Summary
وقد أصبح البروتين تصور عينات بواسطة المجهر الإلكتروني السلبية وصمة عار (EM) شعبية طريقة التحليل البنيوي. ومن المفيد للتحليل الكمي الهيكلية ، مثل احتساب إعادة الإعمار 3D من الجزيئات التي تجري دراستها ، وكذلك لفحص النوعية نوعية التحضيرات البروتين. في هذه المقالة نقدم بروتوكولات تفصيلية لإعداد شبكات EM ، تلوين العينة وتصور العينة في المجهر الالكتروني. يمكن للمستخدمين المبتدئين اتبع بروتوكولات بسهولة وصمة عار على الاستفادة السلبية EM باعتباره فحص روتيني ، بالإضافة إلى فحوصات الكيمياء الحيوية الأخرى ، لتقييم عينات من البروتين.
Abstract
أصبحت واحدة المجهر الإلكتروني الجسيمات (EM) ، على حد سواء سلبية أو المجمدة ملطخة العينات البيولوجية المائية ، وهو أداة متعددة الاستعمالات في مجال البيولوجيا البنيوية 1. في السنوات الأخيرة ، وحقق هذا الأسلوب نجاحا كبيرا في دراسة هياكل من البروتينات والجزيئات المجمعات 2 ، 3. مقارنة مع الإلكترون cryomicroscopy (cryoEM) ، التي هي جزء لا يتجزأ في العينات المجمدة البروتين المائية في طبقة رقيقة من الجليد الزجاجي 4 ، تلطيخ السلبية هو إعداد نموذج أبسط الطريقة التي هي جزء لا يتجزأ من البروتين في عينات من طبقة رقيقة من الملح المجفف لزيادة المعادن الثقيلة تباين العينة 5. في المقابل تعزيز صمة سلبية EM يسمح فحص العينات البيولوجية الصغيرة نسبيا. بالإضافة إلى تحديد ثلاثية الأبعاد (3D) بنية تنقية البروتينات أو المجمعات 6 البروتين ، ويمكن استخدام هذه الطريقة لأغراض أوسع من ذلك بكثير. على سبيل المثال ، وصمة عار سلبية يمكن استخدامها بسهولة EM لتصور المنقىعينات من البروتين ، والحصول على معلومات مثل التجانس / تجانس العينة ، وتشكيل المجمعات البروتين أو التجمعات الكبيرة ، أو ببساطة لتقييم جودة إعداد البروتين.
في هذه المقالة الفيديو ، نقدم بروتوكول كامل لاستخدام EM لمراقبة ملطخة سلبا على عينة من البروتين ، من إعداد شبكات الكربون المغلفة وصمة عار على EM السلبية لاكتساب صورة لنموذج ملون سلبا في مجهر الكتروني يعمل على تسريع 120kV الجهد. وقد استخدمت هذه البروتوكولات في مختبرنا عادة ويمكن اتباعها بسهولة من قبل المستخدمين المبتدئين.
Protocol
1. إعداد EM شبكات لطلاء الكربون
- ملء كوب زجاجي كبير مع الماء المقطر.
- استخدام ماصة الزجاج لإسقاط قطرة واحدة من الكولوديون (~ 20μl ، 2 ٪ في خلات الأميل والعلوم المجهر الإلكتروني ، والسلطة الفلسطينية ، الولايات المتحدة) على سطح الماء. وسوف تنتشر الكولوديون لتشكيل طبقة رقيقة من البلاستيك إلى الماء / سطح الهواء ؛ ملاحظة : يمكن استخدام قطرة الأول من الكولوديون لمسح سطح المياه من أي جزيئات الغبار. بعد إزالة من الفيلم من أول قطرة ، والمياه السطحية واضحة من الغبار.
