Summary
Bu yazıda onların büyüme ve metastaz sırasında metastatik meme kanseri hücrelerinde ifade böceği ve Renilla lusiferaz enzimler hem bioluminescent reaksiyonları, inşa görselleştirmek ve ölçmek için yöntemler tarif
Abstract
Nasıl ve ne zaman metastatik sitelere kurulan primer tümörlerden meme kanseri hücrelerinin Transit vivo bioluminescent görüntüleme teknolojileri 1-3 gelişiyle bu yana olağanüstü bir oranda artmıştır anlayışımız. Nitekim, araştırmacılar meme kanseri metastazı araştırmak nasıl devrim yarattı belirli tahlil zamanlarda hayvanların bireysel gruplara feda aksine çalışmanın tamamlanması için hayvanların tek bir kohort uzunlamasına tümör büyümesini bulmak ve ölçmek için yeteneği. Ne yazık ki, mevcut metodoloji meme kanseri hücrelerinin (i), primer tümörler içinde gelişmeye (ii) gövde boyunca yaymak, ve (iii) bir bölgelerinde proliferatif program yeniden başlatmak gibi hücre sinyalizasyon sistemi içinde sızmak kritik değişikliklerin gerçek-zaman değerlendirme önlemek metastatik lezyon. Ancak, bioluminescent görüntüleme son gelişmeler artık mümkün aynı anda belirli spatiotempor ölçmek için yapmakal çift alt tabaka ışıldama reaksiyon kullanımı ile tümör gelişimi ve metastaz ilerleme bir fonksiyonu olarak gen ekspresyonu değiştirir. Bunu yapmak için, araştırmacılar daha önce in vitro hücre onların yaygın kullanımını kolaylaştırmıştır dışlayan yüzeylerde tepki ikisi de ateş böceği (Photinus pyralis) ve deniz pansy (Renilla reniformis), izole iki ışık üreten lusiferaz enzimler için yararlanmak tabanlı raportör gen deneyleri 4. Burada ikinci Işıklı reaksiyon tümör farklı aşamalarında belirli sinyalizasyon sistemlerinin etkinleştirme durumunu görselleştirmek için bir araç olarak hizmet ederken bir lüminesans reaksiyon özellikle büyüklüğü ve gelişmekte olan bir tümörün yerini işaretler böyle bu iki enzim vivo programında göstermek ve metastaz gelişimi. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, iki kat vardır. Öncelikle, biz ikili bioluminescent muhabiri hücre hattı inşa etmek için gerekli adımları anlatacağızs, hem metastatik kaskadı spesifik adımlar boyunca gen ekspresyonunun düzenlenmesi zamanmekansal görselleştirme kullanımını kolaylaştırmak için gerekli olanlar gibi. Meme kanseri metastazı 4T1 modeli kullanarak, primer tümörün 4-6 ölçülen karşılaştırmalı olarak bir sentetik Smad Bağlama Elemanı (SBE) in vivo aktivite promotor pulmoner metastazı dramatik azalma olduğunu göstermektedir. Son zamanlarda meme kanseri metastazı olan fibroblastlar meydana gelen ve bağışıklık hücreleri 7-9 infiltre dahil primer tümör mikro ve reaktif stroma içinde değişiklikler ile düzenlenir gösterilmiştir. Böylece, ikinci hedefi ise meme kanseri büyüme ve metastaz sırasında tek bir hayvan içinde barındıran benzersiz iki hücre popülasyonlarının büyüme ve yerelleştirme izlenmesinde ikili bioluminescent tekniklerin yararlılığını ortaya olacaktır.
Protocol
1. CMV-Driven Renilla Lusiferaz Kararlı Anlatım
- Istikrarlı bir klonal nüfus Transfeksiyon ve seçimi bu Renilla lusiferaz muhabir ifade için tercih edilen yöntemdir. Bu yaklaşım, ek ikincil muhabiri yapıları (örn., ateşböceği lusiferaz veya floresan proteinleri) müteakip açıklanması sonrasında, daha tutarlı ve düzgün Renilla lusiferaz ifadesi verir.
- Bu tür pcDNA3.1-rutubet ya da başka bir plasmid barındıran bir seçilebilir işaretleyici olarak ifade vektörü Renilla lusiferaz kodlama ile ilgi habis hücreleri transfekte.
