Summary
Este é um método para visualizar a adesão de leucócitos ao endotélio em vasos pressurizados colhidas. A técnica permite estudar de adesão vascular sob fluxo de cisalhamento com diferentes pressões intraluminal até 200 mmHg, assim, imitam-ing as condições fisiopatológicos da pressão arterial elevada.
Abstract
Hipertensão, em todo o mundo é relatado para ser em aproximadamente um quarto da população e é o principal fator de risco para mortalidade no mundo biomédico. Na vasculatura hipertensão está associada com disfunção endotelial e aumento da inflamação levando à aterosclerose e várias doenças, tais como doença renal crônica 2, 3 derrame e insuficiência cardíaca 4. Um passo inicial na inflamação vascular levando a aterogênese é a cascata de adesão que envolve o rolamento, tethering, a adesão ea transmigração de leucócitos subseqüentes através do endotélio. Recrutamento e acúmulo de leucócitos ao endotélio é mediada por uma regulação alta de moléculas de adesão, como a molécula de adesão celular vascular-1 (VCAM-1), molécula de adesão celular intracelular-1 (ICAM-1) e E-selectina, bem como aumentos nos citocinas e quimiocinas libertação e uma regulação alta de espécies reativas de oxigênio 5. Os métodos in vitro, tais como testes de aderência estática ajudar a determinar os mecanismos envolvidos na adesão célula a célula, bem como a análise de moléculas de adesão celular. Métodos utilizados nos anteriores estudos in vitro demonstraram que aumentos agudos de pressão sobre o endotélio pode levar a adesão de monócitos, um upregulation de moléculas de adesão e de marcadores inflamatórios 6 no entanto, semelhante a muitos ensaios in vitro, esses achados não foram realizados em tempo real sob condições de fluxo fisiológico, nem com sangue total. Portanto, em ensaios in vivo são cada vez mais utilizados em modelos animais para demonstrar inflamação vascular eo desenvolvimento de placa. Microscopia intravital é agora amplamente utilizados para avaliar a adesão de leucócitos, migração, rolamento e transmigração 7-9. Ao combinar os efeitos da pressão sobre os leucócitos para a adesão endotelial estudos in vivo são menos extensas. Um desses estudos examina os efeitos em tempo real do fluxo e cisalhamento sobre o crescimento arterial e marcadores inflamatórios remodelação, mas só foram avaliados através de imuno-histoquímica 10. Aqui apresentamos um modelo para a gravação de adesão leucocitária em tempo real no intacta vasos sanguíneos sob pressão de perfusão utilizando sangue total. A metodologia é uma modificação de um navio vivo ex-modelo de perfusão câmara 9, que permite a análise em tempo real das interações leucócito-endotélio adesivo em vasos intactos. Nossa modificação permite a manipulação da pressão intraluminal até 200 mmHg permitindo estudo não somente sob condições de fluxo fisiológico, mas também condições de pressão. Enquanto os sistemas Miografia pressão tenham sido previamente demonstrado para observar parede do vaso e do lúmen diâmetro 11, bem como a contração este vaso é a primeira vez demonstrando interações leucócito-endotélio em tempo real. Aqui nós demonstrar a técnica usando artérias carótidas de ratos colhidos e canulada a uma câmara de fluxo custom-made acoplado a um microscópio de fluorescência. A câmara de embarcação está equipada com uma lamela grande fundo permitindo uma lente objetiva de grande diâmetro, com distância de trabalho de curto para a imagem do navio. Além disso, agonista selecionados e / ou antagonistas podem ser utilizados para investigar os mecanismos que controlam a adesão celular. Vantagens deste método sobre microscopia intravital não incluem o envolvimento de cirurgia invasiva e, portanto, um maior rendimento pode ser obtido. Este método também permite o uso de tratamento inibidor localizada ao navio desejado enquanto intravital só permite o tratamento sistêmico inibidor.
Protocol
1. Isolando artérias carótidas
- Euthanase10 semana de idade ratos Sprague Dawley através de CO 2 / O 2 asfixia.
