Lensless microscopie à fluorescence sur une puce

Summary

Un lensless sur puce plateforme de microscopie à fluorescence est démontré que peut objets image fluorescente sur un ultra-grand champ de vue des ex,> 0,6 à 8 cm2 avec <4μm résolution à l'aide d'un échantillonnage à la compression basée algorithme de décodage. Un tel compact et à large champ modalité d'imagerie fluorescente sur puce pourrait être précieuse pour les haut-débit cytométrie, rares recherche sur les cellules et les puces-analyse.

Abstract

Sur puce imagerie sans lentille, en général vise à remplacer encombrants à base de lentilles des microscopes optiques avec plus simples et plus compacts, en particulier pour les applications de criblage à haut débit. Cette plateforme technologique émergente a le potentiel d'éliminer la nécessité d'encombrants et / ou coûteux composants optiques grâce à l'aide de nouvelles théories et des algorithmes de reconstruction numérique. Dans le même sens, ici nous montrer une modalité sur puce microscopie fluorescente qui peut atteindre, par exemple, <4μm résolution spatiale sur un ultra-grand champ de vision (FOV) de> 0,6 à 8 cm ^2, sans l'utilisation de toute lentilles , mécanique à balayage ou à couche mince filtres d'interférence basée. Dans cette technique, d'excitation fluorescente est atteint grâce à une interface prisme ou hémisphériques de verre éclairé par une source incohérente. Après interaction avec le volume de l'objet entier, cette lumière d'excitation est rejetée par Total-interne de réflexion (TIR) ​​processus qui se déroule au bas de l'échantillon micro-fluidique puce. L'émission de fluorescence à partir des objets excité est alors recueilli par une façade en fibre optique ou d'un cône et est livré à un réseau de capteurs optoélectroniques tels que une charge-coupled-device (CCD). En utilisant une compression-échantillonnage algorithme basé décodage, l'acquisition lensfree premières images fluorescentes de l'échantillon peut être rapidement traitées pour produire, par exemple, <4μm résolution sur un FOV de> 0,6 à 8 cm ^2. Par ailleurs, empilés verticalement micro-canaux qui sont séparées par exemple, 50-100 um peut également être imagées avec succès en utilisant les mêmes lensfree plateforme de microscopie sur-puce, ce qui augmente encore le débit global de cette modalité. Ce compact sur puce plateforme d'imagerie fluorescente, avec un décodeur rapide compression derrière elle, pourrait être assez utile pour haut-débit cytométrie, rares recherche sur les cellules et les puces-analyse.

Protocol

Dans cette section, nous passerons en revue les méthodes expérimentales de notre lensless sur puce plateforme de microscopie fluorescente ^1-4. Pour démontrer les capacités de cette technique, nous allons montrer des résultats d'imagerie sur puce pour les micro-particules fluorescentes et étiquetés globules blancs. Même s'il n'est pas question ici, la même plate-forme de microscopie à fluorescence lensfree peut également être utilisé pour les animaux image Autorisation des modèles de petite taille comme transgénique C. échantillons elegans ^3.

1. Conception de la plateforme d'imagerie sur puce sans lentille

Notre plate-forme d'imagerie sans lentille sur puce comprend plusieurs composants optiques, y compris un réseau de capteurs numériques (par exemple, une puce CCD), une source d'illumination incohérente, un prisme, un filtre d'absorption, une façade en fibre optique ou d'un cône en fibre optique. Comme le montre la figure 1, ces éléments sont assemblés avec des micro-fluidiques pour réaliser l'imagerie de fluorescence d'un grand volume d'échantillon sur une puce, sans l'utilisation de tout les lentilles, les scanners mécaniques ou à couche mince filtres d'interférence basée.

