In vivo Dual-Substrat Bioluminescent Imaging

Summary

Hier beschreiben wir die Methoden zu konstruieren, zu visualisieren und zu quantifizieren Biolumineszenzreaktionen sowohl Glühwürmchen und Renilla Luciferase Enzymen bei metastasierendem Brustkrebs-Zellen während deren Wachstum und Metastasierung ausgedrückt

Abstract

Unser Verständnis von, wie und wann Brustkrebszellen Transit von etablierten primären Tumoren Metastasen hat zu einem außergewöhnlichen Wert seit dem Aufkommen der in vivo Biolumineszenz Imaging-Technologien ^1-3 erhöht. Tatsächlich ist die Fähigkeit, zu lokalisieren und zu quantifizieren Tumorwachstum längs in einer einzigen Gruppe von Tieren zum Abschluss der Studie nach opfern einzelnen Tiergruppen zu bestimmten Assayzeiten revolutioniert wie Forscher Brustkrebsmetastase untersuchen entgegengesetzt. Leider verhindern derzeitigen Methoden die Echtzeit-Bewertung kritischer Veränderungen, die in Zell-Signalisierungssysteme, wie Brustkrebszellen (i) innerhalb von primären Tumoren entwickeln, (ii) durch den Körper zu verbreiten, und (iii) reinitiate proliferativen Programme an Stellen von ein transpire metastatischen Läsion. Neuere Fortschritte in der bildgebenden biolumineszierenden machen es nun möglich, gleichzeitig Quantifizierung spezifischer spatiotemporal Veränderungen in der Genexpression in Abhängigkeit von der Entwicklung von Tumoren und metastatischen Progression durch die Verwendung der dualen Substrat Lumineszenzreaktionen. Um dies zu tun, nehmen die Forscher Vorteil für zwei Licht erzeugende Luciferase Enzyme aus der Glühwürmchen (Photinus pyralis) und Meer Stiefmütterchen (Renilla reniformis), von denen beide sich gegenseitig ausschließende Substrate, die zuvor ihre weite Verbreitung in erleichtert in vitro Zelle reagieren isoliert basierenden Reportergenassays ^4. Hier zeigen wir, die in vivo Nützlichkeit dieser beiden Enzyme so dass einer Lumineszenzreaktion spezifisch markiert die Größe und Lage eines Entwicklungsmittels Tumors, während die zweite Lumineszenzreaktion dient als Mittel, um den Aktivierungsstatus spezifischer Signalsysteme während verschiedene Stadien der Tumor visualisieren und Metastasierung Entwicklung. Somit sind die Ziele dieser Studie zwei-fach. Zunächst beschreiben wir die notwendigen Schritte zur Dual-Biolumineszenz Reporter-Zelllinie zu konstruierens, als auch solche benötigt wird, um ihre Verwendung bei der Visualisierung der Raumzeit-Regulation der Genexpression während bestimmter Stufen des metastatischen Kaskade erleichtern. Verwendung des Modells der 4T1 Brustkrebsmetastase zeigen wir, dass die in vivo-Aktivität eines synthetischen Smad Bindungselements (SBE) Promotor wurde dramatisch verringerte Lungenmetastasen zu derjenigen im Primärtumor ^4-6 gemessenen verglichen. Kürzlich wurde gezeigt Brustkrebsmetastase durch Veränderungen in der primären Tumor-Mikroumgebung und reaktiven Stroma, einschließlich derjenigen auftretenden Fibroblasten und Infiltrieren Immunzellen ^7-9 geregelt werden. Somit wird unserem zweiten Ziel sein, die Nützlichkeit von dualen biolumineszierenden Techniken in die Überwachung des Wachstums und Lokalisierung von zwei einzigartige Zellpopulationen in einem einzigen Tier während das Wachstum von Brustkrebs und Metastasen beherbergten demonstrieren.