- مكان EM الشبكات ، 400 أو 200 غيلدر شبكات سلكية النحاس التي تم شراؤها من شركة تيد بيلا (الولايات المتحدة) ، واحدة تلو الأخرى على طبقة من البلاستيك الطافية على سطح المياه ، ونحن نضع عادة 50 ~ 100 الشبكات في نمط التعبئة وثيق مع لامعة جانب من أسفل الشبكة في طبقة من البلاستيك (الشكل 1A). ملاحظة : شبكات سلكية 400 جيدة لشبكات EM الروتينية السلبية وصمة عار ، في حين شبكات سلكية 200 هي جيدة لجمع الصور الزوج الميل.
- قطع الكعكةم من ورقة ذات أبعاد أكبر قليلا من المنطقة التي يتم وضعها على شبكات طبقة من البلاستيك. وضع ورقة بعناية على أعلى من الشبكة (الشكل 1B) ، وانتظر حتى تصبح ورقة مبللة بالكامل (الشكل 1C). ملاحظة : هناك أنواع مختلفة من الورق ومعدلات مختلفة لامتصاص المياه. من المهم أن الورقة لا تمتص الماء بسرعة كبيرة جدا. على سبيل المثال ، ورقة التصفية العادية ليست جيدة لهذا الغرض لأنها تمتص الماء بسرعة كبيرة ، ويجعل الكثير من التجاعيد. الفيلم الكربون مصنوعة من الورق المتجعد ليست مسطحة ، وبالتالي ليست جيدة لجمع الصور الزوج الميل لإعادة الإعمار العشوائية المخروطية الميل 3D. على المرء أن أوراق اختبار مختلفة للعثور على واحدة مناسبة. في مختبرنا ، كنا باستخدام أوراق من دفاتر الملاحظات التي تم شراؤها من محل بقالة المحلية. وعثر أيضا في بعض الأحيان ورقة صحيفة لتكون مناسبة. خيار آخر هو استخدام ورق الأرز سميكة النسبية المستخدمة للخط الصينية / اليابانية.
- جعل الشقوق بسرعة على الفيلم حول البلاستيك وعلى مقربة منورقة غارقة. بعد ذلك مباشرة ، واستخدام زوج من ملقط لالتقاط ورقة مع شبكات تقع بين الفيلم من البلاستيك والورق. وضع ورقة في طبق بتري مع شبكات مواجهة لتجفيف الهواء (الشكل 1D) ؛ ملاحظة : من المهم السماح للورق الهواء الجاف. تجفيف سريع جدا يولد الكثير من التجاعيد في ورقة.
2. شبكات الكربون طلاء
- الجهاز الكربون المستخدمة في طلاء مختبرنا هو 208C Cressington فراغ توربو السامية الكربون المغطي (تيد بيلا). وقد تم تجهيز نظامنا بسماكة Cressington رصد الفيلم ، والذي يقيس سمك الفيلم الكربون المغلفة على أساس المبدأ القائل بأن يتم تغيير التردد تتأرجح من بلورة الكوارتز التي الشامل لفيلم المودعة على سطحه. ومع ذلك ، وصفت بروتوكول هنا لا يحتاج الى رصد سمك ، لأنه غالبا ما تكون غير متوفرة في كل مختبر.
- يشحذ قضيب الكربون باستخدام مبراة (تيد بيلا) وقضبان الكربون الكربون في تحميل طلاء مترachine (الشكل 2A). وضعت اثنين من قضبان ، واحدة مع طرف حاد والآخر مع نهاية شقة ضد بعضها البعض.
- تطبيق الشحوم فراغ على نصف المساحة متجمد من شريحة زجاجية ووضعه بجوار شبكات (الشكل 2B). وينبغي أن لا تغطي سوى نصف المساحة بلوري الشريحة الزجاجية مع الشحوم فراغ. ملاحظة : المنطقة مع الشحوم فراغ لن تغير لون الطلاء بعد الكربون. التباين بين المناطق المتاخمة لها مع وبدون الشحوم فراغ يوفر تقدير سمك الكربون المغلفة.
