生体デュアル基質生物発光イメージングにおける

Summary

ここに我々は彼らの成長と転移時に転移性乳癌細胞で発現ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ酵素の両方の生物発光反応を構築可視化し、定量化するための方法を説明

Abstract

どのように、いつ乳癌細胞トランジット設立原発腫瘍から転移部位への我々の理解は 、in vivo生物発光イメージング技術^1-3 での登場以来、異例の速度で増加している。確かに、特定のアッセイ時間で動物の個々のグループを犠牲にするのではなく、調査が完了するまでの動物の単一コホートにおける長手方向に腫瘍の成長を見つけて、定量化する能力は、研究者は乳癌の転移を調べる方法に革命をもたらしました。残念ながら、現在の方法論は、乳癌細胞（i）は 、原発腫瘍内進化（ⅱ）全身に広まると、（iii）の部位で増殖するプログラムを再開始などの細胞シグナル伝達系に引っ掛かった重要な変化をリアルタイムに評価することを妨げ転移巣。しかし、生物発光イメージングの最近の進歩は、今では可能な限り同時に特定spatiotemporを定量化することアルは、デュアル基板の発光反応の使用を介して腫瘍の発生と転移の進行の関数としての遺伝子発現の変化。これを行うために、研究者は、以前はin vitroの細胞内で自分の広範囲に使用を促進し、相互に排他的な基質に反応どちらもホタル（Photinus pyralis）とシーパンジー（ ウミシイタケ ）から単離された二つの光産ルシフェラーゼ酵素のために活用するベースのレポーター遺伝子アッセイ^4。ここでは、第二発光反応は、腫瘍の異なる段階で特定のシグナル伝達系の活性化状態を可視化するための手段として機能し、一方の発光反応は、具体的には、開発腫瘍の大きさと位置をマークするようなこれら二つの酵素の in vivoでのユーティリティで実証と転移の開発。したがって、本研究の目的は2つあります。まず、デュアル生物発光レポーター細胞株を構築するために必要な手順について説明しますS、同様に転移カスケードの具体的な手順の間の遺伝子発現の時空的制御を可視化での使用を容易にするために必要なものなど。乳癌転移の4T1モデルを用いて、我々は、原発腫瘍^4-6で測定されたものと比較して合成のSmadバインディング要素（SBE） のインビボ活性プロモーターは肺転移で劇的に減少したことを示している。最近では、乳癌の転移は、線維芽細胞および浸潤免疫細胞^7-9に起こるものを含む、原発腫瘍の微小環境と反応性間質内の変化により調節されることが示された。したがって、我々の第二の目的は、乳がんの増殖と転移の間に単一の動物の中で抱いつのユニークな細胞集団の成長とローカリゼーションを監視するデュアル生物発光技術の有用性を実証することであろう。

Protocol

1。 CMV駆動ウミシイタケルシフェラーゼを安定的に発現

1. 安定したクローン集団のトランスフェクションおよび選択は、このシイタケルシフェラーゼレポーターの発現のための好ましい方法である。このアプローチでは、追加の二次レポーター構築物（ 例えば 、ホタルルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質）の後続導入後、より一貫性のある統一されたウミシイタケルシフェラーゼ発現をもたらす。
2. そのようなpcDNA3.1に-Hygroまたは別のプラスミドを選択マーカーとして発現ベクターエンコーディングウミシイタケルシフェラーゼとの利害の悪性細胞を、トランスフェクション。
3. トランスフェクション後、続いて個別に継代培養分離されている個々のコロニーの単離を容易にするために、数日から数週間のために最適化された抗生物質の濃度下でトランスフェクタントを配置します。
4. シイタケ発現の程度を監視するために≥10個シイタケルシフェラーゼを発現するコロニーを選択します。
、（i）病態生理学的特性が維持されることを保証するために分析し、かつ、（ii）ウミ式の値は、経時的に逸脱または変更しないでください。これらの手順は、クローン変異体/逸脱を分離し、勉強しないため、また、ゲノム中にシイタケの構築物の適切な統合を検証するために絶対に不可欠です。
5. 安定した形質転換体を単離し、確認されると、人は選択圧を削除することができ、ウミシイタケルシフェラーゼの発現は、in vitroおよびin vivoの両方で長時間長さにわたって一定のままであることが保証されます。