Protocol

Ein. Stabile Expression von CMV-Driven Renilla Luciferase

1. Transfektion und Selektion eines stabilen klonale Population ist die bevorzugte Methode zur Expression dieses Renilla-Luciferase Reporter. Dieser Ansatz liefert eine konsistente und einheitliche Renilla Luciferase Expression nach der anschließenden Einführung von zusätzlichen sekundären Reporter-Konstrukte (zB Luciferase oder fluoreszierende Proteine).
2. Transfizieren malignen Zellen von Interesse mit dem Expressionsvektor kodiert Renilla-Luciferase, wie pcDNA3.1-Hygro oder einem anderen Plasmid, einen selektierbaren Marker.
3. Nach Transfektion, platzieren die Transfektanten unter einem optimierten Antibiotikumkonzentration mehrere Tage zu Wochen, um die Isolation von einzelnen Kolonien, die anschließend isoliert und werden einzeln subkultiviert erleichtern.
4. Wählen ≥ 10 einzelne Renilla-Luciferase-exprimierende Kolonien um das Ausmaß der Expression Renilla überwachen.
(i) pathophysiologischen Eigenschaften ihrer elterlichen Gegenstücke zurückgehalten werden, und (ii) Renilla Expressionswerte nicht abweichen oder mit der Zeit verändern. Diese Schritte sind unbedingt zu vermeiden, zu isolieren und zu studieren klonalen Varianten / Abweichler und eine ordnungsgemäße Integration der Renilla Konstrukt in das Genom zu validieren.
5. Sobald eine stabile Transfektanten wird isoliert und verifiziert, kann ein Entfernen der selektiven Druck und sichergestellt, daß die Expression von Renilla-Luciferase bleibt über längere Zeitspannen sowohl in vitro als auch in vivo konstant gehalten werden.

2. Expression, Auswahl und Functional Verification der induzierbaren Promoter-Driven Firefly Luciferase

1. Subklonierung der Promotor von Interesse in eine pGL4-Luciferase Reporterplasmid beherbergen einen selektierbaren Marker (zB, puromycin), die sich von dem früher für stabile Renilla Ausdruck (zB Hygromycin) zu wählen ist.
2. Transfizieren malignen Zellen wie in Schritt I, und anschließend für eine stabile polyklonale Population von Glühwürmchen-Luciferase-exprimierenden Zellen auszuwählen. Da der Ort, an dem ein Bericht Gen integriert in das Genom fehlerhaften Auswirkungen auf die Expression und Regulation auslösen kann, ist es dringend empfohlen, für polyklonale Populationen von Glühwürmchen-Luciferase-exprimierenden Zellen auszuwählen, um klonalen Populationen im Gegensatz zu, dass (i) die Expression des Reportergens zu gewährleisten genauer widerspiegelt die des endogenen Gens in parentalen Zellen, und (ii) Integration Wirkungen auf die Genexpression werden gemittelt und über die heterogene Zellpopulation vermindert.
3. Bösartigen Zellen dazu entworfen, um stabil exprimieren sowohl Renilla und Glühwürmchen-Luciferasen werden kollektiv als Dual biolumineszierenden Reporter Zellen oder DBR Zellen bezeichnet.
4. Mit traditionellen <em> in vitro zellbasierten Assays Luciferasereportergens, ob die Zellen DBR Glühwürmchen-Luciferase Expression regulieren, entweder positiv oder negativ, in einer Weise, die in übereinstimmende mit parentalen Zellen transient mit diesen Vektoren transfiziert beobachtet. Ebenso sicher, dass CMV-driven Ausdruck Renilla nicht durch verschiedene Zell-Stimulation oder Behandlung Bedingungen geregelt.
5. Dazu Kultur DBR und parentalen Zellen in 24-Well-Platten, und anschließend transient co-transfizieren parentalen Zellen mit dem ursprünglichen CMV-Promotor und Renilla-Glühwürmchen-Konstrukte verwendet werden, um Zellen zu erzeugen DBR.
6. Danach behandeln DBR und transfizierten Zellen mit elterlichen Faktoren oder pharmakologische Wirkstoffe bekannt, die den Promotor von Interesse zu regulieren, und anschließend Quantifizieren Glühwürmchen-und Renilla-Lumineszenz unter Verwendung des Promega Dual-Luciferase Assay Kit.