- وضع ورقة مع الشبكات على الساحة من آلة طلاء الكربون. وضع شريحة زجاجية بجانب الشبكات (الشكل 2C). ملاحظة : يمكن للمرء أيضا شبكات النقل الأولى المغلفة مع فيلم البلاستيك لشريحة زجاجية قبل طلاء ، في حال العديد من شبكات تسقط من ورقة.
- ضخ فراغ الغرفة ، وانتظر حتى يصل إلى فراغ على مستوى من 10 عربة -5. ملاحظة : طلاء مع انخفاض فراغ يولد شرارات كثيرة في كثير من الأحيان ، مما أدى إلى العديد من جزيئات الكربون كبير علىالشبكة.
- زيادة الحالي ببطء شديد. سيقوم الطرف الحاد للقضيب الكربون بهذا يصبح أحمر وأبيض ثم كما يزيد الحالي. لا أشاهد غيض سطوع عالية مباشرة بالعين المجردة. وقف زيادة الحالي عندما يبدأ طلاء. سوف الشريحة الزجاجية تغيير لون من الأبيض إلى رمادي فاتح ثم الرمادي الداكن. الظلام من الشرائح يرتبط سمك الفيلم الكربون الذي يجري المغلفة. إيقاف تشغيل حاليا لوقف طلاء عندما أحرز سمك المطلوب (الشكل 2D). ملاحظة : 1) بعد تكرار عمليات طلاء الكربون والكربون المغلفة من الداخل من الزجاج جرة الجرس يمكن أن تلقي بظلالها الداكنة اللون. هذا ما يجعل الفيلم يبدو الكربون المغلفة سمكا مما هي عليه في الواقع. 2) ويمكن استخدام أحد قضيب الكربون شحذ لطلاء عدة. يتم خفض تدريجيا من حدة غيض بعد كل الطلاء. يتأثر الحد الأقصى الحالي من الحدة من قضيب الكربون. ألف قضيب شحذ طازجة مع أصغر قطرها يتطلب انخفاض نسبيالحالية لتتبخر الكربون. في وقت لاحق قد تتطلب طلاء أعلى قليلا الحالية.
- تنفيس للفراغ الغرفة ، وإزالة شبكات المغلفة لاستخدامها لاحقا.
ملاحظة 1. الأسلوب أكثر دقة للتحكم في سمك الكربون باستخدام جهاز سماكة الفيلم. أو يمكن للمرء أن معايرة اللون نوعيا ضد دقيقة تقاس سماكة الشاشة. وسمك الكربون مفيدة لهذا الأسلوب هو ما بين 3 و 7 نانومتر.
هذه هي طريقة بسيطة وسهلة لإعداد كمية كبيرة من شبكات الكربون المغلفة ، ~ 100 عادة في إعداد الشبكات. في شبكات تحتوي على طبقة رقيقة من البلاستيك ، والتي عادة لا يؤثر على جودة الصورة الملطخة سلبا. ومع ذلك ، وشبكات أعد في هذه الطريقة ليست مناسبة للcryoEM. ويمكن إزالة هذه الطبقة من البلاستيك التي تمرغ في شبكات الكلوروفورم لعدة ساعات.
