Embalaje VIH o FIV basados ​​en lentivirus Construcciones de expresiones y de transducción de la VSV-G partículas virales pseudotyped

Summary

Lentiviral vectores de expresión son los medios más eficaces para que expresan establemente diferentes moléculas efectoras o reportero construcciones para dividir y no dividir las células de mamíferos y organismos enteros. A continuación presentamos un protocolo sobre cómo empaquetar construcciones lentivirus de expresión en las partículas pseudoviral y la transducción de las células diana utilizando las partículas pseudoviral.

Abstract

Como con el estándar de vectores plasmídicos, es posible transfectar lentivectors en forma de plásmido en las células con bajo a mediano eficiencia para obtener la expresión transitoria de efectores. Constructos de embalaje lentiviral expresión en partículas pseudoviral, sin embargo, permite hasta 100% de transducción, incluso con difíciles de transfectar células, tales como tallo principal, y las células diferenciadas. Además, la entrega lentiviral no produce las respuestas celulares específicos asociados típicamente con transfecciones químicos, tales como la muerte celular resultante de la toxicidad del reactivo de transfección ^{1, 2.} Cuando transducidas en las células diana, el constructo lentiviral integra en el ADN genómico y proporciona la expresión estable de la horquilla pequeño ARN (shRNA), gen microARN ADNc, o reportero ^{3, 4.} Las células diana que expresan establemente la molécula efectora se puede aislar utilizando un marcador seleccionable contenida en el vector de expresión construir tales como puromicina o GFP. Después de pspartículas eudoviral infectar las células diana, no puede replicarse dentro de las células diana debido a que los genes estructurales víricas están ausentes y las repeticiones terminales largas (LTR) están diseñados para ser auto-inactivación en la transducción de ^{5, 6.}

Hay tres componentes principales necesarios para el envasado eficiente lentiviral ^{1, 5, 6, 7.}

1. El vector de expresión lentiviral que contiene algunos de los elementos genéticos requeridos para el envasado, la integración estable de la expresión viral construir en el ADN genómico, y la expresión del efector o informador.
2. Los plásmidos de envasado lentiviral que proporcionan las proteínas esenciales para la transcripción y el envasado de una copia de ARN de la construcción de expresión recombinantes en partículas pseudoviral. Este protocolo utiliza los plásmidos PPACK (OSE) que codifican para gag, pol, y revoluciones del genoma del VIH o la FIV y la proteína virus de la estomatitis vesicular g (VSV-G) para la proteína de la cápsida viral.
3. 293TN producen r células (derivado de células HEK293) que expresan el antígeno T de SV40 grande, lo cual es necesario para la producción de alto título lentiviral y un gen de resistencia a neomicina, útil para volver a seleccionar las células para su mantenimiento.

Una visión general del protocolo de producción viral puede verse en la Figura 1. Producción viral se inicia por la co-transfección de células productoras 293TN con el vector de expresión lentiviral y los plásmidos de embalaje. Las partículas virales son secretadas en los medios de comunicación. Después de 48-72 horas, los medios de cultivo celular se cosecha. Los restos celulares se retira de los medios de cultivo celular, y las partículas virales se precipitó por centrifugación con PEG-que para la concentración. Producido partículas lentiviral luego se titularon y se puede utilizar para transducir células diana. Los detalles de Titulación viral no están incluidos en este protocolo, pero se puede encontrar en:

anco "> http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf ^8.

Este protocolo ha sido optimizado con los productos específicos que se indican. Otros reactivos puede ser sustituido, pero el mismo resultado no puede ser garantizada.