1. Réseau de capteurs numériques: Notre configuration imagerie sans lentille utilise une matrice de capteurs optoélectroniques à enregistrer l'émission de fluorescence de la cible des micro-objets. Dans cette plate-forme, pour la détection du signal de fluorescence, les différents types de capteurs tableaux peuvent être utilisés, tels que capteurs CCD (par exemple, les modèles: KAF-8300, KAI-11002, KAF-39000, tous de KODAK) et complémentaire à oxyde de métal semi-conducteurs imageurs CMOS (par exemple, du modèle: MT9T031C12STCD, des Technologies de Micron). Les principaux paramètres d'intérêt pour ces réseaux de capteurs-notamment la taille du pixel (par exemple, 5,4 um, 9 pm, 6,8 et 3,2 um um pour KAF-8300, KAI-11002, 39000 et KAF-MT9T031C12STCD, respectivement) et la zone d'imagerie active ( par exemple, 2,4 cm ^2, 8 cm ^2, 18 cm ² et 32 mm ² pour KAF-8300, KAI-11002, 39000 et KAF-MT9T031C12STCD, respectivement). Pour lensfree sur puce d'imagerie, les capteurs CCD peut en général être préférée pour atteindre un débit plus élevé (plus large zone active) et une meilleure sensibilité, tandis que des capteurs CMOS peut être préféré pour les conceptions de poids relativement moins chers et plus légers (par exemple, pour utilisation sur le terrain).
2. Sources lumineuses: Dans notre plateforme, une source de lumière incohérente, par exemple, une simple diode électroluminescente (LED, par exemple, de Thorlabs, M455L2-C2 et LEDD1B), peut être utilisé pour l'excitation de fluorescence. Dans le dispositif expérimental Fig. 1, un multi-mode fibre optique (Thorlabs, BFH37-1000) avec une taille du coeur mm crosse couplé à une source à LED (sans l'utilisation de lentilles ou de toute optique de couplage) et la lumière d'excitation est alors livré à la volume d'échantillon à travers l'ouverture de sortie de cette fibre. Dans ce système, le niveau de puissance requis de l'excitation de fluorescence devrait être d'environ ~ 0,2 à 5 mW pour un FOV de> 2-8 cm ² à la sortie de la fibre d'illumination, mais les voyants devraient être en mesure de sortie ~ 5mW-1W niveaux de puissance à l'approche des fesses de couplage est nettement perte qui diminue la puissance d'excitation à la sortie de la fibre. Pour parvenir à l'excitation des divers colorants, des LED de couleurs différentes peuvent également être multiplexés en utilisant un coupleur de fibres optiques.
   En plus de sur-puce d'imagerie fluorescente, la transmission des images holographiques lensfree du même échantillon peuvent aussi être obtenus avec cette plate-forme en utilisant une source d'illumination verticale comme illustré dans la Fig. 2. Contrairement à la fibre d'excitation de fluorescence, pour l'acquisition de l'image holographique, un autre câble en fibre optique avec une taille plus petite base (par exemple, ~ 50 à 400 um) est couplé à bout d'une autre source à LED (Mightex, FCS-0625-000). Cette lumière éclairage vertical, après avoir quitté la fibre-end, commence à acquérir la cohérence spatiale partielle car elle se propage vers l'échantillon. Le diamètre de cette région spatialement cohérent est proportionnelle à la distance que la lumière se déplace et est inversement proportionnelle à la taille de l'ouverture de sortie de la fibre. Tant que ce diamètre cohérence spatiale au plan de l'échantillon est plus grand que la taille de chaque échantillon de diffraction dans le plan du capteur, la lumière diffusée par chaque objet peut fidèlement interférer avec la lumière de fond, créant un lensfree en ligne hologramme de l'échantillon. Ces hologrammes acquis lensfree peuvent être rapidement traitées en utilisant des approches itératives de récupération de phase de reconstruire une transmission lumineuse-champ de l'image du volume de l'échantillon ^5-7. Pour cette fin d'illumination holographique, une longueur d'onde de LED (c.-à ~ 625-700 nm) est sélectionné car les filtres d'absorption qui sont utilisés pour bloquer la lumière d'excitation sont filtres passe-haut avec les typiques de coupure des longueurs d'onde d'exemple, 500-600nm , qui permet l'acquisition de la transmission en ligne des hologrammes des échantillons sans un problème.