- Excise esquerda e direita artérias carótidas comuns com aorta e coração assegurar alongamento mínimo dos vasos.
- No gelo tampão Krebs frio separado das artérias carótidas e da aorta do coração e realizar dissecção perto.
- Manter os vasos isolados em Krebs no gelo antes da montagem.
Aprox. tempo = 45 minutos
2. Escorva da câmara de navios
- Nos conectores proximal e distal da câmara de descarga de navios tampão Krebs mantida em pH fisiológico, infundindo carbogênio de gás (95% O 2, 5% CO 2) através do tampão a 37 ° C.
- Garantir tubos e cânulas são liberadas completamente e estão alinhados.
- Lave tampão Krebs através do P1 (proximal) e (distal) P2 transdutores. Torneiras a fim de garantir que nenhuma bolha de ar no transdutores.
- Conecte os transdutores para os conectores correspondentes e, novamente, lave mais tampão Krebs garantindo que não haja bolhas de ar. Fechar as torneiras para a câmara.
Aprox. tempo = 15 minutos
3. Pressurização da câmara de navios
- Ligue equipamentos sob pressão: servo de pressão, monitor de pressão, bomba peristáltica (Figura 1).
- Com a bomba peristáltica sobre a pressão ea pressão sobre servo automática tampão Krebs executado através do tubo de 20 mmHg (dial em 1), garantindo que não haja bolhas de ar.
- Conecte a tubulação para o transdutor P2 fechado. Pressão vai se tornar estável.
- Abrir torneira P2 para a câmara de navio para expulsar as bolhas, em seguida, fechar.
- Encha a banheira com Krebs buffer (5-7 mL).
Aprox. tempo = 10 minutos
4. A montagem do navio
- Sob um microscópio de dissecação lugar laços de poliéster preto em cada cânula (Figura 2).
- Mova cânulas e detentores cânula além e montar ¼ navio (aórtica final arco) para a cânula P1. Garantir para não rasgar o navio.
- Usando uma seringa cheia de Krebs tampão suavemente lavar o excesso de sangue para fora da embarcação através de transdutor P1. Fechar P1 para a câmara.
- Navio seguro para a cânula P1 com o empate de poliéster.
- Mova cânulas / titulares cânula mais perto para montagem sobre a cânula P2.
- Monte extremidade distal do vaso (~ ¼ do comprimento) para cânula distal. Seguro com empate de poliéster.
Aprox. tempo = 20 minutos
5. Pressurizar o navio
- Ajustar os detentores cânula para garantir que não dobrar ou esticar no vaso.
- Com P1 e P2 fechado para a câmara de mudar o servo pressão de automático para manual. Verificar a pressão servo não há uma diminuição contínua da pressão dentro de 10 segundos. Se houver, um vazamento está ocorrendo e as conexões e transdutores devem ser assegurados no lugar.
- Ajustar o servo pressão de volta para P2 em seguida, abra automática para a câmara. Sob o microscópio observar o navio se dilatam quando a torneira é aberta para a câmara.
- Mudar o servo pressão para manual. Novamente verificar se há diminuição contínua da pressão dentro de 10 segundos. Se houver um vazamento, então o sistema não é a pressão apertado e não é provável que seja um furo na embarcação.
- Voltar para P1 aberto automática para a câmara. Na configuração manual verificar que a pressão se mantém estável.
- Se nenhum vazamento, na definição de discagem manual aumentar para 2 (40 mmHg).
- Ajuste automático para o navio e observar ao microscópio. Se necessário, ajuste o titular cânula para garantir que nenhum curva do vessel.Check de vazamentos sobre a configuração manual.
- Repita os passos 5,6-5,7 aumentar o discagem para 3 (60 mmHg), 4 (80 mmHg) e assim por diante até que a pressão desejada seja atingida.
Aprox. tempo = 15 - 30 mins
6. Incubando a recipiente pressurizado
- Conecte o conjunto controlador de temperatura para 37 ° C.
- Com uma segunda bomba peristáltica perfundir Krebs buffer (1 mL / min) para o banho de câmara de navio.
