In vivo Dual ondergrond Bioluminescent Imaging

Summary

Hierin beschrijven we de methoden om te bouwen, visualiseren en kwantificeren van de bioluminescente reacties van zowel vuurvlieg en Renilla luciferase enzymen uitgedrukt in gemetastaseerde borstkanker cellen tijdens hun groei en metastase

Abstract

Ons begrip van hoe en wanneer kankercellen in de borst doorvoer van gevestigde primaire tumoren bij metastasen is toegenomen in een uitzonderlijk tarief sinds de komst van bioluminescentie beeldvorming technologieën ^1-3. Inderdaad, de mogelijkheid te lokaliseren en kwantificeren lengterichting tumorgroei in een cohort van dieren voltooiing van de studie, in tegenstelling tot offeren afzonderlijke groepen dieren op bepaalde tijden assay heeft een revolutie hoe onderzoekers borstkanker metastase te onderzoeken. Helaas huidige methodologieën weg aan de real-time evaluatie van kritische veranderingen die tot uiting komen in cell signaling systemen borstkankercellen (i) evolueren in primaire tumoren (ii) verspreiden door het hele lichaam, en (iii) proliferatieve programma te hervatten op plaatsen van een metastatische laesie. De recente ontwikkelingen in bioluminescent imaging thans mogelijk om gelijktijdig kwantificeren specifieke spatiotemporal veranderingen in genexpressie als functie van tumoren en metastatische progressie via het gebruik van dubbele substraat luminescentie reacties. Hiertoe onderzoekers maken van twee licht-producerende enzymen die luciferase van de vuurvlieg (Photinus pyralis) en zee pansy (Renilla reniformis), die beide reageren op elkaar uitsluiten substraten die reeds hun wijdverspreide gebruik vergemakkelijkt in vitro cel gebaseerde assays reportergen ^4. Hier tonen we de in vivo bruikbaarheid van deze twee enzymen zodat een luminescentie reactie specifiek de grootte en locatie van een tumor ontwikkeling markeert, terwijl de tweede luminescerende reactie dient als middel om de activeringsstatus van specifieke signalen te visualiseren tijdens verschillende fasen tumor en metastase ontwikkeling. Zo zijn de doelstellingen van dit onderzoek zijn tweeledig. Eerst beschrijven we de stappen die nodig zijn om dual lichtgevende reporter cellijn construerens, evenals die nodig gebruik ervan te vergemakkelijken in het visualiseren van de tijdruimtelijke regulatie van genexpressie tijdens specifieke stappen van de metastatische cascade. Met het 4T1 model uitzaaiing van borstkanker, laten we zien dat de in vivo activiteit van een synthetische Smad Inbind (SBE) promoter sterk was verminderd in longmetastasen in vergelijking met die gemeten in de primaire tumor ^4-6. Onlangs werd borstkanker metastase wordt gereguleerd door veranderingen in de primaire tumor micro-omgeving en reactief stroma, ook die welke zich in fibroblasten en infiltrerende immuuncellen ^7-9. Dus zal ons tweede doelstelling is het nut van dubbele bioluminescent technieken toezicht de groei en lokalisatie van twee unieke celpopulaties geherbergd binnen een dier tijdens borstkanker groei en metastase tonen.

Protocol

1. Stabiele expressie van CMV-Driven Renilla Luciferase

1. Transfectie en selectie van een stabiele klonale populatie is de voorkeur voor expressie van deze Renilla luciferase reporter. Deze benadering levert een meer consistente en uniforme Renilla luciferase expressie na de latere invoering van additionele secundaire reporter constructen (bijvoorbeeld vuurvlieg luciferase of fluorescerende eiwitten).
2. Transfecteren kwaadaardige cellen plaats met de expressievector codeert Renilla luciferase, zoals pcDNA3.1-Hygro of een ander plasmide een selecteerbare marker.
3. Na transfectie, plaatst de transfectanten onder een geoptimaliseerde antibioticumconcentratie enkele dagen te weken isolatie van afzonderlijke kolonies, die vervolgens afzonderlijk geïsoleerd en overgeënt vergemakkelijken.
4. Selecteer ≥ 10 individuele Renilla luciferase-expressie kolonies zover van Renilla expressie controleren.
(i) pathofysiologische eigenschappen van de ouderlijke tegenpartijen blijven, en (ii) Renilla expressiewaarden niet afwijken of veranderen. Deze stappen zijn absoluut noodzakelijk om te voorkomen dat het isoleren en het bestuderen van klonale varianten / devianten, en voor een goede integratie van de Renilla constructie te valideren in het genoom.
5. Zodra een stabiele transfectant is geïsoleerd en gecontroleerd kan men verwijderen selectieve druk en worden verzekerd dat de expressie van Renilla luciferase constant blijft gedurende langere tijdsperioden zowel in vitro als in vivo.