3. إعداد اليورانيل الحل فورمات (0.75 ٪) عن السلبية وصمة عار EM. وكان بروتوكول مفصلةسبق وصفها 5
- تزن خارج 37.5mg من فورمات اليورانيل في دورق صغير ؛
- إضافة 5 مل من الماء المغلي ويحرك لمدة 5 دقائق في الظلام ؛
- إضافة 10μl 5M هيدروكسيد الصوديوم ، ما زالت تثير لمدة 5 دقائق ؛
- تصفية باستخدام عامل تصفية حل محقنة (Fisherbrand ، 13mm حقنة التصفية ، 0.2μm ، نايلون غير معقمة رقم الكتالوج ، 09-720-5) ، وتخزينها في حل تمت تصفيتها في انبوب فالكون 8ml مغطاة رقائق الألومنيوم ؛
ويمكن شراء مسحوق علما فورمات. ثاني اكسيد اليورانيوم من علوم المجهر الإلكتروني (هاتفيلد ، والسلطة الفلسطينية) ، ورقم 22451 التسويقي. الحل هو فورمات اليورانيل ضوء حساسة ويجب أن تبقى بعيدا عن الضوء المباشر ، على سبيل المثال من خلال تغطية أنبوب فالكون بورق الألمنيوم. حل الطازجة لها لون أصفر فاتح (الشكل 3A). يمكن أن تبقى وصمة عار حل على مقاعد البدلاء لمدة أسبوع أو أسبوعين قبل أن يبدأ عجل. فورمات اليورانيل حامضي مع الحموضة ~ 4. إضافة هيدروكسيد الصوديوم يزيد من الحموضة ، ولكن بسرعة كبيرة جدا مضيفا انهأو يمكن أن يتسبب في زيادة وصمة عار لترسيب. بالإضافة إلى توليد النقيض من ذلك ، فورمات اليورانيل أيضا بإصلاح عينة البروتين. لأن سعر التثبيت سريع جدا ، ودرجة الحموضة منخفضة عادة لا يؤثر على التشكل من البروتين الكلي أو تكوين البروتين معقدة 7.
4. بروتوكول لإعداد السلبية صمة EM الشبكة. وقد وصفت هذا البروتوكول بالتفصيل سابقا 5
- يتوهج شبكة تصريف الكربون المغلفة ، وذلك باستخدام نظام GlowDischarge easiGlow بيلكو (تيد بيلا ، وشركة الولايات المتحدة). والمستخدمة حاليا هي 15 مللي أمبير ، وشبكات تصريف وتوهج لمدة 30 ملاحظة ثانية ، وينبغي استخدام شبكات تصريف الوهج ، بعد وقت قصير من توهج التفريغ. نحن غالبا ما تستخدم الشبكات في أقل من 2 ساعة بعد التفريغ توهج.
- مكان 20μl قطرتين من الماء المقطر وقطرتين من محلول فورمات 25μl اليورانيل على قطعة من parafilm (الشكل 3B).
- عقد يتوهج تفريغها الشبكة باستخدام القوة العكسية المضادة للالشعرية ملقط مع السيارةبون المغلفة الجانب مواجهة. ملاحظة : من الضروري استخدام الألغام المضادة للملقط الشعرية. خلاف ذلك ، سيتم امتص عينة السائل بعيدا عن الشبكات من قبل القوة الشعرية بين ملقط.
- تطبيق نموذج 2μl البروتين إلى الشبكة ، يتوهج تصريفها ، والانتظار لمدة 30 ثانية. ملاحظة : وقت الانتظار وطول التفريغ توهج تأثير على تركيز البروتينات كثف في الشبكة. عينات مخففة للغاية تتطلب أوقات أطول الامتزاز. ومع ذلك ، قد تغير لفترات طويلة الامتزاز تركيز العازلة منذ بخار الماء. لتحقيق توزيع الجسيمات السليم في الشبكة يتطلب محاكمة بعض الشيء ، والنهج الخطأ.
- لطخة قبالة العينة باستخدام ورق الترشيح.
- تلمس سطح الشبكة الى انخفاض المياه وصمة عار ثم الخروج من الماء مع ورقة التصفية. كرر مع انخفاض 2 من الماء.
- تلمس سطح الشبكة لأول انخفاض لفترة وجيزة من وصمة عار. لطخة قبالة حل صمة مع ورقة التصفية.
- تلمس سطح الشبكة إلى تراجع الثاني من وصمة عار لمدة 20 ثانية. لطخة سوما يليها حل صمة مع ورقة التصفية.