3. Gründung 4T1 Primäre Mammatumoren

1. Metastasierendem 4T1 Mammakarzinomzellen, dass wirwieder gefunden fehlender Adventitia Nager Pathogene wurden entwickelt, um stabil exprimieren, eine CMV-driven Renilla Luciferase (pcDNA3.1-CMV-Renilla Luciferase-hygro) und ein SBE-driven firefly Luciferase (pGL4.2-SBE-Luciferase-puro) als oben beschrieben. Orthotopen Engraftment dieser Brustkrebszellen führt zur Bildung von spontanen Metastasen hauptsächlich in der Lunge.
2. 4T1-Zellen sollten nicht zur Konfluenz während ihrer Ausbreitung in herkömmlichen 2-dimensionalen Gewebekultursystemen erreicht werden, und sie sollte einen Tag vor dem In-vivo-Impfung passagiert werden.
3. 4T1 Zellen sollten dissoziierten durch Trypsinisierung, gründlich in Wachstumsmedium und in PBS auf eine Konzentration von 2x10 ⁵ Zellen / ml und sofort auf Eis gelagert.
4. Weibliche Balb / C-Mäuse (4-6 Wochen alt) sollte anästhesiert mit einer Induktion Dosis von 3% Isofluran und gehalten unter Anästhesie mit einer Dosis von 1% Isofluran. Bereiten Sie die Injektionsstelle durch Abtupfen mit70% igem Alkohol. Mit einer Pinzette vorsichtig greifen und heben Sie den vierten inguinal Mamma Pads. Vorsichtig, legen Sie ein 27,5-Gauge-Nadel Fase nach oben und injizieren in die Brustfettpolster direkt unter der Brustwarze, wobei besondere Sorgfalt nicht schieben die Nadel in die Bauchhöhle. Lassen Sie die Verschraubung und injizieren Sie langsam 50 ul der Zellsuspension (1x10 ⁴ Zellen) in den Brustfettpolster.

4. Erste Dual-Luminescent Imaging

1. Unmittelbar nach Transplantationszellen 4T1 Zellen auf die Brustfettpolster und während die Mäuse anästhesiert noch injizieren 100 ul RediJect Coelenterazin in die laterale Schwanzvene. Dies ist die optimale Substratkonzentration durch den Verkäufer und das beste von den Tieren vertragen empfohlen.
2. Unmittelbar platzieren Sie den Mauszeiger in die Isofluran Bugspitze im IVIS-200 Imaging-System und erwerben ein 0,5-1 Minuten lumineszierendes Bild. Effizienz zwischen Injektion und Bildaufnahme ist sehr wichtig, da das Signalfür Renilla-Luciferase fällt steil ~ 30 Sekunden nach der Injektion. Platzieren Sie die Maus wieder in seinem Käfig und lassen Sie es für ≥ 1 Stunde, was bedeutet, dass der restliche Renilla Luciferase-Signal verflüchtigt hat und dass die Maus vollständig aus der Narkose erholt sorgt erholen.
3. Verwalten 150 mg / kg D-Luciferin Kaliumsalz via IP-Injektion und 5 Minuten warten. Dies ist die optimale Konzentration von D-Luciferin, die eine stabile Lumineszenzsignal für 5-15 Minuten nach der Injektion in Versuchstieren bereitstellt. Anesthetize die Maus mit isoflourane und ersetzen in der IVIS-200, kümmert sich um das Tier in einer sehr ähnlichen Position in Bezug auf den ursprünglichen Renilla Akquisition positionieren. Die Gesamt-Intensität dieses Leuchtkäfer-Signal wird auf die Aktivität des Promotors von Interesse abhängen, und als solche, Visualisieren Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität kann die erweiterte Erfassungszeiten erfordern.
4. Mit dem IVIS Wohnfläche Image Software auf "Photonen"-Modus, stellen wertvollees sowohl für die Renilla und Glühwürmchen Akquisitionen als Mittel zur Grundlinie relativen Lumineszenz-Verhältnisse (RLR) herzustellen.