- Conectar aspirador de câmara garantindo apenas a camada superior do banho é removido.
- Incubar recipiente pressurizado a 37 ° C por 1 hora com a pressão definido como automático.
- Verifique a pressão não está vazando (mudar para o manual) periodicamente.
- Os efeitos de várias intervenções farmacológicas podem ser observados com a simples adição do composto para o banho durante a incubação.
Aprox. time = 1 hora
7. Irrigando o recipiente pressurizado com sangue total
- Durante a incubação obter pelo menos 7,5 mL de sangue humano inteiro / navio coletados em 40 heparina U / mL de sangue. Incubar em uma falcon 50 ml a 37 ° C.
- 10 minutos antes do final de tele sangue de incubação etiqueta com VybrantDil (1:1000) por 10 minutos a 37 ° C no escuro.
- Após 10 minutos, coleta de sangue em uma seringa clearing as bolhas e anexar em uma bomba de seringa com um casaco de calor a 37 ° C.
- Fechar transdutor P1 para a câmara / navio e conectar seringas e tubos de resíduos.
- Sangue purgar a 1000 mL / min através do tubo de resíduos para remover todas as bolhas.
- P1 aberto para a câmara. O servo de pressão ajusta automaticamente para manter a pressão desejada.
- Perfundir de sangue a 100 mL / min.
- Usando um microscópio de fluorescência acoplado a uma câmera digital gravar dois campos do navio perfundidos por 15 segundos a 1, 3, 5, 7,5 e 10 minutos.
- Integridade pós-perfusão ea função endotelial pode ser avaliada através de técnicas farmacológicas, como myograph e expressão de moléculas de adesão pode ser determinado por imunohistoquímica para validar ainda mais a resposta inflamatória.
Aprox. tempo = 15 minutos
8. Resultados representativos:
Um diagrama esquemático da instalação de câmara de pressão é mostrado na Figura 1. Com uma câmera digital acoplada a um microscópio de fluorescência resultados podem ser visualizados instantaneamente por meio de gravações de vídeo ao vivo. Imagens de vídeo representativas são vistos na Figura 3, onde os leucócitos são considerados aderentes ao endotélio se manteve parado por 10 segundos. Com gravações de vídeo em loop contínuo células aderidas pode ser contado como um campo médio por. Embora ambos baixa (Figura 3A) e alta pressão (Figura 3B) fará com que uma certa quantidade de aderência um aumento significativo na adesão de leucócitos na maior pressão intraluminal é visto e isso também é demonstrada quantitativamente (Figura 4).
Figura 1. Pressurizada vivo ex esquemática câmara navio. Um navio canulados conectado a um transdutor (P1) proximal e um distal (P2) que permite que os transdutores de pressão arterial a ser manipulado dentro do vaso. Perfusão é através do transdutor de pressão P1 e é mantida por meio de transdutor de P2.
Figura 2. Cannuala com laços. Laços de poliéster preto são anexados a cada cânula.
Figura 3. Imagens de vídeo representativas. Adesão celular dinâmico (seta vermelha), sob a fluorescência a 80 mmHg (A) e 120 mmHg (B) após 10 minutos de perfusão.
Figura 4. Adesão de leucócitos em ratos Sprague Dawley das artérias carótidas após 1 hora de incubação em baixa (80 mmHg) e de alta pressão (120 mmHg). *** P <0,001, como analisado por 2-way ANOVA medidas repetidas com teste post hoc de Bonferroni.
Discussion
Este é um método modificado para estudar a adesão de leucócitos ao endotélio intacto em vasos sanguíneos isolados, em condições pressurizadas em tempo real. Perfusão da câmara de navio só permite uma validação rápida de pró-inflamatórias linhagens de camundongos e grandes vasos de ratos. Manipulação de pressão permitindo que permite interações célula dinâmica a ser observado a partir de baixo a muito altas pressões intraluminais, assim, melhor imitar-ing fisiológicos e condições fisiopatológicas. Diâmetro dos vasos também pode ser medida usando um programa de imagens de células-suficiente e, portanto, o fluxo de cisalhamento e velocidade pode ser determinada e, portanto, manipulados.