- تجفيف الشبكة باستخدام فراغ. ملاحظة : يمكن للمرء أن يترك أيضا الشبكات على مقاعد البدلاء أو في غطاء محرك السيارة الكيميائية في الهواء الجاف. الاستفادة من فراغ الجافة هو أن المرء لا يستطيع مراقبة الشبكات في EM على الفور. هذا الأثر المحتمل تولدها تجفيف سريع غير متساو وصمة عار.
5. انتقال الإلكترون المجهر
- والاداة المستخدمة في هذه التظاهرة هو T12 Tecnai (الاتحاد الدولي للفروسية الشركة) مجهز بكاميرا غاتان س 4K CCD 4k.
- تحقق لفترة وجيزة في محاذاة المجهر قبل إدخال العينة ؛ ملاحظة : هناك حاجة إلى ذلك إلا مرة واحدة لكل EM الدورة. في المجهر النموذج ، يمكن حفظ قرب محاذاة الكمال في وقت سابق. يجب تحميل هذا الملف استعادة المحاذاة محاذاة المجهر إلى حالة تقترب من الكمال.
- تحميل الشبكة EM في واحدة مغطاة صاحب العينة القياسية.
- ادخال حامل في CompuStage من T12. انتظر دورة الضخ لإكمال.
- تضاف إلى صاحب العمود </ لى>
- تركيز العينة وتعيين يزيل التباؤر المطلوب ، عادة ، 1.5um. ملاحظة : التركيز لا يمكن أن يتحقق إما من خلال التركيز يدويا باستخدام الأسلوب النقيض من الحد الأدنى أو باستخدام كاميرا CCD لالتقاط الصور الحية ويعيش حساب طيف الطاقة فورييه.
- سجل صورة باستخدام كاميرا CCD ؛
- في صور لعينات سلبية البروتينات الملون ، وغالبا ما ينظر البروتينات مع النقيض الأبيض ، أي كثافة الأبيض ضد قتامة الخلفية. علما أنه في حين أن تركيزات البروتين في مناطق مختلفة من الشبكة نفسها وعادة ما تكون مماثلة تماما ، واحد لا مراقبة مستويات مختلفة من وصمة عار في مناطق مختلفة من الشبكة نفسها. أحيانا يمكن أن يكون تلوين المناطق غير المستوية أو حتى تلوين الإيجابية (بروتين يظهر الظلام على ضوء الخلفية) ، في حين أن بعض المناطق الأخرى والكمال وصمة عار. غالبا ما يكون ضروريا للبحث في الشبكة لتحديد منطقة جيدة للتصوير.
6. ممثل النتائج
أمثلة جيدة من الصور النمطية للستا سلباوتظهر عينات INED ، الحصان فيريتين الطحال الشكل (4A) ، فاب (الشكل 4B) ، 20S archaeal proteasome (الشكل 4C) والنيوكليوسومات (الشكل 4D).
الشكل 1. إعداد شبكات الكربون المغلفة وصمة عار لالسلبية EM ألف) EM وضع الشبكات واحدة تلو الأخرى في نمط التعبئة المغلقة على سطح الفيلم الكولوديون. ب) وضع قطعة من الورق أكبر قليلا من مساحة الشبكات. C) انتظر حتى يحصل على ورقة مبللة بالكامل. D) التقط ورقة مع شبكات لتجفيف الهواء.
الشكل 2. . طلاء شبكات EM مع الكربون أ) الإعداد المبخر الكربون : وضع قضبان الكربون اثنين في جهاز طلاء ، مع واحدة قضيب (على اليسار) لشحذ تلميح نقطة. قضيب الأخرى (على اليمين) وسطح مستو وتأتي في اتصال مع طرف نقطة واحدة في ليالي المعاكسIDE. ب) ضع كمية صغيرة من الشحوم فراغ في جانب واحد من شريحة زجاجية يعززها. المنطقة ضمن الإطار الأسود والشحوم فراغ. ج) الإعداد للشبكات الطلاء. تستخدم الشرائح الزجاجية لعقد الورق في الموقف. رأس السهم نقطة مع الشحوم في منطقة فراغ. D) بعد طلاء ، لون الشريحة مع الشحوم فراغ مغطى لا يتغير اللون. التناقض يدل على سمك الكربون المغلفة.