3. Autres composants optiques: Dans cette plate-forme sur puce microscopie à fluorescence, deux méthodes de filtrage d'excitation différentes sont utilisées en parallèle pour créer le besoin en champ sombre de fond comme le montre la figure 2. Tout d'abord, un prisme de verre (par exemple, EdmundOptique, rhomboïde ou prismes colombe) ou un verre hémi-sphère est utilisée pour créer totale internes de réflexion (pour la lumière d'excitation) à la surface inférieure de la puce micro-fluidique, qui héberge les échantillons d'intérêt. En parallèle à cela, un filtre d'absorption peu coûteux (par exemple, de Roscolux) est utilisé enlever la lumière d'excitation faiblement dispersées qui n'obéit pas à la procédure TIR. Après le rejet de succès de l'excitation à l'aide de ces deux mécanismes, que l'émission de fluorescence des échantillons est acquise au plan du détecteur. Notez ici qu'une certaine fraction du signal émis fluorescentes éprouve aussi TIR à la même interface. Cependant, cette limite seulement la détection de l'ouverture numérique de cette lensfree sur puce approche d'imagerie à ~ 1,0, de sorte que seuls les rayons obliques dessus d'une telle ouverture de détection de haute numériques restent piégées dans la micro-puce, tout le reste de la fluorescence des rayons peuvent encore frappé la zone active du capteur de tableau à être échantillonnée par ses pixels.
   Malgré une telle ouverture de détection de grandes numériques, les taches fluorescentes premières vers le capteur-array devenu assez large (par exemple, ~ 150-200 um) depuis fluorescente émission n'est pas directionnel et donc rapidement diverge. Pour l'ingénieur et de mieux contrôler l'étalement spatial de ce signal fluorescent dans notre plateforme sans lentille, nous avons utilisé une composante planaire optique, à savoir, une face avant en fibre optique (par exemple, Edmund Optics, NT55-142), qui est placé entre l'objet et le avions capteur. Une façade en fibre optique est composé d'un tableau 2D de câbles à fibres optiques qui transportent l'information d'intensité optique d'un côté de l'appareil à l'autre. Sa fonction principale dans notre lensfree sur puce microscopique mise en place est de coupler les modes en espace libre de l'émission de fluorescence à partir du volume d'échantillon dans guidée des ondes optiques voyageant sans étalement spatial au sein de chaque fibre, ce qui peut restreindre partiellement le point lensfree fluorescentes fonction d'étalement-(PSF) entre l'objet et les avions de détection. Ceci augmente encore notre rapport signal-bruit (SNR), ainsi que la résolution spatiale qui peut être atteint en utilisant notre plateforme sans lentille.
   Comme une alternative à une façade régulière, on peut aussi utiliser dans notre plate-forme d'imagerie sur puce un "conique" fibre optique face avant qui a une densité beaucoup plus importante de câbles de fibre optique sur son facette supérieure par rapport à celle du bas. Une telle plaque avant conique n'est pas seulement nous aider à atteindre un meilleur PSF, mais aussi peut introduire un grossissement de notre plate-forme (par exemple,> 2-3x) qui a encore nous aide à améliorer notre résolution sans lentille vers le bas pour, par exemple, <4 um. Nous devons également noter que le champ de vision d'une telle conception conique est réduite d'au moins le carré du facteur de grossissement introduit par rapport à un système d'imagerie façade régulière basée, qui peuvent constituer une réduction de par exemple, à partir de ~ 8 cm ² FOV initialement (CCD: KAI-11002) jusqu'à ^<2 cm 2 avec le cône.