Com as suas capacidades de myograph, intervenções farmacológicas colocado no banho acrescentar uma outra dimensão para as condições experimentais possível com esse modelo permite estudos de vias mecanicista e sinalização. Enquanto preservação endotelial não pode ser confirmado durante a manipulação de pressão, as respostas a ACh e PE podem ser conduzidas de perfusão pós 9.
Deve-se notar que essa configuração demonstra os efeitos da pressão intraluminal em célula a célula não interações dos efeitos do fluxo sangüíneo pulsátil nem sistólica ou diastólica. Além disso, enquanto as alterações de pressão aguda sobre a adesão de leucócitos foram observados, esta configuração pode ser também utilizada para analisar os efeitos da pressão crônica (ou seja, aumentando os tempos de incubação e utilizando um modelo animal crônica de pressão). Sprague Dawley artérias carótidas comuns são demonstradas neste conjunto para cima, mas outras linhagens e espécies podem ser usadas com ajustes apropriados para o tamanho da cânula. De fato, é importante notar que a idade eo peso dos animais afetam o tamanho do navio e, portanto, que a criação precisa ser individualizado para cada navio. Dissecção próxima e cuidadosa do tecido conjuntivo pode melhorar a visualização de leucócitos imensamente.
Disclosures
O protocolo do estudo foi aprovado pelo Medical Research e Alfred Delegacia Educação animais Comitê de Ética e da Comissão de Ética Alfred Hospital.
Acknowledgments
Este estudo foi financiado em parte pelo Programa do Governo vitoriana do OIS, o National Health and Medical Research Council de bolsas da Austrália de programas e projetos (JPF Chin-Dusting) e bolsa de pós-graduação (D Michell).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Carl Zeiss, Inc. | SteREO Discovery V.20 | |
| PHD 2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2016 | |
| Digital Camera and Controller | Hamamatsu Corp. | C4742-95 | |
| Fluorescence Illumination System | Lumen Dynamics | X-Cite 120 | |
| Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH/1/SH | |
| Pressure Servo Controller and Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS - 200 | |
| Perfusion Pressure Monitor | Living Systems Instrumentation | PM - 4 | |
| 2 x Pressure Transducer | Living Systems Instrumentation | PT - F | |
| Temperature Controller | Living Systems Instrumentation | TC-01 | |
| Peristaltic Pump | Instech Laboratories, Inc | P720 | |
| VybrantDil cell-labelling solution | Invitrogen | V-22885 | Use 1:1000 |
References
- Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. Global and regional burden of disease and risk factors. Lancet. 367, 1747-1757 (2001).
- Szczech, L. A. Acute kidney injury and cardiovascular outcomes in acute severe hypertension. Circulation. 121, 2183-2191 Forthcoming.
- Rodriguez-Garcia, J. L., Botia, E., de La Sierra, A., Villanueva, M. A., Gonzalez-Spinola, J. Significance of elevated blood pressure and its management on the short-term outcome of patients with acute ischemic stroke. Am J Hypertens. 18, 379-384 (2005).
- Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. The progression from hypertension to congestive heart failure. JAMA. 275, 1557-1562 (1996).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Riou, S. High pressure promotes monocyte adhesion to the vascular wall. Circ Res. 100, 1226-1233 (2007).
- Ley, K., Gaehtgens, P. Endothelial, not hemodynamic, differences are responsible for preferential leukocyte rolling in rat mesenteric venules. Circ Res. 69, 1034-1041 (1991).
- Bernhagen, J. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment. Nat Med. 13, 587-596 (2007).
- Woollard, K. J. Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation. Circ Res. 103, 1128-1138 (2008).
- Eberth, J. F. Importance of pulsatility in hypertensive carotid artery growth and remodeling. J Hypertens. 27, 2010-2021 (2009).
- Cooke, J. P., Rossitch, E., Andon, N. A., Loscalzo, J., Dzau, V. J. Flow activates an endothelial potassium channel to release an endogenous nitrovasodilator. J Clin Invest. 88, 1663-1671 (1991).