الشكل 3. يوضح الإجراء تلطيخ السلبية ألف) طازجة أعدت فورمات اليورانيل (يسار) حل شفاف دون علامة على رواسب. بعد أسابيع 1 2 ~ ، رواسب بدء تتراكم في الجزء السفلي في الجزء السفلي من الأنبوب. ب) ضع نقطتين (~ 25μl) من الماء المقطر ، وقطرتين من محلول فورمات اليورانيل في قطعة من parafilm. استخدام زوج من الألغام المضادة للالشعرية ملقط لعقد توهج شبكة تصريف EM الكربون المغلفة مع الجانب الكربونيصل. يتم وضع قطرة من العينة (~ 2μl) في الشبكة. C) وبعد انتظار لمدة 30 ثانية ، وصمة عار على حل مع ورقة التصفية. D) فليب الشبكة لتلمس الجانب عينة من الشبكة مع أول قطرة من الماء. كرر الخطوة C و D لإكمال عملية التلوين.
الشكل 4. أمثلة EM صور عينات البروتين ملطخة سلبا. الطحال ألف حصان) فيريتين ، B) جزء من الملزمة المستضد (فاب) ، C) 20S archaeal proteasome ودال) النيوكليوسومات. وسجلت كافة الصور مع التكبير نفسه. شريط المقياس 20nm.
Discussion
ملون سلبي EM هو أداة قوية التي يمكن استخدامها لدراسة هياكل 3D عينات البروتين المنقى ، مثل استخدام الميل المخروطية عشوائي 8 الأسلوب ، الأمر الذي يتطلب جمع زوج من الصور مع واحدة من العينة يميل إلى 60 درجة واحد من نفس المنطقة لكن untilted ، لحساب إعادة بناء المجمعات 3D الجزيئات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تلطيخ السلبية EM والعديد من التطبيقات الأخرى ، مثل الكشف عن بلورات (2D) ثنائي الأبعاد للبروتينات غشاء 9 ، تصور مجمعات البروتين في التشكل مختلفة 10 ، أو لمجرد تصور التجانس و / أو عدم تجانس تنقية البروتينات عينة هكذا توفير التغذية المرتدة لتحسين إجراءات تنقية البروتين ، وما يمكن أن يكون قويا لفحص الكيمياء الحيوية. في هذه المقالة ، قدمنا البروتوكولات بدءا من إعداد شبكات الكربون المغلفة لجمع عينات من الصور الملطخة سلبا البروتين في المجهر الالكتروني. كما هو موضح هنا ،هذا الإجراء هو بسيط وسهل وليس لاحقا. إذا محاولة حساب 3D اعادة البناء من العينة العشوائية التي يرصدها أسلوب الميل المخروطية ، فمن الضروري الحصول على صور الزوج الميل. ومع ذلك ، إذا كان أداء واحدة تحليل الجسيمات هو الغرض ، وصور متعددة untilted تكفي. في كلتا الحالتين ، مطلوب مزيد من معالجة الصور ، وهذا هو خارج نطاق هذه المقالة الفيديو.
