Visualisera proteiner och Makromolekylär av negativa Stain EM: från Grid förberedelse till Image Acquisition

Summary

Visualisering protein prover av negativa bets elektronmikroskopi (EM) har blivit en populär strukturell analys metod. Det är användbart för kvantitativ strukturell analys, såsom att beräkna en 3D-rekonstruktion av molekyler som studeras, och även för kvalitativ undersökning av kvaliteten på proteinet förberedelser. I denna artikel presenterar vi detaljerade protokoll för att förbereda EM nät, färgning provet och visualisera provet i ett elektronmikroskop. Nybörjare kan följa dessa protokoll lätt och att använda negativa fläcken EM som rutin analys, utöver andra biokemiska analyser för att utvärdera deras protein prover.

Abstract

Enda partikel elektronmikroskopi (EM), både negativa färgade eller fryst hydratiserad biologiska prov, har blivit ett mångsidigt verktyg i strukturbiologi ^1. Under senare år har denna metod nått stora framgångar i att studera strukturer av proteiner och makromolekylära ^{2, 3.} Jämfört med elektron cryomicroscopy (cryoEM), där frysta hydratiserade protein prover är inbäddade i ett tunt lager av glaskroppen is ^4, är negativ färgning en enklare provberedning metod där protein prover är inbäddade i ett tunt lager av torkad tungmetaller salt för att öka exemplar kontrast ^5. Den förbättrade kontrasten i negativa fläcken EM möjliggör undersökning av relativt små biologiska prover. Förutom att bestämma tredimensionella (3D) struktur renade proteiner eller proteinkomplex ^6, kan denna metod användas för mycket bredare ändamål. Till exempel negativ fläck EM enkelt kan användas för att visualisera renasprotein prover, få information såsom homogenitet / heterogenitet i urvalet, bildandet av protein komplex eller stora sammanställningar, eller helt enkelt för att utvärdera kvaliteten av ett protein beredning.

I den här videon artikeln presenterar vi ett komplett protokoll för att använda ett EM för att observera negativt färgade protein prov, från att förbereda kol belagt galler för negativa fläcken EM för att hämta bilder av negativt färgade provet i ett elektronmikroskop drivs med 120kV accelerationsspänning. Dessa protokoll har använts i vårt laboratorium rutinmässigt och kan lätt följas av nybörjare.

Protocol

1. Beredning av EM nät för koldioxid beläggning

1. Fyll ett stort glas bägare med destillerat vatten.
2. Använd en glaspipett att släppa en enda droppe kollodium (~ 20μl, 2% i amylacetat, elektronmikroskopi vetenskaper, PA, USA) på ytan av vattnet. Kollodium sprider för att bilda ett tunt plastskikt på vatten / luft yta, Anmärkning: En första droppe kollodium kan användas för att rensa vattenytan från alla dammpartiklar. Efter att av filmen från den första droppe, är vattenytan klara av damm.
3. Placera EM galler, 400 eller 200 mesh Gilder Cu galler köpt från Ted Pella Inc. (USA), en efter en på den plast som flyter på vattenytan, vi vanligtvis 50 ~ 100 nät i en nära förpackning mönster, med den blanka sidan av rutnätet vänd ner i plastskikt (bild 1A). Anm: 400 mesh nät är bra för rutinmässig negativa fläck EM elnät, medan 200 mesh nät är bra för att samla in lutning par bilder.
4. Skär en pajce av papper med måtten något större än det område där galler placeras på plastskikt. Placera papperet försiktigt ovanpå gallret (bild 1B) och vänta tills papperet blir helt våt (bild 1C). Anm: Olika typer av papper har olika skattesatser vattenabsorption. Det är viktigt att papperet inte absorberar vatten för fort. Till exempel är regelbundna filterpapper inte bra för detta ändamål eftersom det absorberar vatten för fort och gör en hel del rynkor. Kolet film gjord av skrynkliga papper är inte platt, och därmed inte bra för att samla in lutning par bilder för slumpmässiga koniska lutning 3D-rekonstruktion. Man måste testa olika papper för att hitta en lämplig en. I vårt laboratorium har vi använt papper från anteckningsblock som köpts av lokala mataffär. Ibland tidningens papper visade sig också vara lämpliga. Ett annat alternativ är att använda den relativa tjockt rispapper som används för kinesiska / japanska kalligrafi.
5. Snabbt gör snitt på plastfilm runt och näraden indränkt papper. Omedelbart efteråt, använd en pincett för att plocka upp papperet med galler inklämt mellan plastfolie och papper. Placera papperet i en petriskål med galler uppåt för lufttorkning (bild 1D), Anmärkning: Det är viktigt att låta papperet lufttorka. Torkning för snabbt genererar många rynkor i tidningen.

