Mönstring av embryonala stamceller med hjälp av Bio Flip Chip

Summary

Vi visar en enkel metod för att placera celler på önskade platser på ett substrat. Denna metod mönster celler genom att bläddra en silikon-chip som innehåller mikrobrunnar fylld med celler på underlaget. Denna metod ger ett nytt sätt att modulera diffusionsväte och juxtacrine signalering mellan celler.

Abstract

Cell-cell interaktioner som består av diffusionsväte signalering och cell-cell kontakt (juxtacrine signalering) är viktiga i många biologiska processer som tumörtillväxt, stamceller differentiering och stamceller självförnyelse. Ett antal metoder finns för närvarande för att modulera cellsignalering in vitro. En metod att modulera den totala mängden diffusionsväte signalering är att variera densiteten cellen sådd under kultur. På grund av den slumpmässiga karaktären av cellens kärna ur, detta resulterar i stor variation i den faktiska cell-cell avstånd och mängden av cell-cell kontakt och kan inte ordinera den lokala miljön. En mer specifik metod för modulerande cellsignalering är att använda molekylära inhibitorer eller genetiska metoder för att slå ner specifika signalproteiner, men båda dessa metoder är bäst lämpade att manipulera litet antal molekyler. Här visar vi en ny metod för modulerande cell-cell signalering som modulerar den lokala miljön av ett kluster av celler genom att placera olika antal celler vid önskade platser på ett substrat. Denna metod ger ett kompletterande sätt att styra den lokala diffusionsväte och juxtacrine signalering mellan celler. Vår metod använder sig av Bio Flip Chip (BFC), en mikrofabricerade silikon chip som innehåller hundratals till tusentals mikrobrunnar, varje storlek antingen att inneha en enskild cell eller ett litet antal celler. Vi lastar chipet med celler genom att pipettera dem på rad brunnarna och tvätta lossas celler från matrisen. Chipet är sedan vänt på ett substrat, där cellerna falla ut ur brunnar och på underlaget, behålla sina mönster. När cellerna har bifogat, kan chipet tas bort (eller vänster på). Detta sätt att cellen mönster är unikt genom att det: 1) inte ändrar kemin i underlaget, vilket gör att cellerna att föröka sig och flytta, 2) gör mönster på alla underlag, inklusive vävnad-kultur polystyren, glas, matrigel och även feeder cellager, och 3) är förenlig med traditionella microcontact utskrift, som möjliggör skapandet av extracellulära matrix öar med celler som placeras inuti dessa öar. I denna video visar vi den mönstring av musen embryonala stamceller på vävnader-kultur polystyren med BFC.

Protocol

Göra en BFC

BFCs sker genom gjutning Polydimetylsiloxan (PDMS) under en 4 "Si mästare wafer.

Göra en mästare wafer

1. Börja med att torkning av Si wafers i 30 min vid 130 ° C.
2. Placera rånet på en spin-bestrykare, häll SU8-2050 (Microchem) på skivan, rampen från 300 rpm / s till 3000-4000 rpm, och snurra i 30 s för att ge inslag höjder av 40-30 mm, respektive.
3. Efter spinning, placera skivan på en 65 ° C kokplatta, omedelbart ramp upp temperaturen till 95 ° C i 5-6 minuter, och sedan ramp ner till 65 ° C.
4. Exponera rån till en UV-dos på 200 mJ / cm ² på en kontakt Aligner med ett mörkt fält mask.
5. Placera rån på en 65 ° C kokplatta, omedelbart ramp upp temperaturen till 95 ° C i 4-5 min, och sedan ramp ner till 65 ° C.
6. Utveckla rån i PM acetat och isopropanol.
7. Silaniseras rån i 30 min med hexamethyldisiloxane (Shin-Etsu MicroSi), eller (Tridecafluoro-1 ,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane (t2492-KG, UCT specialiteter, Bristol, PA), för att förhindra PDMS från fastnat på Si mästare rånet.

Molding chips

1. Blanda PDMS (Dow Corning, Sylgard 184) i ett 10:01 förhållande, häll den över befälhavaren Si rånet (~ 15 g per wafer), och låt det botemedel över natten i rumstemperatur.
2. Skala den härdade PDMS utanför Si wafer och klipp ut varje chip med hjälp av ett rakblad.
3. Bond varje chip till en 1x1 cm klipps objektglas för enkel hantering.