2. Expression-, selectie-, en functionele controle van induceerbare promoter-Driven Firefly Luciferase

1. Subkloon de promoter van belang in een pGL4-luciferase reporter plasmide een selecteerbare merker (bijvoorbeeld puromycin) die verschilt van die van het selecteren op stabiele expressie Renilla (bijv. hygromycine).
2. Transfecteren kwaadaardige cellen in stap I en vervolgens selecteren voor een stabiele polyklonale populatie van vuurvlieg luciferase tot expressie brengende cellen. Omdat de locatie waar een rapport gen integreert in het genoom kan uitlokken foutieve effecten op de expressie en regulatie, is het sterk aan te raden om te kiezen voor polyklonale populaties van vuurvlieg luciferase-expressie brengen, in tegenstelling tot klonale populaties om dat (i) reportergen meningsuiting veel nauwkeuriger dat van het endogene gen in oudercellen en (ii) integratie effecten op genexpressie worden gemiddeld en verminderd in de heterogene celpopulatie.
3. Kwaadaardige cellen ontwikkeld om stabiel tot expressie zowel Renilla en vuurvlieg luciferasen worden gezamenlijk aangeduid als dual bioluminescent reporter cellen, of DBR cellen.
4. Het gebruik van traditionele <em> in vitro cel-gebaseerde assays luciferase reportergen te controleren of het DBR cellen vuurvlieg luciferase expressie reguleren, positief of negatief, op een wijze overeenstemmend met die waargenomen in ouderlijke cellen tijdelijk getransfecteerd met deze vectoren. Ook controleert u of CMV-driven uitdrukking van Renilla niet wordt geregeld door verschillende cel stimulaties of behandeling.
5. Hiervoor cultuur DBR en ouderlijke cellen in 24-well platen en vervolgens tijdelijk co-transfecteren parentale cellen met de originele CMV-promoter en Renilla-firefly constructen gebruikt voor DBR cellen te genereren.
6. Daarna behandelen DBR en getransfecteerde cellen met ouderlijke factoren of farmacologische middelen waarover de promoter van belang te reguleren en vervolgens kwantificeren vuurvlieg en Renilla luminescentie met de Promega Dual Luciferase Assay Kit.

3. Tot oprichting van 4T1 Primaire mammatumoren

1. Gemetastaseerd mammacarcinoom 4T1 cellen die weopnieuw blijkt gebrek adventitia knaagdier pathogenen werden om een ​​stabiel tot expressie CMV aangedreven Renilla luciferase (pcDNA3.1-CMV-Renilla luciferase-hygro) en SBE-driven firefly luciferase (pGL4.2-SBE-firefly luciferase-puro) als hierboven beschreven. Orthotopische implantatie van deze borstkankercellen resulteert in de vorming van spontane metastasen hoofdzakelijk in de longen.
2. 4T1 cellen mag niet tot confluentie bereiken tijdens hun voortplanting in de traditionele 2-dimensionale weefselkweek systemen, en ze moeten worden gepasseerd op de dag voor hun in vivo inenting.
3. 4T1 cellen moeten worden losgemaakt door trypsinisatie, grondig gewassen in groeimedia, en verdund in PBS tot een concentratie van 2x10 ⁵ cellen / ml en direct op ijs bewaard.
4. Vrouwelijke Balb / C muizen (4-6 weken oud) moet verdoofd met een inductie dosis van 3% isofluraan en gehandhaafd onder anesthesie met een dosis van 1% isofluraan. Bereid de injectieplaats door zwabberen met70% isopropylalcohol. Met behulp van een tang voorzichtig grijpen en tillen de 4e lies borst pad. Voorzichtig, plaats een 27,5 gauge naald schuine kant naar boven en injecteer in het uiervet pad direct onder de tepel, waarbij speciale zorg niet duw de naald in de buikholte. Laat de klier en langzaam 50 pi van de celsuspensie (1x10 ⁴ cellen) te injecteren in de uiervet pad.

