Summary
אנו להדגים שיטה פשוטה עבור הצבת תאים במקומות הרצויים על המצע. שיטה זו דפוסי תאים על ידי הטלת שבב סיליקון שמכיל microwells מלא תאים על גבי המצע. שיטה זו מספקת דרך חדשה כדי לווסת איתות diffusible ו juxtacrine בין תאים.
Abstract
Cell-cell הגומלין המורכב איתות diffusible לבין תאים תאים קשר (איתות juxtacrine) חשובים תהליכים ביולוגיים רבים כגון גדילת הגידול, התמיינות תאים גזע, תא גזע עצמית והתחדשות. מספר שיטות קיימות כיום לווסת איתות תא במבחנה. שיטה אחת מן הסכום הכולל של ויסות איתות diffusible היא לגוון את צפיפות זריעה התא במהלך התרבות. בשל אופייה האקראי של זריעת תאים, זה תוצאות שונות משמעותית ריווח תאים תאים בפועל סכום של מגע תאים תאים, ולא ניתן לקבוע על הסביבה המקומית. גישה יותר ספציפי לאיתות תא ויסות היא להשתמש מעכבי מולקולרית או גישות גנטיות להפיל איתות חלבונים ספציפיים, אך הן השיטות האלה הם המתאימים ביותר כדי לתמרן מספר קטן של מולקולות. כאן, אנו להפגין גישה חדשה איתות תאים תאים ויסות כי מודולציה על הסביבה המקומית של צביר של תאים על ידי הצבת מספרים שונים של תאים במקומות הרצויים על המצע. שיטה זו מספקת דרך משלימים לשלוט איתות diffusible ו juxtacrine מקומי בין תאים. השיטה שלנו עושה שימוש שבב Flip ביו (BFC), שבב סיליקון microfabricated המכיל מאות ל-אלפי microwells, כל אחד בגודל להחזיק או תא בודד או מספר קטן של תאים. אנחנו מעמיסים את השבב עם תאים פשוט על ידי pipetting אותם על גבי מערך של בארות כביסה תאים פרקו את המערך. השבב ואז התהפך על מצע, לפיה התאים נפולת של בארות על המצע, שמירה על דפוסים שלהם. אחרי התאים יש המצורפת, השבב ניתן להסיר (או שמאלה). גישה זו דפוסים התא הוא ייחודי בכך שהוא: 1) לא משנה את הכימיה של המצע, ובכך מאפשר לתאים להתרבות ולהעביר; 2) מאפשר דפוסים על גבי מצע כלשהו, לרבות קלקר רקמות תרבות, זכוכית, matrigel, ו גם מזין שכבות התא; ו 3) תואם הדפסה microcontact המסורתי, המאפשר יצירה של איים תאי מטריקס עם תאים אלה ממוקמים בתוך האיים. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את דפוסים של תאים עובריים בעכבר על קלקר רקמות התרבות באמצעות BFC.
Protocol
ביצוע BFC
BFCs מבוצעים על ידי דפוס polydimethylsiloxane (PDMS) מעל פרוסות סיליקון 4 Si "מאסטר.
ביצוע רקיק אמן
- התחל על ידי dehydrating ופלים Si למשך 30 דקות ב 130 ° C.
- מניחים את פרוסות על coater ספין, לשפוך SU8-2050 (Microchem) על גבי פרוסות סיליקון, כבש מתוך זה 300 / סל"ד עד 3000-4000 סל"ד, ו - עבור ספין של 30 להניב לגבהים תכונה של 40-30 מ"מ, בהתאמה.
- אחרי ספינינג, המקום רקיק על 65 מעלות צלזיוס פלטה חשמלית, מיד תעלי את הטמפרטורה עד 95 מעלות צלזיוס במשך 5-6 דקות, ולאחר מכן כבש אותו עד 65 ° C.
- לחשוף את פרוסות למינון של 200 UV mJ / 2 ס"מ על aligner קשר באמצעות מסיכה כהה שדה.
- מניחים את פרוסות על פלטה חשמלית 65 מעלות צלזיוס, מיד תעלי את הטמפרטורה עד 95 מעלות צלזיוס במשך 4-5 דקות, ולאחר מכן כבש אותו עד 65 ° C.
- פיתוח ופלים ב אצטט ראש הממשלה Isopropanol.
- Silanize ופלים למשך 30 דקות באמצעות hexamethyldisiloxane (שין, אטסו MicroSi), או (Tridecafluoro-1-,1,2,2 tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane (t2492-KG, התמחויות UCT, בריסטול, פנסילבניה), כדי למנוע מן PDMS דבקות רקיק האב סי.
דפוס שבבי
- מערבבים PDMS (Dow Corning, Sylgard 184) ביחס 10:01, יוצקים אותו על פרוסות סיליקון אמן סי (~ 15 גרם לכל רקיק), ולתת לו לרפא לילה בטמפרטורת החדר.
- קולפים את PDMS נרפא את פרוסות סיליקון Si ו לגזור כל שבב באמצעות סכין גילוח.
- בונד כל שבב שקופיות מיקרוסקופ 1x1 ס"מ לחתוך לטיפול קל.
הכנת BFC לשימוש
- משרים את הלילה BFC ב PBS על מנת למנוע ספיגה של מדיה לתוך PDMS במהלך הניסוי.
- יבש שבבי עם Kimwipe (Kimtech המדע).
- שים ירידה של 7.5% שור סרום אלבומין (BSA) (~ 200 מ"ל) על פני השטח בדוגמת של BFC, ואז לגרד אותה עם טיפ פיפטה לפזר את BSA ולהסיר בועות מהבארות.