5. Longitudinal Luminescent Imaging

1. 4T1 Zellen sind sehr aggressiv, so daß Inokulation von 1x10 ⁴ Zellen führt typischerweise zu tastbaren Tumorbildung in 1 Woche und der Letalität der Tiere innerhalb von 4-5 Wochen. 4T1 Tumoren haben eine inhärente Tendenz ulcerate in Woche 4. Das Wachstum und die Wartung von ulzeriert Tumoren erfordern separate IACUC Zustimmung. Die 4T1 Tumor Studien gezeigt haben hierin durch die IACUC an der Case Western Reserve University genehmigt worden.
2. Wie oben beschrieben, sollte Mäusen injiziert RediJect Coelenterazin wöchentlich auf allgemeine Tumorwachstum und Metastasierung zu überwachen, als auch mit D-Luciferin zu Stoffwechselweg-spezifischen Signalisierung während verschiedener Stadien der Tumorentwicklung überwachen. Achten Sie darauf, jedes Mal, um sicherzustellen, das Renilla Luciferase-Signal vollständig vor dem Erwerb abgeführtder Glühwürmchen-Luciferase-Signal.
3. Als 4T1 Tumoren entwickeln und Fortschritte sollte Renilla-Luciferase Akquisitionen auf die anfänglichen Werte Renilla zum Zeitpunkt der Inokulation der Tumorzellen als Mittel zur Normalisierung und verfolgen Primärtumorwachstums gemessen normalisiert werden. Noch wichtiger ist, wird die Berechnung RLR Werte über die Zeit erstellt die zeitliche Regelung der einzelnen Signalanlagen in Bezug auf das Tumorwachstum und Progression.
4. Offene Lungenmetastasen wird innerhalb von 3-4 Wochen deutlich nach 4T1 Engraftment auf die Brustfettpolster. Vergleichen pulmonalen RLR Werte im Vergleich zu denen der Primärtumor berechnet stellt die räumliche Regulierung einzelner Signalsysteme relativ zu Tumorwachstum und Metastase.

6. Dual-Bioluminescent Imaging of Two Einzigartige Zelltypen in einem einzigen Tier

1. Ingenieur ein Brustkrebs-Zelllinie, stabil Expression CMV-gesteuerte Renilla-Luciferase, wie oben beschrieben. Wiederholen Sie diesen VorgangEngineering-Prozess unter Verwendung CMV-gesteuerte Glühwürmchenluciferase auf einer zweiten unterschiedlichen Brustkrebszellinie.
2. Hier beschreiben wir gemischten Renilla-Luciferase-exprimierenden 4T1 Zellen mit ihren metastatischen und isogenen Glühwürmchen-Luciferase-exprimierenden 4T07 Gegenstücken ^{10, 11.} Unterschiedliche Verhältnisse von diesen gemischten Brustkrebs Zellpopulationen werden anschließend in das Brustfettpolster wie oben beschrieben injiziert.
3. Unmittelbar erwerben sowohl Glühwürmchen und Renilla Luciferase Bilder anfänglichen RLRS Vertreter einer bestimmten beimpft Zellgemisch etablieren.
4. Längs dualen biolumineszierenden Bildgebung visualisieren und Verfolgung von Änderungen in der zellulären Zusammensetzung innerhalb des primären Tumors als auch die Metastasierung von raumzeitlichen jeder Brustkrebs-Derivat, bezogen auf das Tumorwachstum und die Progression.
5. Alternativ können einzelne Brustkrebs Zellpopulationen in verschiedenen Orten in der Maus inokuliert (dh die rechte und linke abdominalen Euterfett Pads)die systemischen Einflüsse beurteilen diese beiden Populationen aufweisen übereinander während verschiedener Stufen des Tumorwachstums und der Metastasierung.

7. Repräsentative Ergebnisse:

Eine große Stärke der Dual-Biolumineszenz-Bildgebung liegt in der Tatsache, dass jedes Bild in sich konsistent und kontrolliert, so dass die kontinuierliche Signale aus dem Primärtumor Funktion als wichtige Kennzahl abgeleitet, um die gesamte Erfolg oder Misserfolg eines jeden Renilla und Glühwürmchen Übernahme abzuschätzen ist. Dieser Aspekt der bildgebenden Verfahren ist besonders wichtig während Akquisitionen der Aktivität von Renilla-Luciferase, dessen Substrat Coelenterazin sehr oxidationsempfindlich, die zu der Fähigkeit zum automatischen Lumineszenz. 1A zeigt ein Beispiel für diese Nebenwirkung, die sofort manifestiert sich als unspezifische lumineszierenden Signale aus dem Darmtrakt, nicht der etablierte Primärtumor stammt. Normalerweise meldet diese unspezifischen Coelenterazine transpire nach gescheiterter intravenöse Injektionen von diesem Renilla Luciferase Substrat. Sobald jedoch robuste primären tumorderivierten Renilla Signale erhalten wurden (1B, linkes Bild), ist es sicher, einzufangen Stoffwechselweg-spezifischen Signalisierung Messungen von bildgebenden Glühwürmchen-Luciferase (1B, rechtes Feld), dessen D-Luciferin abgeleitet vorgehen Substrat ist sehr stabil auf IP-Injektion und produziert vernachlässigbar geringen Pegeln von Hintergrund auto-Lumineszenz.