Protocol

1. La transfección de células con plásmidos 293TN de embalaje y de Expresión de la Construcción

1. Semillas 7,0 a 8,0 x 10 ⁶ 293TN células por placa de 15 cm de cultura ² en 20 ml de medio de cultivo que contiene medio DMEM suplementado con 4 mM de L-glutamina, 4,5 g de glucosa / l, y suero bovino fetal (10%) sin antibióticos. Crecer durante 18-24 horas a 37 ° C con 5% de CO ₂ de manera que la densidad celular alcanza 60-80% de confluencia en el momento de la transfección. En algunos casos, puede ser necesario para las placas de semillas de varias células para obtener un alto título suficiente para la transducción de las células diana.
2. Para cada placa de las células, añadir 1,6 ml de DMEM libre de suero a un autoclave tubo 2 ml Eppendorff. Añadir 45 l pPACKH1 o pPACKF1 y 4,5 g de la construcción de lentivirus de la DMEM y mezcla pipeteando arriba y hacia abajo.
3. Añadir 55 l de PureFection en el mismo tubo. Vortex durante 10 segundos. Incubar el DMEM-plásmidos PureFection mezcla a temperatura ambiente fo 15 min.
4. Agregue el DMEM-plásmidos PureFection mezcla a la placa de cultivo de tejidos, gota a gota y agitar suavemente para dispersar uniformemente en toda la placa. Vuelva a colocar el plato a la incubadora y crecer a 37 ° C con 5% de CO _2.
5. No hay necesidad de cambiar los medios de comunicación después de la transfección. Si su lentivirus construcción expresa un gen que codifica una proteína fluorescente GFP, como, revisar sus células bajo el microscopio de 12-24 horas después de la transfección. Debería ser capaz de ver las células> 90% GFP-positivo, lo que indica que la transfección se realizó correctamente.
6. Recoger el sobrenadante del cultivo de células después de 48 y 72 horas en un tubo de centrífuga de 50 ml estéril. Este sobrenadante del cultivo celular ahora contiene partículas infecciosas pseudoviral. (Siga las pautas recomendadas para trabajar con la clase de seguridad BSL-2.) Se centrifuga a 1.500 xg durante 15 min a temperatura ambiente para precipitar los restos celulares. Transferir el sobrenadante viral a un nuevo tubo, asegurando de no perturbar el sedimento.
7. Células 293TN que han sido utilizados para el envasado viral debe ser eliminado de un contenedor séptico y no han de ser utilizados para rondas adicionales de embalaje viral.

2. La concentración del sobrenadante viral

1. Añadir 1 volumen de frío (4 ° C) de PEG-lo solución de precipitación virus a cada 4 volúmenes de lentiviral partícula que contiene sobrenadante. La precipitación de partículas lentiviral de grandes volúmenes se puede lograr con Corning 250 tubos de centrífuga de polipropileno ml. Mezclar la solución por los tiempos de inversión de los tubos varias, pero no del vórtice de la mezcla.
2. Refrigerar la solución a 4 ° C durante al menos 12 horas (hasta 4 días es aceptable). No agitar o rotar los tubos durante la etapa de refrigeración.
3. Centrifugar el sobrenadante / PEG-se mezcla a 1.500 xg durante 30 minutos a 4 ° C. Después de la centrifugación, las partículas lentiviral aparecerá como un precipitado de color beige o blanco en la parte inferior del tubo. Vierta el supernatant.
4. Quite todos los rastros de líquido por aspiración, teniendo cuidado de no alterar las partículas precipitadas lentivirales en el sedimento. Trazas de PEG-residual se va a diluir el virus (reduciendo así el título), pero no afecta a la integridad de las células diana desde el PEG-que es inerte y no tóxico.
5. Resuspender y combinar las partículas lentiviral en 1/100 del volumen original utilizando frío (4 ° C), fosfato estéril o solución salina tamponada con DMEM que contenía 25 mM de tampón HEPES.
6. Dividir en partes alícuotas en viales criogénicos estériles y se almacena a -70 ° C hasta que estén listos para su uso.

3. Titulación viral y transducción de las células diana

1. Le recomendamos titulación de las partículas antes de la transducción de lentivirus el objetivo de las células de interés y el cálculo de la multiplicidad caso de infección (MOI) de las células diana para la coherencia entre los experimentos. Tituló el virus, se recomienda utilizar las células HT1080 como una línea de control fácil de infectar a positivo. Pl.facilidad en cuenta que el protocolo titering implica transducir células HT1080 con una pequeña alícuota de las partículas lentiviral que han envasados. Una vez que el título se sabe, las células diana de interés también puede ser transducidas con las partículas producidas lentivirales. Un protocolo de Titulación recomendamos se puede encontrar en: http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf ^7.
2. Placas 50.000 células diana de interés por pocillo en una placa de 24 pocillos en medio de cultivo celular. Utilice los medios de comunicación que las células normalmente se cultivan in crecer las células durante la noche en sus condiciones de cultivo específicas. Las células deben ser entre 50 a 70% confluentes en el día de la transducción.
3. En el día de la transducción, aspirar los medios de comunicación de las células. Combinar medio de cultivo con TransDux a una concentración de 1 x final (por ejemplo, 2,5 l TransDux a 500 l de medio de cultivo). A continuación, traslado de la TransDux-ceEl cultivo LL mezcla medio a cada pocillo.
4. Pipetear el volumen apropiado de virus que corresponde a la óptima MOI para las células diana en cada pocillo. Si la MOI óptimo es desconocido, se recomienda tratar una gama de diferentes MOI (tal como una MOI de 1, 2 y 5 para fácil de infectar las células de cultivo de tejidos, y una MOI de 1, 10 y 20 para más difíciles de a infectar a las células primarias). Si la concentración de las partículas lentiviral no es conocido (como se determina a través de un protocolo titering virus), diferentes volúmenes de virus puede ser tratado, tal como l 1, 2 y 5 del virus. El virus puede permanecer en contacto con las células diana por hasta 72 horas.
5. Otros experimentos con las células transducidas de interés objetivo puede ser iniciada 72 horas después de la transducción, una vez que el constructo viral ha integrado en el genoma de la célula huésped. Cambiar el medio y el paso de la meta de las células de interés de acuerdo a sus necesidades específicas.