- השאר את ארגון ה-BSA על פני השטח BFC לפחות 0.5 שעות. באופן אידיאלי להתסיס את BSA כל 15 דקות כדי למנוע קרום הנוצר.
- כדי להתאים את BFC בתוך צלחת 35x10 מ"מ TCPS (Falcon, 35-3001), לחתוך את שולי דרך צלחת TCPS וחצי למטה כך ¾ "קליפים קלסר (אופיס דיפו) יתאים מעבר לשולי הצלחת כדי לצבוט את שבב ו צלחת יחד.
- גזור אטם spacer (מסגרת בצורת עם קצה 20'20 מ"מ החיצוני, הפנימי 15'15 קצה מ"מ, 250-500 מ"מ עובי) מסדין PDMS (מוצרי סיליקון מיוחדים) או סיליקון אחרים, ולהחיל אותו על צלחת באמצעות פינצטה.
דפוסים תאים עם BFC
- לעקר את המנה, אטם, BSA מצופה שבב, ו -2 קליפים קלסר תחת אור UV למשך דקה 1.
- לשאוב BSA ולשטוף את BFC פעמיים עם 200 מ"ל PBS.
- מוסיפים ג'לטין כדי בצלחת TCPS לחתוך אם נדרש קו התא שלך. אחרת, להרטיב את המשטח TCPS עם התקשורת קצת לפני החלת אותו השבב (ראה להלן). הדבר מונע מן בועות להרכיב בחדר.
- לאחר aspirating PBS, פיפטה 200 מ"ל של תמיסת התא (~ 1 × 10 6 תאים / מ"ל) על פני השטח BFC. בואו התאים להסתפק 5-10 דקות.
- הטה את BFC לפינה אחת בכל זווית ~ ° 15 לאט פיפטה את פתרון התא עם טפטפת 200 מ"ל. ואז, במקום שטוח BFC ולהוסיף 100 מ"ל של PBS או מדיה ריקה לפינה BFC ההפוך. שוטפים את BFC באופן זה נוסף 2-4 פעמים, לפי הצורך, כדי לנקות את כל התאים של בין היטב אזורים.
- פיפטה 200 מ"ל של התקשורת על גבי משטח השבב. לשאוב ג'לטין / מדיה TCPS. ואז להפוך את המנה מראש הרטובות ולאט לאט לדחוף למעלה BFC, לתוך צלחת.
- החל בקלסר כל קליפ, על שני הצדדים של החדר כדי לאטום אותו. הסר את חודי מתכת מן קליפים קלסר כך צלחת נותר ברמה כאשר התהפך.
- לבסוף, במהירות להפוך את ההתקנה תוך הימנעות לאורך כל תנועה מיותרת, ולמקם אותו בחממה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אף על פי הפרוטוקול וידאו שמוצג כאן לתאר באמצעות 1 BFC עכבר דפוס בתאי גזע עובריים (mESCs), BFCs ניתן להשתמש דפוס כמעט כל סוג תא של עניין. השינוי היחיד שיהיה עליך לעשות הוא לשנות את הגודל של microwells. מניסיוננו, להשתמש BFC לתאי תבנית אחת של סוג תא אחר, בקוטר microwell וגובה שווה יותר מ 10 מיקרון קוטר תא פנוי עובד הכי טוב.
BFCs יכול לשמש גם לתאי דפוס על גבי מצעים אחרים, כולל תאים אחרים, ללא שינויים משמעותיים בפרוטוקול. דפוסים על שכבת התאים הקיימים היא אחד היתרונות של הגישה BFC על גישות דפוסים מסורתיים התא מאז celltypes מסוימים, כולל mESCs ו ESCs אדם, דורשים תמיכה או תאים מזין לשמור פנוטיפ תקין שלהם בתרבות.
אחד היישומים של BFC כי אנחנו רודפים אחרי היא להשתמש BFC לחקור איתות בין תאים עובריים בעכבר. על ידי זריעת תאים בודדים ב סריגי מרובע עם spacings רשת שונים, אנו לווסת את הקצב שבו מולקולות איתות מוחלפים על ידי התאים. על ידי ביצוע בארות גדול יותר (בקוטר של 40 מיקרון), אנחנו יכולים גם לאסוף מספרים גדולים יותר (~ 20-10) תאים במקום מסוים, מקומי שינוי צפיפות התאים. בנוסף, אנחנו יכולים למקם מספר בארות קטנות בסמיכות זה לזה, וכתוצאה מכך דפוס המצע בו צפיפות התאים המקומי הוא גבוה על ידי תאים אינם בקשר. באופן זה, אנו יכולים באופן עצמאי לווסת איתות diffusible ו juxtacrine בין תאים. לאחר התאים ברשת גם עושה את זה הרבה יותר קל לעקוב אחר תאים על פני כמה ימים. אנו מאמינים כי הקלות של דפוסים תא עם BFC יהיה לעודד חוקרים אחרים להשתמש בו לימודיהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק EB007278.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Silicon master mould | |||
| Tissue culture dishes | Falcon BD | 35-3001 | 35 mm |
| 3/4" binder clips | |||
| PBS | |||
| hexamethyldisiloxane | Shin-Etsu MicroSi | ||
| New Item | MicroChem Corp. | SU8-2050 | |
| PM acetate | |||
| Isopropanol | |||
| BSA | 7.5% Bovine Serum Albumin |
References
- Rosenthal, A., Macdonald, A., Voldman, J. Cell Patterning Chip for Controlling the Stem Cell Microenvironment. Biomaterials. 28, 3208-3216 (2007).