   Enfin, nous devrions également noter que l'utilisation d'une façade en fibre optique ou un cône déforme les hologrammes lensfree de l'échantillon en raison de divers modes optiques de la matrice de la fibre optique ^3. Bien que ces modèles déformés lensfree à la matrice de détecteurs peut encore être utile pour certaines applications par rapport cytométrie, pour la reconstruction holographique des images de transmission, le réseau de fibre optique (par exemple, la façade ou le cône) doit être retiré de l'assemblée sur puce au coût de la résolution spatiale légèrement réduit dans le mode ³ fluorescent.
4. Micro-fluidique Chips: Les puces micro-fluidiques qui sont utilisés dans notre plate-forme sont fabriqués en utilisant des PDMS (polydiméthylsiloxane) murs placés sur des lames de verre créant les micro-canaux qui sont nécessaires pour sur-puce d'imagerie. Pour fabriquer ces canaux micro-fluidiques nous poursuivons la recette suivante:
   1. PDMS A et B élastomères sont uniformément mélangés et agités avec un rapport volume de 01h10.
   2. Une fois cette solution hétérogène est coulé à une boîte de Pétri, il est guéri à 65 ° C pendant 2 heures.
   3. En utilisant un couteau X-acto, la taille requise et la forme de la paroi des micro-fluidiques canal est extraite de la boîte de Pétri.
   4. Le collage dispositif est alors obtenue en utilisant une fréquence de haute générateur de plasma (Electro-Technic Products Inc, BD-10AS), qui a besoin d'exposer à la fois les lames de verre de couverture et la surface de collage du PDMS.
   5. Après ce traitement plasma, l'appareil est placé dans un four pendant 40-50 minutes ~ 70 ° C pour renforcer le collage.
5. Assemblée et l'alignement de la plate-forme de microscopie sur puce sans lentille:
   Les procédures de montage pour notre plate-forme d'imagerie lensfree sur puce peuvent être détaillés comme:
   1. Verre de l'opto-électronique capteur de tableau est enlevé.
   2. En utilisant un stylo vide (Edmund Optics, NT57-636), un filtre d'absorption mince est placé délicatement sur le dessus de la zone de détecteur actif.
   3. Une façade en fibre optique ou d'un cône est positionné en haut de cette absorption de fIlter.
   4. Le fabriquées micro-fluidique puce est ensuite directement placé sur le dessus du tableau de fibre optique.
   5. Un prisme de verre ou d'un hémi-sphère est monté au-dessus de la puce micro-fluidique utilisant une huile indice correspondant (Cargille, l'huile d'immersion Série 300) de telle sorte que l'indice de réfraction de l'interface est adapté à l'indice de réfraction du verre.
   6. De fibres d'illumination latérale est rapprochée du prisme (ou l'hémi-sphère) et son angle est ajusté afin de s'assurer que la réflexion totale interne au produit à l'interface verre-air correspondant au substrat du fond de la puce micro-fluidique est. L'éclairage vertical (pour la transmission lensfree imagerie) est aligné à être perpendiculaire au détecteur-array et est centrée à une désiré champ de vision.
   7. Latéral et vertical sources lumineuses sont séquentiellement activé / désactivé pour atteindre à la fois l'imagerie de fluorescence et l'imagerie de transmission lumineuse-champ en utilisant la même plateforme on-chip.
   8. Lensfree images brutes sont alors acquises à l'aide d'une interface personnalisée développée Labview par un PC (par exemple, 3,2 GHz, Intel Core).