4. De eerste Dual Luminescent Imaging

1. Onmiddellijk na enting 4T1 cellen op de uiervet pad en terwijl de muizen nog verdoofd, 100 ul RediJect Coelenterazine injecteren in de laterale staartader. Dit is de optimale substraatconcentratie aanbevolen door de fabrikant en de beste verdragen door het dier.
2. Onmiddellijk Plaats de muis in de isofluraan neuskegel binnen de IVIS-200 imaging systeem en het verwerven van een 0,5-1 minuten luminescent beeld. Efficiency tussen injectie en beeldacquisitie is zeer belangrijk, omdat het signaalvoor Renilla luciferase verlaagt precipitously ~ 30 seconden na injectie. Plaats de muis in zijn kooi en laten herstellen gedurende ≥ 1 uur, die ervoor zorgt dat het resterende Renilla luciferase-signaal is verdwenen en dat de muis is volledig hersteld van de narcose.
3. Dien 150 mg / kg van D-luciferine kaliumzout via IP injectie en wacht 5 minuten. Dit is de optimale concentratie van D-luciferine, die een stabiele luminescerende signaal 5-15 minuten na de injectie in proefdieren bepaald. Verdoof de muis met behulp van isoflourane en vervangen in de IVIS-200, en zorg ervoor dat het dier te positioneren in een zeer vergelijkbare positie ten opzichte van de oorspronkelijke Renilla overname. De totale intensiteit van de vuurvlieg signaal is afhankelijk van de activiteit van de promoter van belang, en als zodanig visualiseren vuurvlieg luciferase activiteit vereisen langere Zoektijden.
4. Met behulp van de IVIS Living Image software ingesteld op "fotonen"-modus, tot stand waardevollees voor zowel de Renilla en vuurvlieg overnames als een middel om de uitgangswaarde relatieve luminescentie verhoudingen (RLR) vast te stellen.

5. Longitudinale Luminescent Imaging

1. 4T1 cellen zijn zeer agressief, zodat inoculatie van 1x10 ⁴ cellen leidt vaak tot vorming palpabele tumor binnen 1 week, en de letaliteit van de dieren binnen 4-5 weken. 4T1 tumoren hebben een inherente neiging zweren in week 4. De groei en het onderhoud van zwerende tumoren kan aparte IACUC goedkeuring. De 4T1 tumor studies hierin weergegeven zijn goedgekeurd door de IACUC aan de Case Western Reserve University.
2. Zoals hierboven beschreven, moet muizen worden geïnjecteerd wekelijks RediJect Coelenterazine algemene tumorgroei en metastase te controleren, en met D-luciferine aan route-specifieke signalering bewaken tijdens verschillende stadia van tumoren. Let erop elke keer om ervoor te zorgen de Renilla luciferase signaal voorafgaand volledig verdwenen de verwervingvan de vuurvlieg luciferase signaal.
3. Zoals 4T1 tumoren en voortgang dient Renilla luciferase acquisities worden genormaliseerd naar de oorspronkelijke Renilla gemeten bij de tumorcel inoculatie als middel te normaliseren en volgen primaire tumorgroei. Nog belangrijker is dat de berekening RLR waarden in de tijd stelt de temporele regulering van individuele signaleringssystemen opzichte van tumorgroei en progressie.
4. Openlijke pulmonale metastase blijkt binnen 3-4 weken na 4T1 cellen aanslaan op het uiervet pad. Vergelijking pulmonale RLR waarden tegen die zijn berekend voor de primaire tumor wordt de ruimtelijke regulering van individuele signaleringssystemen opzichte van tumorgroei en metastase.

6. Dubbele Bioluminescent Imaging van twee unieke celtypes in een enkel dier

1. Engineer een borstkanker cellijn stabiel expressie CMV aangedreven Renilla luciferase zoals hierboven beschreven. Herhaal dezeontwikkelingsproces met CMV aangedreven vuurvlieg luciferase op een tweede afzonderlijke borstkankercellijn.
2. Hierin we gemengde Renilla luciferase-expressie 4T1 cellen met hun isogene gemetastaseerde en vuurvlieg luciferase-expressie 4T07 tegenhangers ^{10, 11.} Variërende verhoudingen van deze gemengde borstkanker celpopulaties worden vervolgens geïnjecteerd in de uiervet pad zoals hierboven beschreven.
3. Onmiddellijk verwerven zowel vuurvlieg en Renilla luciferase afbeeldingen om de eerste RLRs vertegenwoordiger van een bepaalde geënt celmengsel vast te stellen.
4. Longitudinale dual bioluminescent beeldvorming visualiseren en opsporen van wijzigingen in de cellulaire samenstelling in de primaire tumor alsook de tijdruimtelijke metastase van elk borstkanker afgeleide opzichte van tumorgroei en progressie.
5. Alternatief kunnen individuele borstkanker celpopulaties worden geënt in verschillende locaties in de muis (de rechter en linker buik uiervet pads)de systemische invloeden beoordelen deze twee populaties vertonen over elkaar tijdens verschillende stadia van tumorgroei en metastase.

