से और परिवर्तित bisulphite प्रवर्धित इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन संशोधनों करने के लिए सुनिश्चित करें कि डीएनए आगे अपमानित नहीं है की सलाह दी जाती है. t शाही सेना के रूप में एक कैरियर के शाही सेना के इस्तेमाल की सिफारिश की है . इसके अलावा ग्लाइकोजन एक वाहक के रूप में जोड़ा जा सकता है जब डीएनए एकाग्रता कम (<200 एनजी). क्योंकि FFPE ऊतकों से अलग डीएनए पहले ही खंडित है और आगे विखंडन deamination के दौरान जगह लेता है, देखभाल आगे गिरावट को कम करने के लिए लिया जाना चाहिए. टुकड़ा डीएनए विकृतीकरण से पहले किसी भी आगे मत करो और 4 घंटे के लिए bisulphite प्रतिक्रिया के लिए ऊष्मायन समय सीमा. डिजाइन और नहीं खंडित डीएनए के लिए 300 कारण बीपी से बड़ा amplicons.

एक और पहलू है कि पीसीआर प्रवर्धन को प्रभावित है कि unmethylated cytosines की bisulphite रूपांतरण डीएनए टेम्पलेट की जटिलता को कम कर सकते हैं. निम्नलिखित प्राइमर डिजाइन प्रोटोकॉल खंड 4.1, वृद्धि हुई प्राइमर लंबाई और नेस्टेड पीसीआर में उल्लिखित सभी को विशिष्टता और पीसीआर उपज बढ़ाने में मदद कर सकते हैं.

अंत में, डीएनए टेम्पलेट के बाद bisulph के दौरान बदल दिया हैite रूपांतरण, प्रवर्धन पूर्वाग्रह एक चिंता का विषय होना कर सकते हैं. सुनिश्चित करें कि methylated और unmethylated टेम्पलेट्स के आनुपातिक पीसीआर प्रवर्धन नियंत्रण 50/50 / एम यू डीएनए मिश्रण के साथ की जाँच की है, के रूप में प्रोटोकॉल में उल्लिखित, चित्रा 3 देखें. इसके अलावा कि केवल परिवर्तित टेम्पलेट्स के प्रवर्धन सुनिश्चित HpaIII प्रतिबंध एंजाइम और जेल वैद्युतकणसंचलन (चित्रा 3) का उपयोग करते हुए उत्पन्न हो रही है. पीसीआर स्थितियों के लिए अलग तापमान और / या मैग्नीशियम एकाग्रता या विस्तार के समय लंबी द्वारा अनुकूलित किया जा आवश्यकता हो सकती है. कुछ टेम्पलेट्स के लिए विशेष रूप से समस्याग्रस्त हो दिखाई देते हैं और प्राइमर की स्थिति को समायोजित करने की जरूरत है या प्राइमरों पतित हो सकता है की जरूरत के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण तकनीक को तेजी से करने के लिए एक समान संकल्प प्राप्त करने के लिए जीनोमिक अनुक्रमण bisulphite विकसित हो रहे हैं, और तीसरी पीढ़ी के एकल अणु अनुक्रमण bisulphite अनुक्रमण के लिए आवश्यकता के बिना दोनों को प्राथमिक और डीएनए मेथिलिकरण के विश्लेषण के लिए अनुमति की क्षमता है. हालांकि, व्यापक उपलब्धता और कल्पनाइन तकनीकों का ificity कुछ समय दूर रहते हैं. Bisulphite जीनोमिक अनुक्रमण मेथिलिकरण विश्लेषण में सोने के मानक है और एक मजबूत प्रोटोकॉल है. विधि बिंदु जहां आम समस्याओं और सीमाओं को हल कर दिया गया है करने के लिए प्रगति की है और अनुप्रयोगों के व्यक्ति के जीन के विश्लेषण से उच्च throughput और पूरे जीनोम विश्लेषण क्लार्क एट अल द्वारा वर्णित करने ^के लिए विस्तारित किया है +२००६ 4.. समस्या निवारण दिशानिर्देशों और अतिरिक्त सिफारिशों तालिका 1 में उल्लिखित हैं. यह सुझाव दिया है कि इष्टतम दृष्टिकोण के शुरू में मानक प्रोटोकॉल का पालन करें और केवल अगर संशोधन और जब कोई समस्या पैदा होती परिचय है.

1 टेबल समस्या निवारण दिशानिर्देश.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Type
Sodium Metabisulphite	Ajax Finechem
Hydroquinone	Merck & Co., Inc.
Wizard DNA-clean-up system	Promega Corp.