2. Préparation des échantillons

Nous avons utilisé fluorescentes microbilles (par exemple, Invitrogen, Fluospheres) pour calibrer notre plate-forme d'imagerie, en mesurant son système lensfree point étalement de la fonction (FSP). Après cette évaluation initiale PSF est fait, les différentes cellules ou des animaux petit modèle (par exemple, transgéniques C. elegans échantillons) peuvent être visualisés en utilisant les mêmes sur puce plate-forme.

A partir de la sous-section suivante, nous vous fournirons de plus amples détails de nos étapes de préparation d'échantillon.

1. Fluorescent microbilles:
   1. Raw fluorescentes solutions billes sont combinés avec de l'eau DI pour optimiser la concentration des échantillons.
   2. ~ 10 uL d'une solution fluorescente perle est mélangé avec 40 uL, 5 ml et 20 ml d'eau DI pour 10 pm, 4 um et 2 pm de diamètre des perles, respectivement. Solutions hétérogènes de perles diverses (par exemple, non fluorescents et les lampes fluorescentes) sont préparés selon les besoins par mélange des différentes solutions perles avec l'autre.
   3. La solution finale de l'échantillon est ensuite injecté dans la puce micro-fluidique des murs latéraux à l'aide PDMS une aiguille de seringue nettes (Fisher Scientific, BD Aiguilles PrecisionGlide, 14-826 Série)
2. Blanc marquage des cellules sanguines:
   1. Un volume d'environ 100 uL de sang entier est mélangé avec ~ 1 mL de tampon de lyse des globules rouges du sang (eBioscience).
   2. Après une incubation de ~ 3 min, la solution est centrifugée sang lysé et la couche de culot est resuspendu dans ~ 200 ul de PBS (tampon phosphate salin).
   3. Pour marquer les acides nucléiques des cellules avec des colorants de fluorescence, 5 pi de 1mM SYTO 16 est ajouté à la uL 200 de la remise en suspension, après quoi l'échantillon est incubé pendant 30 min ~ dans l'obscurité à température ambiante.
   4. Deuxième centrifugation est appliqué à cet échantillon étiqueté, où le surnageant est éliminé pour diminuer le bruit de fond dû à l'émission fluorescente des colorants non consolidés.
   5. Globules blancs granulés couche est remis en suspension dans du PBS qui peuvent ensuite être transférés à une puce micro-fluidique pour lensfree sur puce imagerie de fluorescence (voir par exemple, la Figure 7).

3. Le traitement numérique de l'acquisition des images fluorescentes sans lentille

Dans cette plate-forme d'imagerie sans lentille, deux algorithmes différents sont utilisés pour augmenter la résolution numérique du système, à savoir la déconvolution de Lucy-Richardson et d'échantillonnage à la compression basée décodage. Grâce à l'utilisation de ces méthodes de traitement numérique, nous avons quantifié l'amélioration de la résolution qui peut être réalisé avec chaque approche en résolvant serrées perles paires (voir fig. 5-6). Les images fluorescentes lensfree reconstruite peut alors être pseudocolored (si désiré) pour souligner la couleur naturelle de la micro-objets, ce qui nécessite sans doute une connaissance préalable de la longueur d'onde du signal fluorescent, à moins d'une couleur (par exemple, une RVB: rouge-vert-bleu CCD / CMOS) capteur de puce est utilisée. Pour ces méthodes de traitement numérique, sur mesure développé des algorithmes sont utilisés que seulement besoin d'un processeur (par exemple, un processeur 3,2 GHz, Intel Core). Potentiellement, la prochaine génération de processeurs graphiques (GPU) pourrait également être utilisé pour un traitement plus rapide. En plus de l'imagerie, si nécessaire, les objets décodés fluorescents peuvent également être automatiquement comptés à l'aide d'une interface personnalisée développée (voir fig. 8) pour les applications de la cytométrie sur puce.

