Summary
تقنية تشريح يوضح قلع العين الماوس لتثبيت الأنسجة لأداء phenotyping في شاشات عالية الإنتاجية.
Abstract
العين الماوس نموذجا هاما لدراسة وراثية للمرض العيون متعدية الإنسان. وقد لخص الأمراض المسببة للعمى في البشر، مثل التنكس البقعي، تنكس مبصرة، والساد، الزرق، والشبكية، واعتلال الشبكية السكري في الفئران المعدلة وراثيا، وقد تم إنشاؤها 1-5 الفئران المعدلة وراثيا ومعظم خروج المغلوب من قبل مختبرات لدراسة طب العيون الأمراض غير، ولكن حفظ الوراثية بين نظم الجهاز تشير إلى أن العديد من نفس الجينات قد تلعب أيضا دورا في تطوير العين والمرض. وبالتالي، فإن هذه الفئران تمثل موردا هاما لاكتشاف الجديد الوراثي، النمط الظاهري الارتباطات في العين. لأن تنتشر هذه الفئران في جميع أنحاء العالم، فإنه من الصعب الحصول على، والحفاظ على، والنمط الظاهري لهم بطريقة فعالة من حيث التكلفة الفعالة. وهكذا، وتقتصر معظم phenotyping العيون عالية الإنتاجية شاشات لبعض المواقع التي تتطلب في الموقع والخبرة لدراسة طب العيون في عيون الفئران الحية. 6-9 وثمة نهج بديل وضعتها مختبرنا هو وسيلة لاكتساب النائية الأنسجة التي يمكن استخدامها في عمليات المسح كبيرة أو صغيرة الحجم من العيون الماوس المعدلة وراثيا. إجراءات موحدة للفيديو المستندة إلى نقل المهارات الجراحية، تثبيت الأنسجة، والشحن تسمح لأي مختبر لجمع العيون كلها من الحيوانات متحولة وإرسالها لphenotyping الجزيئية والمورفولوجية. في هذه المقالة الفيديو، نقدم التقنيات لنقل كل من استأصل وغير المثبتة ونضح عيون الماوس الثابتة لتحاليل phenotyping البعيد.
Protocol
1. تشريح حادة: قلع العين الماوس في العينات غير المثبتة
- مزق الجفون لتحسين التعرض والوصول إلى العالم الخلفي (مقلة العين) عن سطح البحر.
- وضع forcep خلع الملابس منحني وراء العالم و(تحت) في المدار (محجر العين). وSharptip ماهاجان خلع الملابس forcep هو أداة مخصصة مع نصائح لجعل مدببة هذه الخطوة أسهل (انظر المواد والكواشف الجدول).
- إغلاق forcep وفهم النسيج الضام المدارية والعصب البصري وراء العالم مع الحرص على تجنب الضغط على العالم.
- سحب بلطف صعودا ونتف forcep مقلة العين من المدار. والخيط الأبيض مثل الأنسجة هو العصب البصري.
- وضع العين في برنامج تلفزيوني. باستخدام إبرة قياس 30-، وجعل ثقب واحد الجرح الخلفي على الفور إلى حوف من إدخال الإبرة 1-2 ملم في مقلة العين. هذا يسمح مثبتات، مثل غلوتارالدهيد، التي لا تستطيع إلا أن اختراق أنسجة العين، لمباشرة ENثالثا العين. قد خلق هذا الجرح ثقب لا يكون ضروريا إذا كان مثبت، مثل بارافورمالدهيد أو الكحول، قادر على نشرها إلى أنسجة العين من الفائدة.
- وضع العين على الفور في كامل لتثبيت مثبت الغمر.
2. تشريح حادة: قلع العين التثبيت الماوس نضح التالية
- استخدام المنحني COLIBRI forcep لعقد جفن بعيدا عن العالم.
- توجيه تشريح يستكوت منحني مقص بالتوازي مع العالم، في حين تهدف نحو الجزء الخلفي من المدار.
- قطع النسيج الضام الذي يحيط الثابتة في العالم السفلي من والجوانب وسطي متفوقة، والجانبية.
- وضع forcep المنحنية وراء العالم، فهم النسيج الضام دون الضغط على الكرة الأرضية، وسحب إلى الأمام لاستأصل العين. منذ الأنسجة الضامة المدارية هي شديدة من تثبيت نضح، قد قطع إضافية من الأنسجة المدارية يكون من الضروري لاطلاق سراح تماما غلوبه.