4. Los resultados representativos

La densidad inicial de las células 293TN es crítico para el envasado viral exitosa. Células 293TN debe estar entre 60 -80% confluente el día de la transfección (Figura 2). Si las células 293TN son menos del 60% confluentes, que puedan crecer durante unas horas más antes de intentar la transfección. Si las células son confluentes 293TN> 80%, deben ser replated antes de la transfección.

Si se utiliza un GFP lentivirus expresar, por lo menos 90% de las células 293TN debe fluorescencia verde 24 horas después de la transfección, lo que indica una transfección exitosa (Figura 3). Si menos del 90% de las células son GFP-positivo, no proceda con el siguiente paso, porque esto indica que la transfección no tuvo éxito, y los títulos virales será baja. En cambio, la placa 293TN nuevas células y empezar de nuevo, asegurándose de que las células son 293TN a la densidad celular adecuada antes de la transfección.

293TN células pueden quitar las placas de cultivo de tejidos de 48-72 horas después de la transfección. Esto no afecta negativamente a la producción de partículas lentivirales.

Titulando con células HT1080

Los títulos virales se puede calcular utilizando el kit de OSE global Titulación ultrarrápido de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este sistema utiliza qPCR para medir la integración de la secuencia viral WPRE a partir del vector lentiviral en las células HT1080 y la compara con una curva estándar, basada en una secuencia de referencia genómico para medir con precisión las unidades infecciosas por ml (Figura 4).

La transducción de las células diana

Si se utiliza partículas lentivirales que expresan un marcador GFP constitutivamente activa, las células GFP positivos deberían comenzar a aparecer dentro de 12-24 horas de la transducción, si la reacción de transducción está trabajando. La expresión de GFP debe continuar después de la construcción se integra en forma estable lentiviral tél alojar genoma de la célula. Si con la transducción de las MOI diferentes, la fluorescencia de GFP aproximadamente debe coincidir con el momento de inercia, donde las MOI bajas muestran una menor fluorescencia de la GFP y el aumento de las MOI muestran un aumento de la fluorescencia de GFP (Figura 5).

Figura 1. Visión general del protocolo de la producción viral. Los plásmidos de envasado y lentivirus PPACK se mezclan y se co-transfectaron en células 293TN. Después de 48 -72 horas, el sobrenadante viral se recoge, y las partículas virales se precipitó con PEG-ella. Después de titulación de las partículas lentivirales, que puede ser utilizado para la transducción de la meta de las células de interés. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 2. Fase de contraste de imagen de las células 293TN. Celular Density debe ser de entre 60-80% confluente el día de la transfección.

Figura 3. La imagen fluorescente de las células GFP-positivas 293TN 24 horas después de la transfección con Purefection, pPACKH1, y un lentivirus GFP construir codificación.

Figura 4. Resultados WPRE qPCR y la curva estándar obtenida usando el kit de Global OSE Titulación ultrarrápido para el cálculo de MOI y el título correspondiente de paquetes de partículas virales.

Imágenes de la Figura 5. Fluorescentes de las células HT1080 transducidas con cantidades crecientes de los lentivirus. Las imágenes son de 72 horas después de la transducción.

Discussion

Este embalaje viral y la transducción de las células objetivo del Protocolo ha sido optimizado para su uso con los reactivos de empaque virales de SBI. La sustitución de otros reactivos pueden afectar el resultado del protocolo. Este protocolo sólo se ha optimizado para la producción lentiviral y puede no ser adecuado para producir otros tipos de virus o pseudoviruses.

Envases viral exitosa depende de varios pasos clave. Las células 293TN expresan el antígeno T de SV40 grande, que es absolutamente necesario para la secreción de las partículas lentiviral en el sobrenadante del cultivo celular. La densidad en el que las células son 293TN en el momento de la transfección es especialmente importante para que el reactivo PureFection para transferir suficientemente el lentivirus y plásmidos de envasado en las células. Adición de la mezcla PureFection a la placa de cultivo de tejidos de una manera gota a gota seguido por agitación a fondo la placa es importante para la dispersión de los plásmidos de envasadoy lentivirus construir a lo largo de todas las células. El fracaso para distribuir apropiadamente los vectores puede resultar insuficiente partículas lentiviral que se producen. La reacción de envases viral puede ser ampliado para la producción de virus de alto título, basado en el área de la superficie de las placas de cultivo de tejidos. Uno puede elegir a la placa de varios platos de cultivo de tejidos de células 293TN por constructo que necesita ser embalado. La concentración de los sobrenadantes virales es especialmente útil en la creación de alto título de virus. Sobrenadante viral a partir de placas múltiples de células pueden ser combinadas y se concentraron para su uso en experimentos in vivo, o para las células que son difíciles de transducir.