1. Mesure du système de points-Spread Function (PSF):
   Avant tout traitement numérique pour la résolution d'amélioration (tels que la déconvolution ou de compression de décodage), l'incohérent point répandre la fonction du système sur puce doit être estimée, ce qui peut être obtenu en faisant la moyenne de plusieurs mesurée lensfree modèles fluorescents créé par fluorescentes isolées petits perles situées à une certaine hauteur à partir du capteur à puce. Cesindividuelles modèles fluorescents sont ensuite alignés par rapport à leur centre des coordonnées de masse à la moyenne, après ^1,2 intensité de normalisation appropriée. Ce modèle peut être en moyenne lensfree ensuite utilisée comme point fluorescents répartis en fonction de notre sur-puce de microscope.
2. Lucy-Richardson Déconvolution ^1: Pour améliorer numériquement la résolution spatiale de notre plateforme, nous nourrissons les premières images acquises fluorescent et la mesure incohérente point répandre fonction dans une accélération de ^8-10 algorithme de Lucy-Richardson. En appliquant le théorème de Bayes, l'algorithme de Lucy-Richardson utilise le point mesuré répandue fonction pour affiner l'estimation itérative du maximum de vraisemblance de la distribution source de fluorescence à l'avion ^8,9 objet. Le processus d'itération est terminée généralement après quelques centaines de cycles avant l'émergence de l'amplification du bruit afin d'assurer un minimum d'erreur quadratique entre les projections et les modèles mesurés lensfree fluorescentes. La convergence de cet algorithme de déconvolution a également été accélérée par une méthode d'extrapolation vectorielle pour raccourcir le temps de calcul ^10. Pour donner une idée: cet algorithme fournit une résolution spatiale effective d'environ 20 um (à l'aide d'une puce CCD / CMOS avec une taille de pixel de par exemple, ~ 9μm) et peut déconvolutionner un FOV de ~ 8 cm ² à l'intérieur de quelques dizaines de minutes sur un PC qui exécute régulièrement Matlab ^1. Notez que le temps de calcul même tombe à seulement quelques secondes pour que, par exemple, ~ 1mm ² FOV qui est comparable à la FOV d'un objectif 10X typique.
3. La compression d'échantillonnage / de détection basée clairsemées-décodage du signal ^2: amélioration de la résolution ultérieure (jusqu'à <4 um) ⁴ peut être réalisé en utilisant la compression de détection / d'échantillonnage basé algorithmes de décodage ^11,12. L'échantillonnage à la compression / détection fournit un cadre théorique récemment émergents ^13-15 qui vise à récupérer un signal à partir d'échantillons rares beaucoup moins que ce qui est nécessaire selon le théorème de l'échantillonnage. Alors qu'en général, la récupération du signal, à partir de sous-échantillonnés mesures est un problème mal posé, pour une classe spécifique de fonctions (notamment pour les fonctions éparses), le théorème d'échantillonnage bien connue et de sa base de représentation est récemment montré tout à fait inefficace en termes du nombre de mesures qui sont nécessaires, c'est à dire, le même signal clairsemées peuvent en général être récupéré de manière unique très peu d'échantillons par rapport à la théorie de l'échantillonnage classique.
   Lensless images fluorescentes enregistrée par notre sur-puce de microscope intrinsèquement satisfaire une exigence importante de la compression de décodage: Pour les applications qui sont d'intérêt pour ce travail, comme à grand champ cytométrie fluorescente, l'analyse de cellules rares et haut débit d'imagerie micro-array, objets fluorescents d'intérêt peut être considéré comme déjà rares. Par conséquent, dans notre microscope à fluorescence sans lentille, le décodage de la distribution et la force relative des émetteurs fluorescents situés au plan objet peut être modélisée comme un L à grande échelle _une régularisés moindre problème carrés qui peuvent être résolus en utilisant par exemple, un intérieur- ^2,12 point de la méthode. Ce problème d'optimisation peut être exprimée mathématiquement comme:
   