Abbildung 1. Acquiring Renilla und Glühwürmchen stammenden biolumineszierenden Bilder in vivo RLRS berechnen. (A) Ein Beispiel für einen fehlgeschlagenen IV Injektion von Coelenterazin wodurch unspezifische Signal aus dem Darmtrakt. Kreis und PT den ungefähren Standort des Primärtumors. (B) Eine erfolgreiche Renilla Erwerb einer Maus 4T1 ein Primärtumor und p tragendenulmonary Metastasen (links; 4WK nach Fettpolster Transplantation). Die entsprechende firefly Akquisition ermöglicht für die Berechnung der RLRS sowohl aus dem primären Tumor und seine Lungenmetastasen. (C) Grafische Darstellung des Primärtumors und Lungenmetastasen RLRS von Mäusen in Panel B gezeigt (n = 4) berechnet.

Discussion

Die absolute Macht der Biolumineszenz Bildgebung liegt in ihrer Fähigkeit, das Tumorwachstum und Metastasierung in komplexe Längsschnittstudien, die hierin beinhalteten die Verwendung von aggressiven 4T1 Brustkrebszellen zu quantifizieren. Da diese Verfahren für die stabile Integration der beiden Luciferase-Reporter-Konstrukte verlassen, können diese Techniken leicht angepasst werden und translatiert zu anderen Krebs-Zelllinien unterschiedlicher Tumor Latenzen und metastatischen Fähigkeiten. Ähnlich wie bei den hier gezeigten Ergebnisse, Berechnen spezifischen RLRS innerhalb langsam entwickelnden Primärtumoren und ihre eventuelle Metastasen ermöglicht die Echtzeit raumzeitlichen Identifizierung spezifischer Signalisierungsereignisse, die während des metastatischen Progression von Tumoren unabhängig von ihrer Dauer der Latenz durchsickern. Nach Identifizierung spezifischer Promotor regulatorischen Fall ist es wichtig, sowohl die primäre verbrauchsteuerpflichtigen Tumor und dessen metastatischen Läsionen für die Erfüllung der Norm immunhistochemischen und differential Genexpressionsanalysen zu überprüfen ähnliche Regelung des endogenen Gens und / oder Protein.

Technisch gesehen, die wichtigste Herausforderung der dualen Biolumineszenz Analysen liegt in der relativ kurzen Dauer der Renilla Luciferase Signale. Als solches erfordert dieses Bildgebungstechnik signifikante Optimierung der Schwanzvene Einspritzvorgang sowie die sofortige Bildgebung von einzeln injiziert Tiere, ein Prozess, zeitaufwändig und ineffizient etwas relativ zur Bildgebung Glühwürmchen-Luciferase ist. Kürzlich führte Promega "Viviren", die eine zweite Generation Luciferase Substrat, dessen Seiten der Oxidation werden durch Veresterung bis zu diesem Molekül Gewinne Eintritt in Zellen, an welchem ​​Punkt das Molekül schnell entesterten blockiert darstellt. Zusammengenommen diese neuartige Substrat wirksam senkt automatischen Lumineszenz und unspezifische Modifikation und / oder Abbau der mit Renilla-induzierten Lumineszenz ^auto-12. Dabei diese neue renilla Luciferasesubstrat produziert hellere lumineszierende Signale, aber die übermäßige Kosten, die mit dem Erwerb und der Verwendung von "Viviren" zugeordnet haben relativ wenige Studien notwendig, um den Gesamtnutzen dieses Substrats im Dual Biolumineszenz Analysen auszuwerten vorgesehen. Schließlich ist die Sensitivität jedes biolumineszierenden Assay entscheidend von der CCD-Kamera in operanten Erwerbs einzelner Lichteinheiten. In der Tat, wie diese Technologien zu verbessern, sehen wir einen Punkt in der Zukunft, in der unsere Fähigkeit, komplexe Licht-vermittelte Biolumineszenzreaktionen visualisieren schwitzen effizient kann in frei beweglichen Tieren ^13.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pGL4.2-Puro [luc2/Puro] Vector	Promega Corp.	E6751
Glomax Mult-idection system	Promega Corp.
IVIS 200 series	Caliper Life Sciences
Dual luciferase reporter Assay system	Promega Corp.	E1960
Rediject c–lenterazine-h	Caliper Life Sciences	760506
D-Luciferin K-Salt	Caliper Life Sciences	122796