Förbereda BFC för användning

1. Blötlägg BFC över natten i PBS för att förhindra absorption av material i PDMS under experimentet.
2. Torka marker med en Kimwipe (Kimtech Science).
3. Sätt en droppe 7,5% bovint serumalbumin (BSA) (~ 200 ml) på den mönstrade ytan av BFC, och sedan skrapa den med en pipettspets för att skingra BSA och avlägsna eventuella luftbubblor från brunnarna.
4. Lämna BSA på BFC ytan i minst 0,5 timmar. Helst agitera BSA var 15 min för att förhindra skorpbildning.
5. För att passa BFC i en 35x10 mm TCPs skålen (Falcon, 35-3001), klipp fälgar med en TCPs maträtt halvvägs ner så att ¾ "bindemedel klipp (Office Depot) passar över skålen RIM att klämma chip och maträtt tillsammans.
6. Skär en spacer packning (ram-formad med 20'20 mm ytterkant, 15'15 mm innerkant, och 250-500 mm tjocklek) från ett PDMS ark (silikon Specialty Products) eller något annat silikon, och tillämpa den på skålen med hjälp av pincett.

Mönstring celler med en BFC

1. Sterilisera skålen, packning, BSA-belagd chip, och 2 klipp pärm under UV-ljus i 1 minut.
2. Aspirera BSA och skölj BFC två gånger med 200 ml PBS.
3. Lägg gelatinet på den avskurna TCPs skålen om det behövs för din cell-linje. Annars väta TCPs ytan med vissa medier innan den på chip (se nedan). Detta förhindrar att bubblor bildas i kammaren.
4. Efter aspirerande PBS, pipett 200 ml cell lösning (~ 1 × 10 ⁶ celler / ml) på BFC ytan. Låt cellerna nöja 5-10 min.
5. Luta BFC att ena hörnet på en ~ 15 ° vinkel och långsamt pipett cellen lösningen av med en 200 ml pipett. Sedan placera BFC platta och tillsätt 100 ml PBS eller tomma media till det motsatta BFC hörn. Skölj BFC på detta sätt en ytterligare 2-4 gånger vid behov, att ta bort alla celler från Inter-väl regioner.
6. Pipettera 200 ml av medier på chipet ytan. Aspirera gelatin / media från TCPs. Sedan inverterar före fuktade skålen och tryck långsamt in BFC upp i skålen.
7. Applicera en pärm klipp vardera, två sidor av kammaren att täta den. Ta bort metall stift från pärm klippen så att rätt förblir nivå när välte.
8. Slutligen snabbt bläddra installationen över samtidigt undvika onödiga rörelser, och placera den i inkubatorn.

Discussion

Även om protokollet och video visas här beskriva med BFC ¹ till embryonala mönster mus stamceller (mESCs) kan BFCs användas för att mönstret nästan alla celltyper av intresse. Den enda förändring man kan behöva göra är att ändra storleken på mikrobrunnarna. Enligt vår erfarenhet att använda BFC att mönstret enstaka celler av en annan celltyp, en brunn diameter och höjd som motsvarar 10 mikrometer större än den fria cellen diameter fungerar bäst.

BFCs kan också användas för att mönster celler på andra substrat, inklusive andra celler, utan betydande förändringar i protokollet. Mönstring på en befintlig cell lager är en fördel med BFC tillvägagångssätt över traditionella metoder cellen mönstring eftersom vissa celltypes, inklusive mESCs och människors ekonomiska och sociala råd, behöver stöd eller feeder celler för att behålla sin rätt fenotyp i kulturen.

En tillämpning av BFC som vi bedriver är att använda BFC att undersöka signalering mellan möss embryonala stamceller. Genom seeding enskilda celler i kvadrat gitter med olika rutnät inbördes avstånd, modulera vi vilken takt signalmolekyler växlas av celler. Genom att göra större brunnar (med en diameter på 40 mikron), kan vi också samla in ett större antal (~ 2-10) cellerna på en viss plats, lokalt förändra celltäthet. Dessutom kan vi placera ett antal små brunnar i nära anslutning till varandra, vilket resulterar i ett substrat mönster där lokala celltäthet är hög av celler inte är i kontakt med. På detta sätt kan vi modulera självständigt diffusionsväte och juxtacrine signalering mellan celler. Efter att ha celler i ett rutnät gör det också mycket lättare att spåra celler under flera dagar. Vi tror att den enkla cellen mönstring med BFC kommer att uppmuntra andra forskare att använda den i sina studier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
Silicon master mould
Tissue culture dishes	Falcon BD	35-3001	35 mm
3/4" binder clips
PBS
hexamethyldisiloxane	Shin-Etsu MicroSi
New Item	MicroChem Corp.	SU8-2050
PM acetate
Isopropanol
BSA			7.5% Bovine Serum Albumin