   où | | u | | = _k (Σ ⁿ _i | u _i | ^{k) (1 / k)} et | | u | | _∞ = max _i | u _i |. Ainsi, nous minimisons l _1-2-L régularisé norme de la différence entre le enregistrées / mesurées (y) et l'estimation (Ax) lensfree images, où x et A représentent la distribution source pour être décodé et la matrice de mesure formé en utilisant le PSF expérimentale du système, respectivement. Nous utilisons également une fonction de contrainte forçant la distribution des sources dans le plan objet à être non négatives. Ce processus itératif de décodage à la compression se termine lorsque la valeur de la fonction de coût atteint à une valeur de tolérance prédéterminé. Paramètres de régularisation (β) et la tolérance sont des fonctions générales de la parcimonie objet et le niveau de bruit de mesure, et sont optimisés dans notre système à ~ et ~ βmax/10 0,01, respectivement.
   Basé sur le schéma ci-dessus décrites numérique, la compression de décodage des premières images fluorescentes améliore grandement la capacité de notre plate-forme pour résoudre des objets rares et présente une vitesse de traitement comparables à Lucy-Richardson Déconvolution ^2. En plus de l'imagerie d'une seule couche, d'objets fluorescents situés à des profondeurs différentes peuvent également être décodé et séparés les uns des autres en exécutant simultanément le même algorithme en utilisant tous les PSF correspondant à des couches différentes profondeurs ^2.
4. Pseudocoloring: Bien que n'étant pas une limitation fondamentale, la plateforme d'imagerie présentées sur puce emploie principalement des monochromes opto-électronique SEtableaux RNDS qui prévoient en général un meilleur rapport signal-bruit pour l'imagerie de l'échantillon biologique. Par conséquent, les images brutes acquises fluorescents sont en niveaux de gris de format, qui ne contient pas les informations de couleur réelle des échantillons. Ce pourrait être atténué en utilisant la couleur CCD / CMOS puces dans notre architecture d'imagerie telles que lensfree trois canaux de couleur (rouge, vert et bleu) sont acquis dans chaque mesure lensfree fluorescentes. D'autre part, si les caractéristiques d'émission de teinture d'étiquetage sont déjà connus, le format RAW en niveaux de gris des images fluorescentes d'un capteur monochrome puce et leurs versions décodées / deconvoled peuvent également être convertis en images artificiellement couleur en utilisant un algorithme de mise en œuvre dans pseudocoloring par exemple, MATLAB. À cette fin, les images acquises en niveaux de gris peut être étendu à trois dimensions des données-cubes, où toutes les couleurs d'intérêt peuvent être synthétisés en utilisant des facteurs pesant sur chaque canal pseudo du cube de données. En conséquence de ce traitement, monochrome images lensfree fluorescentes peuvent être convertis (si désiré) pour des images multi-canaux qui fournissent des informations de couleur connue d'un objet donné fluorescentes.
5. Comptage automatique des cellules fluorescentes: Pour les applications en cytométrie, nous avons également développé une interface utilisateur personnalisée conçu (voir figure 8.) Qui peut compter automatiquement les objets fluorescents / cellules en fonction de leurs images lensfree acquises grâce à notre plateforme de microscopie sur puce. Vers cette tâche, d'abord un seuil douce est appliquée aux premières images lensfree d'affiner emplacements potentiels d'objets fluorescents. Ensuite, une série de fonctions (en particulier regionprops) sont utilisés pour mesurer les propriétés d'image de chaque sous-région d'intérêt tels que la position, la superficie, la forme et l'intensité. En utilisant ces données de l'objet, les objets binaires sont classés en sous-groupes, comme les cellules, les pixels morts, ainsi que l'auto fluorescence de poussière ou de fond. Une fois que le résultat final de la fonction regionprops est filtrée pour afficher uniquement les cellules d'intérêt, la longueur du tableau structure qui en résulte peut être utilisé pour obtenir le nombre de cellules sur le champ de vision entier de notre lensfree sur puce imageur.

4. Les résultats représentatifs:

Un aperçu de notre set-up est montré dans la figure 1, avec plusieurs composants optiques qui sont utilisés dans l'assemblage. Les principales caractéristiques de notre plate-forme de microscopie sur puce sont expliqués dans la figure 2, dont l'excitation et la détection fluorescente, une réflexion interne totale ainsi que l'éclairage partiellement cohérent pour l'imagerie holographique de transmission sur la même plateforme. Lensless fluorescentes résultats d'imagerie sur puce d'un mélange hétérogène contenant divers micro-particules (4 um et 10 um vert vert / rouge) sont présentés aux figures 3-4. Comparaison de Lucy-Richardson déconvolution et la compression d'échantillonnage / de détection basée décodage est fourni dans la Figure 5 pour l'amélioration de la résolution numérique des premières images fluorescentes sans lentille. Compression de décodage ont permis la résolution spatiale (<4 um) est quantifié dans la figure 6. Lensless sur puce microscopique du marquage fluorescent des globules blancs est illustré à la figure 7, qui fournit également des images de comparaison prises avec un microscope conventionnel fluorescent. Enfin, notre interface de fluorescence automatisé compter objet est montré dans la figure 8.

Aperçu Figure 1. Lensless de notre sur-puce d'imagerie mise en place est montré avec plusieurs composants optiques qui sont utilisés dans l'assemblage.

Figure 2. Le schéma de principe sur puce plateforme lensfree imagerie de fluorescence est montré (image de gauche). D'excitation de fluorescence est réalisée par la facette latérale d'un prisme rhomboïde utilisant une source incohérente. Le dispositif expérimental de notre sur-puce plateforme d'imagerie fluorescente est également montré (image de droite). Échantillon de sang total dans une puce microfluidique (dimensions: 2,5 x 3,5 x 0,3 cm) a été excité par l'interface prisme, où le pétrole index correspondantes a été utilisée pour assembler les puces et le prisme. Après le rejet de la lumière d'excitation par le TIR et le filtre de couleur, seule l'émission de fluorescence à partir des cellules du sang marqué a été enregistré par notre puce de capteur CCD (KODAK 11002) sur un FOV de ~ 2,5 x 3,5 cm.