2. Carbon beläggning galler

1. Den kol-beläggning maskin som används i vårt laboratorium är ett Cressington 208C High Vacuum Turbo Carbon Coater (Ted Pella). Vårt system är försett med en Cressington filmtjocklek bildskärm, som mäter tjockleken på belagda kol film baserad på principen att den oscillerande frekvensen av en kvartskristall ändras med massan av en deponeras film på ytan. Dock beskrev protokollet här kräver inte en tjocklek bildskärm, eftersom det ofta inte finns i varje laboratorium.
2. Skärpa en kolstav med ett bryne (Ted Pella) och ladda stavar kol i kol beläggning machine (Fig. 2A). Två spön, ett med en vass spets och den andra med en platta änden placeras mot varandra.
3. Tillämpa vakuum fett på hälften av de frostade området en glasskiva och placera den intill näten (Fig. 2B). Bara hälften av frostade delen av objektglas bör täckas med vakuum fett. OBS: Området med vakuum fett kommer inte att ändra färg efter kol beläggning. Kontrasten mellan angränsande områden med och utan vakuum fett ger en uppskattning av tjocklek av bestruket kol.
4. Placera papperet med galler på scenen av kol bestrykningsmaskin. Placera glasskiva bredvid näten (Fig. 2C). Notera: Man kan också första överföring nät belagd med plastfilm på en glasskiva innan beläggning, i fall många galler faller av från papperet.
5. Pumpa vakuumkammare och vänta tills vakuum når en nivå av 10 ^-5 Torr. Obs: beläggning med lägre vakuum genererar ofta många gnistor, vilket leder till många stora kolpartiklar pånätet.
6. Öka nuvarande mycket långsamt. Den kraftiga toppen av kolstav kommer först blir röd och sedan vit som den nuvarande ökar. Ej titta på hög ljusstyrka spets direkt med blotta ögat. Sluta öka ström när beläggningen börjar. Glaset bilden kommer att ändra färg från vitt till ljusgrått och mörkgrått. Mörkret av bilderna korrelerar tjockleken på kolet film som belagda. Stäng av strömmen för att stoppa beläggning när önskad tjocklek uppnåtts (bild 2D). Anm: 1) Efter upprepade processer kol beläggning, belagda kol från insidan av glaset glaskupan kunde mörkare färg. Detta gör den belagda kol filmen visas tjockare än den faktiskt är. 2) En skärpt kolstav kan användas för flera beläggning. Skärpan i spetsen gradvis har minskat efter varje beläggning. Den maximala strömmen påverkas av skärpan i kolet spö. En färsk vässade stång med mindre diameter kräver en relativt lägreström att avdunsta kol. Senare beläggning kan kräva något högre ström.
7. Avlufta vakuumkammare och ta bort belagda nät för senare användning.
   Not 1. Ju mer exakt metod för att kontrollera kol tjockleken är att använda en monitor filmtjocklek. Eller kan man kvalitativt kalibrera färgen mot den korrekta tjocklek mätt med monitorn. En användbar kol tjocklek för denna teknik är mellan 3 och 7 nm.

Detta är en enkel och enkel metod för att förbereda en stor mängd kol belagt galler, oftast ~ 100 nät per beredning. Näten innehåller ett tunt plastskikt, som oftast inte påverkar kvaliteten på den negativt färgade bilden. Men nät upprättats i denna metod är inte lämpliga för cryoEM. Detta lager av plast kan tas bort genom att blötlägga näten i kloroform i flera timmar.

3. Förbereda lösning AUC formiat (0,75%) för negativa fläcken EM. Den detaljerade protokoll varbeskrivits tidigare ⁵

1. Väg upp 37.5mg av AUC formiat i en liten bägare;
2. Tillsätt 5 ml kokande vatten och rör om 5 minuter i mörker;
3. Tillsätt 10μl 5M NaOH, fortsätt rör om 5 minuter;
4. Filtrera hjälp av en spruta filter (Fisherbrand, 13mm spruta filter, 0.2μm, Nylon osterila, katalognummer 09-720-5), och lagra den filtrerade lösningen i en 8ml Falcon rör täckt med aluminiumfolie;
   Anm. AUC Formate pulver kan köpas från elektronmikroskopi Sciences (Hatfield, PA), katalognummer 22.451. AUC formiat lösning är ljuskänsliga och bör hållas borta från direkt ljus, till exempel genom att täcka Falcon röret med aluminiumfolie. En nyligen beredd lösning har en ljusgul färg (Fig. 3A). Fläcken lösning kan förvaras på bänken för en till två veckor innan den börjar utlösande. AUC formiat är surt med ett pH ~ 4. Lägga NaOH ökar pH, men att lägga den för snabbteller i överskott kan orsaka fläckar fällas ut. Förutom att skapa kontrast, fixar AUC formiater också proteinet provet. Eftersom fixeringen räntan är så snabb, det låga pH påverkar normalt inte den totala proteinet konformationer eller protein komplexbildning ^7.