2。表現、選択、および誘導性プロモーター駆動ホタルルシフェラーゼの機能検証

1. （ 例えば 、PUR選択マーカーを保有するプラスミドpGL4-ルシフェラーゼレポーターに興味のあるプロモーターをサブクローニング安定したシイタケ発現（ 例えば 、ハイグロマイシン）を選択するために使用されているものとは区別されomycin）。
2. ステップIのように悪性細胞をトランスフェクトし、その後ホタルルシフェラーゼ発現細胞の安定したポリクローナル集団に対して選択します。レポート遺伝子がゲノムに組み込まれる場所はその発現および規制上の誤った効果を引き出すことができるので、それが強く、（ⅰ）レポーター遺伝子の発現を確保するためのクローン集団とは対照的に、ホタルルシフェラーゼ発現細胞のポリクローナル集団を選択することをお勧めしますより正確には親細胞における内在性遺伝子のそれを反映していると、（ii）遺伝子発現への統合効果は、不均一な細胞集団全体の平均と減少する。
3. 安定シイタケとホタルルシフェラーゼの両方を発現するように設計悪性細胞を総称デュアル生物発光レポーター細胞、またはDBR細胞と呼ばれています。
4. 伝統的な使用<em>は体外細胞ベースのルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイでは、DBR細胞がホタルルシフェラーゼ発現を調節していることを確認し、正または負に、一過性にこれらのベクターでトランスフェクト親細胞で観察されたものと一致した方法で。同様に、シイタケのCMV駆動式は、種々の細胞の刺激や処理条件によって規制されていないことを確認します。
5. 24ウェルプレートで、とても文化DBRと親細胞を行い、その後、一時的に元のCMV-レニラとプロモーター - ホタルと同時トランスフェ親細胞にDBRの細胞を生成するために使用する構築します。
6. その後、要因や、興味のあるプロモーターを調節し、その後プロメガデュアルルシフェラーゼアッセイキットを用いてホタルおよびウミシイタケ発光を定量するために知られている薬剤でDBRとトランスフェクトされた親細胞を治療する。

3。 4T1プライマリ乳腺腫瘍の確立

1. 我々転移4T1乳癌細胞不足している外膜のげっ歯類の病原体への再発見を安定CMV駆動ウミシイタケルシフェラーゼ（たpcDNA3.1-CMV-シイタケルシフェラーゼ-hygro）およびSBE駆動型ホタルルシフェラーゼ（pGL4.2-SBE-ホタルルシフェラーゼ - プロ）などを発現するように設計された前述した。主に肺の自発転移の形成におけるこれらの乳癌細胞の同所移植は結果。
2. 4T1細胞は、従来の2次元組織培養系におけるそれらの伝播中コンフルエンスに到達させてはいけません、そして、彼らは、それらの生体内接種前日に継代されるべきである。
3. 4T1細胞はトリプシン処理により解離させ、増殖培地で十分に洗浄し^{、2×10 5}細胞/ mlの濃度になるようにPBSで希釈し、直ちに氷上で保存する必要があります。
4. 雌のBALB / cマウス（4-6週齢）はイソフルランと1％イソフルランの投与量で麻酔下で維持3％の導入量で麻酔しなければなりません。で拭き取りによる注射部位の準備70％イソプロピルアルコール。ピンセットを用いて、そっとつかんで、第四鼠径乳房パッドを持ち上げます。慎重に、27.5ゲージの針のベベル側を上に置いて、腹腔に針をプッシュしない特別な世話をして、直接乳首の下に乳房脂肪体に注入する。腺を放し、ゆっくりと乳房脂肪体に細胞懸濁液（1×10 ^4個の細胞）の50μlを注入します。