3. تثبيت والتغليف
يجب شحن الأنسجة الثابتة اتبع الاحتياجات الخاصة بك خدمة البريد بما في ذلك المؤسسات والتسميات المناسبة والتعبئة والتغليف. البروتوكول التالي هو مثال لشحن عينة غير المعدية البيولوجية عند درجة حرارة الغرفة. هذا يتطلب 3 طبقات من التعبئة والتغليف ولكن لا فئة A مادة / B البيولوجية أو تسميات النيتروجين السائل.
- وضع العين إلى قارورة زجاجية التلألؤ مل 5-3-مع مثبت مل على الأقل، أو المخزن المؤقت بعد التثبيت إذا مثبت قصيرة. اكتب رقم تعقب على غطاء القارورة وختم مع Parafilm.
- وافق قارورة التلألؤ مكان في عينة بيولوجية حاوية شحن. في معهدنا، على سبيل المثال، تتطلب حاويات وافق ثلاث طبقات: وعاء مختوم التي يتم وضع العينة، طبقة ماصة الأوسط، وطبقة واقية الخارجي.
- وضع الحاوية في حزمة فقاعة التفاف ثم إلى التطبيقثبتت فعاليتها حاوية شحن المختبر جنبا إلى جنب مع الوثائق المناسبة.
4. ممثل النتائج
لا يمكن أن يؤديها من الفحص النسيجي العينين عن طريق مجموعة متنوعة من الأساليب بما في ذلك hematoxylin و تلطيخ يوزين، الأنزيمية الكشف التعبير، ونقل المجهر الإلكتروني، والمناعية. بعد تثبيت الانغماس في بارافورمالدهيد 4٪، وجزءا لا يتجزأ من النسيج في البارافين ومقطوع على مشراح. في الإنتاجية العالية phenotyping، نحن نحلل أقسام العصب البصري التلاميذ إلى أن عينة جميع أنواع الأنسجة في العين (الشكل 1). كما تم فحص أجزاء من الأنسجة للتعبير lacZ (الشكل 2)، ونقل المجهر الإلكتروني من العضيات الخلوية (الشكل 3)، والتعبير عن جزيئات محددة مع الأجسام المضادة (الشكل 4).
لدينا في النمط الظاهري طريقة الفرز، لم يكن من المهم الحفاظ على التوجه للعين فيما يتعلق الأنف (الموق الإنسي) والزمنية (lateraل لحاظ) الجانبين. هناك على الأقل خياران إذا التوجه العين أمر ضروري. بعد استئصال، وقد طبقنا الكي الضوء على القرنية الزمنية في موقف الساعة الثلاثة مع جهاز الكي المحمولة. الآفة واضحة على الأنسجة و لا تضيع أثناء معالجة مثل الأحبار النسيجية. الجانب السلبي هو أن الأضرار الكي القرنية، والذي قد يكون الحرجة في الأنسجة للفحص. الخيار الآخر يتطلب التشريح الماهرة التي يمكن التعرف على العضلات خارج المقلة الإدراج. تحت stereomicroscope، وتحديد الإدراج العضلة المائلة السفلية ومتفوقة يمثل الجانب السفلي ومتفوقة والعالم. 3 مع أي من الطريقتين اتجاه، من المهم أن تتبع عينة كما عين اليمين أو اليسار. معا، وهذا سوف يسمح الدقيق اتجاه العالم قبل تقطيع.