4. Protokoll för att förbereda negativa fläcken EM nätet. Detta protokoll har beskrivits i detalj tidigare ⁵

1. Glow-utsläpp av koldioxid belagda nätet, med hjälp av Pelco easiGlow GlowDischarge systemet (Ted Pella Inc., USA). Den nuvarande används är 15 mA och galler är glöden ut i 30 sekunder. Anm. Glow-urladdat nät bör användas kort efter glöd urladdning. Vi använder ofta nät på mindre än 2 timmar efter glöden urladdning.
2. Placera två 20μl droppar destillerat vatten och två 25μl droppar AUC formiat lösning på en bit parafilm (Fig. 3B).
3. Håll en glöd-urladdat rutnät med omvänd-kraft mot kapillär pincetten med bilenBon-belagd uppåt. OBS: Det är nödvändigt att använda anti-kapillär pincett. Annars kommer flytande prov sugs bort från nät av kapillärkraften mellan pincett.
4. Applicera 2μl protein provet till självlysande ut nätet, och vänta 30 sek. OBS: Väntetiden och längden på glöd utsläpp påverkar koncentrationen av proteiner absorberas i rutnätet. Mycket spädda kräver längre adsorption gånger. Däremot kan långvarig adsorption ändra bufferten koncentrationen eftersom vatten ångor. För att uppnå en ordentlig partikel distribution i nätet kräver lite trial and error.
5. Blot av provet med filtrerpapper.
6. Peka på nätet ytan en vattendroppe och sedan blot av vattnet med filtrerpapper. Upprepa med den 2: a droppe vatten.
7. Peka på nätet ytan till första droppen fläcken kortfattat. Blot bort fläcken lösning med filterpapper.
8. Peka på nätet ytan till den andra droppe färg i 20 sekunder. Blot oFF fläcken lösning med filterpapper.
9. Torka av gallret med hjälp av ett vakuum. Notera: Man kan också lämna galler på bänken eller i en kemisk huva lufttorka. Fördelen med vakuum torr är att man kan observera nät i EM direkt. De möjliga artefakt som genereras av snabbtorkande är ojämn fläcken.

5. Transmissionselektronmikroskop

1. Mikroskopet används i denna demonstration är en Tecnai T12 (FEI Company) utrustad med en Gatan 4K x 4K CCD-kamera.
2. Kortfattat Kontrollera inriktningen av mikroskopet innan du sätter in provet, Obs: Denna behövs bara en gång per EM session. I en modell mikroskop kan nästan perfekt anpassning räddas tidigare. Laddar sådan anpassning filen ska återställa mikroskop anpassning till en nästan perfekt skick.
3. Lägg i EM rutnätet på den inre lutning standarden provhållare.
4. Sätt hållaren i CompuStage av T12. Vänta på att pumpa cykeln för att slutföra.
5. Sätt hållaren i kolumnen. </ Li>
6. Fokus prov och ställa in en önskad minskad fokus, oftast-1.5um. Obs: Fokusering kan uppnås antingen genom att manuellt fokusera använda lägsta kontrasten metoden eller med hjälp av CCD-kamera för att fånga live-bilder och beräkna leva Fourier kraftspektrum.
7. Spela in en bild med CCD-kamera;
8. I bilder av negativt färgade proteiner prover, är proteiner ses ofta med vita kontrast, dvs vitt densitet mot en mörkare bakgrund. Notera att medan proteinet halter i olika delar av samma nät är oftast ganska lika, inte en observera olika nivåer av färg i olika delar av samma nät. Ibland områden kan ha ojämn färgning eller ens positiv färgning (protein verkar mörkt på en ljus bakgrund), medan vissa andra områden har perfekt fläcken. Det är ofta nödvändigt att söka på nätet för att hitta ett bra område för avbildning.

6. Representativa resultat

Exempel på typiska bra bilder av negativt STAINED prover, häst mjälte ferritin (Figur 4A), Fab (Fig. 4B), archaeal 20S proteasom (fig. 4C) och nukleosomen (Fig. 4D), visas.

Figur 1. Beredning av kol belagda nät för negativa fläcken EM. A) Placera EM nät en efter en i en sluten förpackning mönster på ytan av kollodium film. B) Placera ett papper något större än området för näten. C) Vänta tills papperet blir helt blöt. D) Plocka upp tidningen tillsammans med galler för lufttorkning.