4。初期のデュアル発光イメージング

1. 直ちに乳腺脂肪パッドに4T1細胞を移植後、マウスはまだ麻酔しながら、外側尾静脈にRediJectセレンテラジンの100μlを注入します。これは動物によって許容ベンダーやベストが推奨する最適な基質濃度である。
2. 直ちにIVIS-200イメージング·システム内イソフルランノーズコーン上にマウスを置いて、0.5から1分発光画像を取得する。注射と画像取得の間に効率が信号として、非常に重要であるウミシイタケルシフェラーゼのため急激に下がる〜30秒後噴射。そのケージに戻し、マウスを置き、任意の残留シイタケルシフェラーゼ信号が消失したことを、マウスが完全に麻酔から回復したことを保証し≥1時間で回復することができます。
3. IP注射を介して、D-ルシフェリンカリウム塩の150 mg / kgを投与し、5分間待ちます。これは、試験動物へのその注射後5〜15分のための安定した発光シグナルを提供していますD-ルシフェリンの最適な濃度である。 isoflouraneを使用して、マウスを麻酔し、IVIS-200に交換して、元のウミ買収に対して非常に似たような立場にある動物を配置するために世話をする。このホタル信号の全体的な強さは、関心のあるプロモーターの活性に依存して、そういうものとして、ホタルルシフェラーゼ活性を可視化すると、拡張取得時間を必要とするかもしれません。
4. "光子"モードに設定IVISリビングイメージソフトウェアを使用して、貴重を確立ベースライン相対発光比率（RLR）を確立するための手段として、シイタケとホタル買収両方のES。

5。縦発光イメージング

1. 4T1細胞は^{、1×10 4}細胞の接種は、通常4-5週間以内1週間以内に触知可能な腫瘍形成に、動物の致死率につながることなど非常に積極的です。 4T1腫瘍は第4週に内在する傾向潰瘍を持っています。潰瘍性腫瘍の増殖とメンテナンスは別動物実験委員会の承認を必要とするかもしれません。本明細書に示す4T1腫瘍研究はケース·ウェスタン·リザーブ大学の動物実験委員会によって承認されている。
2. 上述したように、マウスは腫瘍の開発のさまざまな段階で固有のシグナル伝達経路を監視するために一般的な腫瘍の成長や転移を監視するRediJectセレンテラジンを持つだけでなく、D-ルシフェリンを毎週注射しなければならない。シイタケルシフェラーゼ信号が完全買収前散逸したことを確認するたびに注意してくださいホタルルシフェラーゼのシグナル。
3. 4T1腫瘍が開発し、進捗状況としては、ウミシイタケルシフェラーゼの買収は、原発腫瘍の成長を正常化し、追跡するための手段として、腫瘍細胞接種時に測定された初期ウミ値に正規化する必要があります。さらに重要なことは、時間をかけてRLRの値を計算することは、腫瘍の増殖および進行に対する個々のシグナル伝達系の時間的な規制を確立していきます。
4. 公然の肺転移は乳腺脂肪パッドに4T1細胞移植後に3〜4週間以内に明らかになる。原発腫瘍のために計算されたものに対し、肺RLRの値を比較すると、腫瘍の成長や転移に対する個々のシグナル伝達系の空間的制御を確立します。

6。単一の動物でつのユニークな細胞型のデュアル生物発光イメージング

1. 上記のように安定的に発現CMV駆動ウミシイタケルシフェラーゼのエンジニア1乳癌細胞株。これを繰り返し第二の異なる乳癌細胞株にCMV駆動ホタルルシフェラーゼを用いたエンジニアリングプロセス。
2. ここに我々混在シイタケルシフェラーゼ発現それらの非転移性と同質ホタルルシフェラーゼ発現4T07対応^10、11で4T1細胞を。これらの混合された乳癌細胞集団の様々な比率は、その後、上記のように乳房脂肪体に注入される。
3. 直ちに所定の接種細胞混合物の初期RLRs担当を確立するためにホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼの両方のイメージを取得します。
4. 縦デュアル生物発光イメージングは​​、視覚化し、原発腫瘍内の細胞組成の変化だけでなく、腫瘍の増殖および進行に対する各乳癌誘導体の時空転移を追跡します。
5. あるいは、個々の乳がんの細胞集団は、マウスの別の場所（右と左腹部乳腺脂肪をIE）に接種することができます全身性の影響を評価するために、これらの2つの集団は、腫瘍の成長や転移の様々な段階で互いの上に示す。