الشكل 1. صور العين الماوس النسيجي بعد عملية الشراء؟ ومنزوعة النواة R عن بعد الاستحواذ. عيون الماوس عن طريق تشريح حاد بعد تثبيت نضح مع بارافورمالدهيد 4٪. A. التلميذ البصرية قسم الأعصاب ملطخة hematoxylin و eosin يظهر الحفاظ على جميع الأساسات الأنسجة. ON، العصب البصري. (الأخضر شريط النطاق = 500 ميكرون) B. A مشاهدة أعلى التكبير من شبكية العين العادية يظهر هيكلها الصفحي: RGC، وخلايا الشبكية العقدة؛ IPL، طبقة ضفيري الداخلية؛، INL طبقة داخلية النووية؛ OPL، طبقة ضفيري الخارجي؛ قل، الخارجي طبقة النووي (مبصرة الخلية) (السهم)، ويتم، وقطاعات الداخلية مبصرة (رأس السهم)؛ OS، شرائح مبصرة الخارجي؛ RPE، ظهارة الصباغ الشبكية؛ C، المشيمية. (الأخضر شريط النطاق = 50 ميكرون) C. وبالمقارنة مع شبكية العين العادية، هذه العينة هو أرق بسبب تنكس مبصرة. وقل، هو، وغائبة تماما OS (السهم). (الأخضر شريط النطاق = 50 ميكرون)
"بديل =" الشكل 2 "/>
ومنزوعة النواة التعبير lacZ الرقم 2. في الفئران المعدلة وراثيا. العيون من قبل تشريح حادة ومنغمسين في 1 حل X-غال ملغ / مل (5 ملي K3Fe (CN) 6، 5 ملي K4Fe (CN) 6، 2 مم MgCl2، 0.02٪ NP40 وdeoxycholate الصوديوم 0.1٪) بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. كانت ثابتة في عيون 2٪ غلوتارالدهيد formaldehyde/0.2٪ لمدة 30 دقيقة ومقطوع على مشراح. X-غال المنتج (أزرق) التسميات: A. ظهارة الهدبية، B. ظهارة القرنية، وC. الخلية الشبكية العقدة (RGC) في طبقة الشبكية. INL، طبقة النووي الداخلية؛، قل الخارجي طبقة النووي.
الشكل 3. انتقال الإلكترون المجهري للظهارة الصباغ الشبكية (RPE). بعد تشريح حادة وخلق ثقب الجرح، العيون كانت ثابتة في امتصاص العرق غمر 2.5٪ / 2.5٪ في غلوتارالدهيد الصوديوم 0.1M العازلة الفوسفات. وكانت الشركة السعودية العينينdarily ثابتة في textroxide الأزميوم 1٪، المجففة تدريجيا، وجزءا لا يتجزأ من الراتنج Spurr ل. كان مقطوع في الأنسجة 90 نانومتر وضعت على شبكات النحاس فتحة مغطاة في Formvar وتصويرها باستخدام مجهر الإلكتروني النافذ. صورة مجهرية للمعارض، وقطاعات مبصرة الخارجي للشبكية العصبي الحسي، الأجسام الصباغية (M) داخل الظهارة الصبغية الشبكية، وغشاء بروك.
الشكل 4. ومنزوعة النواة من وضع العلامات المناعى الفائق 3-ديسموتاز (الأخضر) في الجسم الزجاجي الماوس. العينين عن طريق تشريح حادة وخضع لتثبيت الانغماس في بارافورمالدهيد 4٪. كانت جزءا لا يتجزأ أنها في البارافين ومقطوع باستخدام مشراح. وحضنت أقسام الأنسجة مع SOD3 الأرنب مصل ضدي بولكلونل المخفف 1:50. تم الكشف عن SOD3 التعبير باستخدام الماعز المضادة للأرنب مفتش (H + L)-اليكسا فلور 488 الأجسام المضادة الثانوية مترافق. ويظهر وسم SOD3 في اليونانEN.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الفئران المعدلة وراثيا أكثر توجد في المختبرات التي لا تفحص العينين. أسلوبنا الفيديو يوضح بسيطة، طريقة موحدة لنقل المهارات الجراحية عن بعد لتحسين اكتساب الأنسجة من المختبرات مع خبرة قليلة مع العينين. هذه التقنية تساعد في التغلب على الفيديو شرك كبير في الإنتاجية العالية phenotyping، والذي هو استخدام عدد محدود من المواقع الخبير بسبب أساليب غير موحدة جمع الأنسجة والتي تمنع تثبيت مغزى المقارنة الدراسات المظهري والجزيئي. لإنشاء وصيانة مختبر مراقبة الجودة مع أي النائية وفني جديد، من المهم أن تشمل البرية من نوع العيون في بداية وبشكل دوري طوال فترة الدراسة. كما وجدنا أن نظام تتبع المهم عندما تم نقل العينين متعددة من التراكيب الوراثية متعددة، مثل نظام على الإنترنت لتخصيص رقم تعريف فريد لكل عين. على الرغم من أن الحصول على أعلى جودة وتثبيت الأنسجة أقسام لاحقة معنضح الثابتة الحيوانات، نجد أن عينات من الحيوانات منزوعة النواة غير المثبتة كافية لمعظم الدراسات المورفولوجية والجزيئية. وعلاوة على ذلك، قد الحصول على عيون من الحيوانات غير المثبت يكون أسهل بكثير لمعالجة عالية الإنتاجية في الدراسات من مصادر مختلفة. الفئران المعدلة وراثيا هي أداة هامة للتحقيق في مرض الإنسان العيني و 10 و 11 والمناطق النائية الأنسجة لاكتساب phenotyping المحلية يجعل معظم هذا المورد الثمين. قد تطبيق استراتيجية مماثلة لتشريح الأنسجة وتقاسم يكون لها تأثير هام على الإنتاجية العالية phenotyping من غير العيون الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