7. Representatieve resultaten:

De kracht van dual bioluminescent imaging ligt in het feit dat elk beeld is intern consistent en gecontroleerd, zodat de verdere signalen afgeleid uit de primaire tumor functie als een belangrijke maatstaf voor het succes of falen van elk Renilla en vuurvlieg acquisitie meten. Dit aspect van de imaging procedure is bijzonder belangrijk tijdens verwerving van de activiteit van Renilla luciferase, waarvan Coelenterazine substraat zeer gevoelig voor oxidatie die resulteert in het vermogen om auto-luminescentie. Figuur 1A toont een voorbeeld van deze bijwerking, die onmiddellijk manifesteert als aspecifieke luminescerende signalen afgeleid uit het darmkanaal, niet de gevestigde primaire tumor. Kenmerkend voor deze niet-specifieke Coelenterazine signaleert transpire na gefaalde intraveneuze injecties met deze Renilla luciferase substraat. Echter, zodra robuuste primaire tumor afkomstig Renilla signalen verkregen (fig. 1B, linker afbeelding), is het veilig om verder in vastleggen route-specifieke signalering metingen uit imaging vuurvlieg luciferase (fig. 1B, rechter paneel), waarvan de D-luciferine substraat is zeer stabiel op IP-injectie en produceert verwaarloosbare niveaus van de achtergrond auto-luminescentie.

Figuur 1. Verwerven Renilla en vuurvlieg-afgeleide bioluminescent beelden te berekenen in vivo RLRs. (A) Een voorbeeld van een mislukte IV injectie van Coelenterazine resulteert in niet-specifieke signaal uit het darmkanaal. Cirkel en PT geven de geschatte locatie van de primaire tumor. (B) Een succesvolle Renilla aankoop van een muis een 4T1 primaire tumor en p dragenulmonary metastasen (linker paneel; 4wk na vetkussentje implantatie). De overeenkomstige firefly overname stelt voor de berekening van RLRs binnen de primaire tumor en de longmetastasen. (C) Grafische weergave van de primaire tumor en longmetastasen RLRs berekend uit muizen getoond in paneel B (n = 4).

Discussion

De absolute kracht van bioluminescent beeldvormingstechnieken ligt in hun vermogen om tumorgroei en metastase in complexe longitudinale studies, die hier bij het gebruik van agressieve 4T1 borstkankercellen kwantificeren. Omdat deze procedures gebaseerd op de stabiele integratie van luciferase reporter constructen kunnen deze technieken gemakkelijk worden aangepast en vertaald naar andere kankercellijnen van verschillende tumor latencies en metastatische mogelijkheden. Vergelijkbaar met de resultaten hierin getoond, berekening van het specifieke RLRs binnen langzaam ontwikkelende primaire tumoren en hun metastasen uiteindelijke maakt het real-time spatiotemporele dat specifieke signaleringsgebeurtenissen die tot uiting komen in de metastatische progressie van tumoren ongeacht de duur van latency. Na identificatie van specifieke promoter regulerende gebeurtenissen, is het belangrijk om accijns zowel de primaire tumor en metastasen voor het uitvoeren van standaard immunohistochemische en differentiatiel genexpressie analyses vergelijkbare regulering van de endogene gen en / of eiwit verifiëren.

Technisch gezien is de belangrijkste uitdaging van de dubbele bioluminescente analyses ligt in de relatief korte duur van de Renilla luciferase signalen. Als zodanig is deze beeldvormende techniek is significant optimalisatie van de staartader injectie procedure, evenals de onmiddellijke imaging individueel geïnjecteerde dieren, een proces dat is tijdrovend en inefficiënt enigszins ten opzichte imaging vuurvlieg luciferase. Onlangs geïntroduceerd Promega "Viviren", die een tweede generatie luciferase substraat de sites van de oxidatie worden geblokkeerd door verestering tot deze molecule zich toegang tot cellen, waarna de molecule snel gedeësterificeerd vertegenwoordigt. Gezamenlijk deze roman substraat verlaagt effectief auto-luminescentie en niet-specifieke modificatie en / of afbraak gekoppeld aan Renilla-geïnduceerde auto-luminescentie ^12. Daarbij deze nieuwe renilleen luciferase substraat produceert heldere lichtgevende signalen, maar de hoge kosten verbonden aan de verwerving en het gebruik van "Viviren" hebben relatief weinig onderzoek dat nodig is om de totale nut van dit substraat in dual bioluminescente analyses te evalueren. Tenslotte de gevoeligheid van elke assay bioluminescent is kritisch afhankelijk van de CCD camera operant in het verwerven van individuele lichtunits. Inderdaad, zoals deze technologieën te verbeteren, voorzien we een punt in de toekomst waar ons vermogen om complexe licht-gemedieerde bioluminescente reacties te visualiseren kan efficiënt tot uiting komen in vrij bewegende dieren ^13.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pGL4.2-Puro [luc2/Puro] Vector	Promega Corp.	E6751
Glomax Mult-idection system	Promega Corp.
IVIS 200 series	Caliper Life Sciences
Dual luciferase reporter Assay system	Promega Corp.	E1960
Rediject c–lenterazine-h	Caliper Life Sciences	760506
D-Luciferin K-Salt	Caliper Life Sciences	122796