7。代表的な結果：

デュアル生物発光イメージングの大きな強みは、各画像はそれぞれのシイタケとホタル買収の全体の成功または失敗を判断する上で重要な評価基準として、原発腫瘍関数から派生継続信号そのような、内部的に一貫して制御されているという事実にある。撮像手順のこの側面は、セレンテラジン基質酸化に非常に敏感であるシイタケルシフェラーゼの活性の買収時に特に重要であることを自動発光する能力をもたらす。図1Aは、直ちに腸管ではなく、確立された原発腫瘍に由来する非特異的な発光シグナルとして現れ、この副作用の例を示しています。通常、これらの非特異的なセレンテラジン信号transpireの次は、このシイタケルシフェラーゼ基質の静脈注射を失敗しました。しかし、一度堅牢な原発腫瘍由来のウミ信号（図1B、 左の画像 ）が得られている、それは、そのD-ルシフェリンイメージングホタルルシフェラーゼ（図1B、 右パネル ）から派生した経路固有のシグナリングの測定を取り込むに進行しても安全です基板は、IP注射によって非常に安定であり、バックグラウンドの自動発光の無視できるレベルを生成します。

図1シイタケおよび in vivo RLRs で計算するホタル由来の生物発光画像を取得。腸管から非特異的シグナルを生じるセレンテラジンの失敗IV注射の（A）の例。サークルとPTは、原発腫瘍のおおよその位置を示しています。4T1原発腫瘍とpが付いたマウスの（B）が成功したウミ買収ulmonary転移（左パネル;脂肪パッド移植後4wk）。対応するホタルの買収は、原発腫瘍とその肺転移の両方からRLRsの計算が可能。パネルBに示すようにマウス（n = 4）から計算された（C）は 、原発腫瘍のグラフィカルな表現と肺転移RLRsは。

Discussion

生物発光イメージング技術の絶対的な力は、本明細書で積極的な4T1乳癌細胞の使用を伴う複雑な縦断的研究において、腫瘍の成長や転移を定量化する能力にある。これらの手順は両方のルシフェラーゼレポーターコンストラクトを安定的に統合に依存しているため、これらの技術は、容易に適応され、腫瘍のレイテンシおよび転移の能力を変化させることの他の癌細胞系に変換することができます。ここに示した結果と同様に、徐々に原発腫瘍とその最終的な転移を開発中で特定のRLRsを計算すると、遅延のその期間にかかわらず、腫瘍の転移の進行中に引っ掛かった特定のシグナリングイベントのリアルタイム時空間同定を可能にする。特定のプロモーター調節事象の識別の際には、消費税、原発腫瘍とその転移病巣標準免疫組織のパフォーマンスを得るためにと分化の両方にとって重要である内在性遺伝子および/またはタンパク質の同様の規制を検証するには、lの遺伝子発現解析。

技術的に言えば、二重の生物発光分析の主要な課題は、ウミシイタケルシフェラーゼの信号の比較的短い期間にある。このように、このイメージング技術は、尾静脈注射手順の大幅な最適化だけでなく、個別に注射した動物の即時イメージング、イメージングホタルルシフェラーゼに時間がかかり、やや非効率的な相対的なプロセスを必要とします。最近、プロメガは酸化の部位分子は急速に脱エステル化された時点で細胞にこの分子の利益のエントリまでエステル化によってブロックされている第二世代のルシフェラーゼ基質を表す "Viviren"を導入しました。総称して、この新規な基質は、事実ウミ誘起自動発光¹²に結合され、自動発光と非特異的修飾および/ ​​または劣化を低減します。そうすることで、この新しいrenillルシフェラーゼ基質が明るく発光信号を生成しますが、 "Viviren"の取得と使用に伴う過度のコストはデュアル生物発光分析において、この基板の全体的な有用性を評価するために必要な比較的少数の研究を提供してきました。最後に、生物発光アッセイの感度は、個々の光の単位を取得するのオペラントCCDカメラに大きく依存しています。これらの技術が向上すると確かに、我々は複雑な光媒介生物発光反応を可視化するために我々の能力は自由移動動物¹³で効率的に発散する可能性のある将来の時点を予測する。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pGL4.2-Puro [luc2/Puro] Vector	Promega Corp.	E6751
Glomax Mult-idection system	Promega Corp.
IVIS 200 series	Caliper Life Sciences
Dual luciferase reporter Assay system	Promega Corp.	E1960
Rediject c–lenterazine-h	Caliper Life Sciences	760506
D-Luciferin K-Salt	Caliper Life Sciences	122796