Figur 2. . Beläggning EM nät med kol A) Setup kolet förångaren: placera två kolstavar i beläggningen apparaten, med en stav (till vänster) slipas till en punkt spets. Den andra staven (till höger) har en plan yta och kommer i kontakt med den punkt spetsen av en i motsatt side. B) Placera en liten mängd vakuum fett i ena sidan av ett främjas glasskiva. Området inom den svarta ramen har vakuum fett. C) Inställning näten för beläggning. Glaset bilderna används för att hålla papperet på plats. Pilspetsen pekar området med vakuum fett. D) Efter beläggning, ändrar färgen på bilden med vakuum omfattas fett inte färgen. Kontrasten anger tjockleken på belagda kol.

Figur 3. Illustrera negativa färgningsproceduren. A) Nyberedd (vänster) AUC formiater Lösningen är transparent utan tecken på utfällning. Efter 1 ~ 2 veckor, utfällningar börjar ansamlas i botten i botten av röret. B) Placera två droppar (~ 25μl) destillerat vatten och två droppar AUC formiat lösning i en bit parafilm. Använd ett par anti-kapillära pincett för att hålla en glöd urladdat kolbelagda EM rutnät med kol sidaupp. En droppe av provet (~ 2μl) placeras i rutnätet. C) Efter att ha väntat i 30 sekund, blot lösningen med ett filtrerpapper. D) Vänd på nätet att röra provet sidan av rutnätet med den första droppe vatten. Upprepa steg C och D för att slutföra processen med färgning.

Figur 4. Exempel på EM bilder av negativt färgade proteinet prover. A) Häst mjälte ferritin, B) fragment av antigen bindande (Fab), C) archaeal 20S proteasom och D) nukleosomen. Alla bilder har spelats in med samma förstoring. Skalan bar är 20nm.

Discussion

Negativ fläcken EM är ett kraftfullt verktyg som kan användas för att studera 3D-strukturer av renat protein prover, som att använda slumpmässiga koniska luta ^8-metoden, vilket kräver samla ett par bilder med en från individ lutas till 60 ° och en från samma område men icke vridna, för att beräkna 3D rekonstruktioner av makromolekylära komplex. Dessutom negativ färgning EM kan ha många andra program, till exempel screening för tvådimensionell (2D) kristaller av membranproteiner ^9, visualisera proteinkomplex i olika konformationer ^10, eller helt enkelt för att visualisera homogenitet och / eller heterogena renade proteiner prov på så sätt att ge feedback för att förbättra rutiner proteinrening, etc. Det kan vara en kraftfull analys för biokemister. I denna artikel presenterade vi de protokoll från förbereda kolbelagda galler för att samla bilder av negativt färgade protein prover i ett elektronmikroskop. Som framgår här,proceduren är ganska enkel och lätt att följa. Om du försöker att beräkna 3D rekonstruktioner av provet som observerades av slumpmässiga konisk luta metod, är det nödvändigt att skaffa luta par bilder. Men om du utför enda partikel analys är syftet, kommer flera icke vridna bilder räcka. I båda fallen är ytterligare bildbehandling krävs och detta är utanför ramen för denna video artikeln.

Som med alla metoder, det finns variationer i protokollen. AUC formiat fungerar mycket bra som en negativ fläck reagens i de flesta fall. AUC acetat är en annan vanligt förekommande negativa fläcken reagens. Det fungerar mycket liknande som AUC formiat, men med en större kornstorlek och i många fall, lägre kontrast än AUC formate. Fördelen med att använda AUC acetat är att lösningen varar längre än AUC formate. Man behöver inte förbereda en ny lösning var en eller två veckor. Både AUC formiat och acetat är sura. En uppenbar oro är attlågt pH kan medföra förändringar i proteinet provet som studeras. Båda fläcken lösningar fungerar också som protein fixeringsmedel. En tidigare studie har visat att både fixa protein prover snabbt ^7. Den snabba fixering gör det låga pH-värdet mindre viktigt. Under processen av färgning, ett protein prov blir fastställas innan det låga pH kan inducera några förändringar. Dock kan andra negativa fläckar reagens, såsom ammoniummolybdat och fosforvolframsyra, ger bättre resultat för färgning prov när lågt pH är ett bekymmer ^7. Både ammoniummolybdat och fosforvolframsyra har en ungefär neutralt pH, men kontrasten av protein prover som genereras av dessa fläckar är oftast sämre än AUC formate.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collodion	Electron Microscopy Sciences	12620-30	30ml, 2% in Amyl Acetate
Gilder Cu grids	Ted Pella, Inc.	G400/G200	400/200 mesh
Cressington 208C High Vaccume Turbo Carbon Coater	Ted Pella, Inc.	9260
Double pointed Carbon rod	Ted Pella, Inc.	58
Uranyl formate	Electron Microscopy Sciences	16984-59-1	99.9% purity
PELCO easiGlow GlowDischarge system	Ted Pella, Inc.	91000	Purchase at local pharmacy
Whatman #1 Filter paper	Fisher Scientific	09-805E