Figure 3. Grand champ sans lentille fluorescente sur puce d'imagerie d'un mélange contenant 4 um et 10 um verte particules fluorescentes est illustré. Pour fins de comparaison, les images objectif de microscope 10X sont également fournis, qui s'accordent bien avec nos images fluorescentes sans lentille.

Figure 4.

Figure 5. Comparaison des performances de l'Lucy-Richardson (LR) de déconvolution et d'échantillonnage à la compression (CS) sur la base des algorithmes de décodage est fourni, pour l'imagerie de divers 10 um perles paires. La rangée du haut illustre les premières images fluorescentes sans lentille. Les images en médaillon dans la rangée du haut montrent les comparaisons microscope des mêmes particules qui sont acquis en utilisant un objectif 10X. La rangée du milieu montre notre compression des résultats de décodage alors que la rangée du bas illustre les résultats de déconvolution de Lucy-Richardson. d, d _CS, et d _LR se référer à des distances de centre à centre en images de microscopie, CS décodé des images sans lentille, et LR déconvoluées images sans lentille, respectivement.

Figure 6. Traitement numérique des images brutes sans lentille fluorescente est illustré. Un algorithme de compression basée échantillonnage est utilisé pour obtenir une résolution <um 4 spatiale en résolvant serrées 2 paires pm de diamètre de billes. Les encarts montrent également des comparaisons objectives 40X microscope, qui conviennent très bien avec les images décodées fluorescentes. Ici d désigne la distance de centre à centre en images de microscopie, tandis que d _CS se réfère à des distances de centre à centre dans la CS décodé sans lentille images fluorescentes.

Figure 7. Imagerie sans lentille de fluorescence (SYTO 16) étiquetés globules blancs est illustré. Les images brutes sont rapidement décodé lensfree l'aide d'un décodeur CS base, ce qui s'accorde très bien avec une image au microscope conventionnel du même échantillon qui est acquis avec un objectif 10X.

Figure 8. Une coutume conçu une interface automatisée fluorescentes décompte d'objets (dans MATLAB) est illustrée.

Discussion

Nous avons démontré une plate-forme sur puce microscopie fluorescente qui peut atteindre, par exemple, <4μm résolution spatiale plus, par exemple,> 0,6 à 8 cm ² champ de vue sans l'utilisation de tout les lentilles, mécanique à balayage ou à couche mince interférences filtres. Dans cette technique, avec l'utilisation d'une façade en fibre optique ou une bougie, l'émission de fluorescence à partir des objets est recueilli avec une 2D-éventail de câbles de fibre optique avant d'être livré à un capteur opto-électronique-array comme un capteur CCD / puce CMOS. Ces images acquises lensfree sont ensuite rapidement traitées pour produire <4μm résolution plus> 0,6 à 8 cm ² champ de vue à l'aide d'un échantillonnage à la compression / détection basée algorithme de décodage. Une telle plate-forme compacte et à large champ imagerie de fluorescence peut être très utile à haut débit cytométrie, rares recherche sur les cellules ainsi que pour les biopuces d'analyse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Charge-coupled device(CCD)	KODAK	KAF-8300
Charge-coupled device(CCD)	KODAK	KAF-11002
Charge-coupled device(CCD)	KODAK	KAF-39000
Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS)	Micron	MT9T031C12STCD
High power LED light source	Thorlabs Inc.	M455L2-C2
High power LED driver	Thorlabs Inc.	LEDD1B
Fiber coupled LED light source	Mightex	FCS-0625-000
Vacuum Pen	Edmund Scientific	NT57-636
2, 4, 10 μm Fluospheres	Invitrogen	F-8826, F-8859, F-8836
RBS lysis buffer 1X	eBioscience	00-4333
SYTO 16 labeling reagent	Invitrogen	S7578
Fiber-optic faceplate	Edmund Scientific	NT55-142
Fiber-optic taper	Edmund Scientific	NT55-134
Prisms	Edmund Scientific	NT47-626, NT45-403
Filters	Edmund Scientific	NT39-417
PDMS Elastomers	Dow Corning	Slygard 184