كما هو الحال مع أي أسلوب ، هناك اختلافات في البروتوكولات. فورمات اليورانيل يعمل بشكل جيد جدا وكاشف وصمة سلبية في معظم الحالات. خلات اليورانيل آخر استخداما كاشف صمة سلبية. يعمل مشابهة جدا لفورمات اليورانيل ، ولكن مع حجم أكبر من الحبوب ، وفي كثير من الحالات ، وانخفاض النقيض من فورمات اليورانيل. وميزة استخدام خلات اليورانيل هو أن يستمر لفترة أطول من الحل فورمات اليورانيل. لا يحتاج المرء أن يعد حلا جديد كل أسبوع واحد أو اثنين. كلا فورمات اليورانيل وخلات حمضية. مصدر قلق واضح هو أنيمكن أن تحدث تغييرات انخفاض الرقم الهيدروجيني في العينة البروتين التي تجري دراستها. وصمة عار على كل من حلول وظيفة أيضا مثبتات البروتين. وقد أظهرت دراسة سابقة أن كلا من عينات البروتين 7 الإصلاح بسرعة. هذا التثبيت السريع يجعل انخفاض الرقم الهيدروجيني أقل أهمية. أثناء عملية التلوين ، وشمل عينة من البروتين تصبح ثابتة قبل انخفاض الرقم الهيدروجيني يمكن أن تحدث أي تغييرات. ومع ذلك ، قد الكواشف الأخرى صمة سلبية ، مثل موليبدات الأمونيوم وحمض الفسفوتنغستيك ، تحقق نتائج أفضل لتلطيخ عينات عند انخفاض الرقم الهيدروجيني هو مصدر قلق 7. كلا موليبدات الأمونيوم وحمض الفسفوتنغستيك لديها درجة الحموضة محايد تقريبا ، ولكن على النقيض من عينات البروتين التي تولدها هذه البقع عادة ما تكون أقل شأنا من فورمات اليورانيل.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
الإلكترون المجهري العمل في المختبر تشنغ هو الدعم جزئيا عن طريق المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (1R01GM082893 ، 1R01GM098672 ، 1S10RR026814 - 01 وP50GM082250 (ألف لفرانكل)) ، ومنحة من برنامج UCSF للبحوث الطبية الحيوية الاختراق ، وجائزة الفرص وجائزة التكنولوجيا الجديدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collodion | Electron Microscopy Sciences | 12620-30 | 30ml, 2% in Amyl Acetate |
| Gilder Cu grids | Ted Pella, Inc. | G400/G200 | 400/200 mesh |
| Cressington 208C High Vaccume Turbo Carbon Coater | Ted Pella, Inc. | 9260 | |
| Double pointed Carbon rod | Ted Pella, Inc. | 58 | |
| Uranyl formate | Electron Microscopy Sciences | 16984-59-1 | 99.9% purity |
| PELCO easiGlow GlowDischarge system | Ted Pella, Inc. | 91000 | Purchase at local pharmacy |
| Whatman #1 Filter paper | Fisher Scientific | 09-805E |
References
- Cheng, Y., Walz, T. The advent of near-atomic resolution in single-particle electron microscopy. Annu. Rev. Biochem. 78, 723-742 (2009).
- Grigorieff, N., Harrison, S. C. Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (2), 265-273 (2011).
- Zhou, Z. H. Atomic resolution cryo electron microscopy of macromolecular complexes. Adv. Protein Chem. Struct. Biol. 82, 1-35 (2011).
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W.
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).
- Rabl, J. Mechanism of gate opening in the 20S proteasome by the proteasomal ATPases. Mol. Cell. 30 (3), 360-368 (2008).
- Zhao, F. Q., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J. Struct. Biol. 141 (1), 43-52 (2003).
- Radermacher, M., Wagenknecht, T., Verschoor, A., Frank, J. Three-dimensional reconstruction from a single-exposure, random conical tilt series applied to the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli. J. Microsc. 146 (Pt. 2), 113-136 (1987).
- Zhao, G. Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring adjustment of a particularly large combination of specific parameters. J. Struct. Biol. 169 (3), 450-454 (2010).
- Nishida, N. Activation of leukocyte beta2 integrins by conversion from bent to extended conformations. Immunity. 25 (4), 583-594 (2006).