البحث للوقاية من العمى؛ Bartly J. Mondino MD، مدير معهد جول شتاين العين، UCLA، وراميرو راميريز سوليس، جاكي الأبيض، وجين Estabel في معهد سانجر، ويلكوم ترست الجينوم الحرم الجامعي. هذا البحث يتفق مع بيان أرفو لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث البصرية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Dressing Forcep | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| Mahajan Sharptip dressing forcep | Storz Ophthalmics | E1406 (REF SP7-64520) | |
| Curved Westcott Scissors | Storz Ophthalmics | E3321 WH | |
| 15° BD Beaver Microsurgical Blade | BD Biosciences | 374881 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| 30-gauge needle | BD Biosciences | 305128 | |
| Biohazard Mailer | Fisher Scientific | 03-523-4 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Glass scintillation vials | Wheaton | 4500413033 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 2.5% Paraformaldehyde/ 2.5% Glutaraldehyde in 0.1M sodium phosphate buffer | Electron Microscopy Sciences | 15700 & 16300 | Mixed in laboratory |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16300 | |
| 0.25% Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15810 | |
| Copper Slot Grid | Electron Microscopy Sciences | M2010-CR | |
| 4% Osmium Tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19140 | |
| Anti-SOD3 antibody | Abcam | Ab21974 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Spurr’s embedding resin | Electron Microscopy Sciences | 14300 |
References
- Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).
- Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. Cold Spring Harbor Laboratories, Mouse Genetics Meeting. , (2010).
- Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. In Research Methods For Mutant Mice. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2002).
- Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42, 517-525 (2002).
- Anderson, M. G., Smith, R. S., Hawes, N. L., Zabaleta, A., Chang, B., Wiggs, J. L., John, S. W. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30, 81-85 (2002).
- Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes. Mol. Vis. 5, 22-22 (1999).
- Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. Mouse model resources for vision research. J. Ophthalmol. 2011, 391384-391384 (2011).
- Pinto, L. H., Vitaterna, M. H., Siepka, S. M., Shimomura, K., Lumayag, S., Baker, M., Fenner, D., Mullins, R. F., Sheffield, V. C., Stone, E. M., Heffron, E., Takahashi, J. S. Results from screening over 9000 mutation-bearing mice for defects in the electroretinogram and appearance of the fundus. Vision. Res. 44, 3335-3345 (2004).
- Heckenlively, J. R., Winston, J. V., Roderick, T. H. Screening for mouse retinal degenerations. I. Correlation of indirect ophthalmoscopy, electroretinograms, and histology. Doc. Ophthalmol. 71, 229-239 (1989).
- Tsang, S. H., Gouras, P., Yamashita, C. K., Kjeldbye, H., Fisher, J., Farber, D. B., Goff, S. P. Retinal degeneration in mice lacking the gamma subunit of the rod cGMP phosphodiesterase. Science. 272, 1026-1029 (1996).
- Tsang, S. H., Woodruff, M. L., Jun, L., Mahajan, V., Yamashita, C. K., Pedersen, R., Lin, C. S., Goff, S. P., Rosenberg, T., Larsen, M., Farber, D. B., Nusinowitz, S. Transgenic mice carrying the H258N mutation in the gene encoding the beta-subunit of phosphodiesterase-6 (PDE6B) provide a model for human congenital stationary night blindness. Hum. Mutat. 28, 243-254 (2007).