Titulación de las partículas producidas lentiviral es importante para el cálculo de una precisa MOI a utilizar para la transducción de las células diana. Conociendo el momento de inercia que se utilizó en una transducción dado permite reparación en el caso de que la transducción no es correcta. Por ejemplo, utilizando una MOI que esdemasiado baja puede dar lugar a células diana que expresan muy pocos el constructo de interés. El uso de un momento de inercia que es demasiado alto, sin embargo, puede dar lugar a células diana que muestran signos de estrés. El objetivo es usar una MOI que maximiza la expresión del constructo de interés, preservando la salud de las células. Aunque se recomienda un protocolo titering qPCR basado en que mide copias integradas del constructo lentiviral en las células HT1080, otros enfoques tituló también se puede utilizar, tales como ELISA p24 o estimación del porcentaje de células positivas GFP.

El éxito de la transducción de las células diana es también dependiente de varios factores clave. TransDux es un reactivo de infección único que permite una alta eficiencia de transducción, pero que no es tóxico para las células. TransDux puede utilizarse en lugar de polibreno, que a menudo es tóxico para las células diana. La inclusión de TransDux en la transducción de las células diana ayuda para neutralizar las cargas sobre las partículas virales y permite que el virus en la células. Desde TransDux no es tóxico para las células, se puede permitir que las partículas lentiviral a permanecer en contacto con las células durante 72 horas (el tiempo en que los constructos virales han integrado en el genoma de la célula huésped), aumentando así la probabilidad de que el partículas virales de entrar en la célula. Para algunas células difíciles de transduce, transducción se puede repetir en días sucesivos para aumentar la eficiencia de transducción. Por ejemplo, transducir las células en el día 1, permitir que las células para descansar en el día 2 y, a continuación transducir las células de nuevo el día 3. Es importante que esperar 72 horas después de la transducción última antes de la selección principio, experimentos adicionales o caracterización de las células diana.

Embalaje viral eficiente es también depende del tamaño del constructo lentiviral, entre el 5 'y regiones 3'LTR. Esta sección de la construcción lentiviral debe ser de aproximadamente 9 kb o menos, lo que corresponde al tamaño del genoma del VIH nativo. Superior al 9 kb de mayo deaumentar el título de las partículas producidas pseudoviral. La nueva tecnología, como piggyBac vectores de transposones, permitir la integración fiable y estable de los transgenes de hasta 100 kb a través de una sola transfección. Este enfoque puede ser utilizado para las construcciones que exceden el límite de tamaño para los vectores lentiviral, en los casos en que es posible transfectar células diana, y proporciona la ventaja adicional de no requerir una etapa de envasado viral ^9,10.

Las partículas producidas pseudoviral que utilizan este protocolo son infecciosos en que pueden infectar a la mayoría de tipos de células de mamíferos. Los productos utilizados en este protocolo, sin embargo, son de tercera generación BIOSAFE ya que producen no replicativa y pseudoviruses auto-inactivantes. Por lo tanto, una vez traducida en las células diana o los animales, las células diana o animales no son infecciosas o contagiosas. La sustitución de otros lentivirus plásmidos que no son de tercera generación BIOSAFE es posible aunque no es recomendable a partir de una seguridad de la biotecnologíaperspectiva. El protocolo de la producción viral y la transducción de las células diana siguiente debería llevarse a cabo bajo nivel de bioseguridad 2, de acuerdo con las directrices del NIH ^11, y los investigadores siempre deben usar una bata de laboratorio y guantes para manipular las partículas virales. Las pilas de productores 293TN, tubos de partículas virales, y pipetas desechables se deben tirar en un contenedor de riesgo biológico correspondiente. Pipetas reutilizables y material de vidrio deben ser descontaminados con cloro y autoclave para disminuir la exposición del personal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM High Glucose Medium	GIBCO, by Life Technologies	11995-073
293TN Cells	SBI	LV900A-1
pPACKH1	SBI	LV500A-1	For HIV-based lentivectors
pPACKF1	SBI	LV100A-1	For FIV-based lentivectors
Any Lentiviral vector	SBI	Various	cDNA, shRNA, microRNA, transcription reporters
Purefection	SBI	LV750A-1 LV750A-5
PEG-it	SBI	LV810A-1 LV825A-1
Global UltraRapid Titering kit	SBI	LV961A-1	Not described in this protocol, but needed to titer the viral particles
TransDux	SBI	LV850A-1