- Transfeksiyon takiben sonradan bireysel ve pasaj izole bireysel koloniler, üzerindeki izolasyonu kolaylaştırmak için gün-to-hafta birkaç için optimize edilmiş bir antibiyotik konsantrasyonu altında transfektanları yerleştirin.
- Renilla ifade ölçüde izlemek için ≥ 10 bireysel Renilla lusiferaz ifade koloniler seçin.
- Bir kararlı transfectant izole edilir ve doğrulandıktan sonra, bir selektif basınç kaldırmak ve Renilla lusiferaz ifadesi, in vitro ve in vivo hem de uzun uzunluklar üzerinde sabit kalır emin olun.
2. İfade, Seçim ve indüklenebilir Promoter-Driven Firefly Lusiferaz Fonksiyonel Doğrulama
- (Örneğin, pur, seçilebilir bir işaretleyici barındıran bir plazmid pGL4-lusiferaz raportör içine ilgi promotörü Subclonekararlı Renilla ifadesi (örneğin, higromisin) için seçmek için kullanılan farklı olduğu omycin).
- Adım I de olduğu gibi habis hücrelerin transfekte, ve daha sonra ateş böceği lusiferaz-salgılayan hücrelerin bir kararlı poliklonal nüfus için seçmek. Bir rapor gen genom içine entegre konumu, ifade ve düzenleme üzerinde hatalı etkisi oluşturabilmek Çünkü, güçlü, (i) muhabiri gen ekspresyonu sağlamak için klonal popülasyonları aksine ateşböceği lusiferaz-salgılayan hücrelerin poliklonal popülasyonlar için seçmeniz önerilir daha doğru ebeveyn hücrelerde endojen gen yansıtır ve (ii) gen ekspresyonu üzerindeki etkileri entegrasyonu heterojen hücre popülasyonu arasında ortalama ve azalır.
- Stabil Renilla ve ateş böceği luciferases her ikisi de ifade etmek için tasarlanan malign hücreler toplu olarak ikili biyolüminesens raportör hücre veya DBR hücreler olarak ifade edilir.
- Geleneksel kullanımı <em> in vitro hücre tabanlı lusiferaz muhabiri gen deneylerinde, DBR hücreleri ateşböceği lusiferaz ifade düzenleyen doğrulamak, olumlu veya olumsuz, geçici bu vektörler ile transfekte ebeveyn hücrelerinde gözlenen ile uyumlu bir şekilde. Aynı şekilde, Renilla arasında CMV güdümlü ifadesi çeşitli hücre stimülasyonu veya tedavi koşulları tarafından düzenlenir olmadığını doğrulayın.
- 24-kuyucuğu, bu yüzden kültür DBR ve ebeveyn hücreler yapmak için, ve CMV-Renilla orijinal ve promotor-böceği ile sonradan geçici ko-transfekte ebeveyn hücreler DBR hücreleri oluşturmak için kullanılır oluşturur.
- Daha sonra, DBR ve faiz organizatörü düzenleyen ve daha sonra ateş böceği ve Promega Çift Lusiferaz Assay Kit kullanarak Renilla lüminesans ölçmek için bilinen risk faktörleri ya da farmakolojik ajanlar ile transfekte ebeveyn hücreler tedavi.
3. 4T1 Primer Meme Tümörleri Kurulması
- Metastatik meme karsinomu 4T1 hücreleri kieksikliği adventisyal kemirgen patojenlere bulundu yeniden stabil bir CMV-güdümlü Renilla lusiferaz (pcDNA3.1-CMV-Renilla lusiferaz-rutubet) ve SBE-güdümlü ateşböceği lusiferaz (pGL4.2-SBE-ateşböceği lusiferaz-puro) olarak ifade geliştirilmişti Yukarıda açıklandığı gibi. Öncelikle akciğer içinde kendiliğinden metastaz oluşumu, bu meme kanseri hücrelerinin sonuç Ortotopik melezleşmesi.
- 4T1 hücreleri, geleneksel 2 boyutlu doku kültürü sistemlerinde bunların yayılması sırasında izdiham ulaşmak için izin verilmemelidir, ve onların in vivo aşılama önceki gün pasajlanmağa edilmelidir.
- 4T1 hücreleri tripsinizasyonla ile ayrılamaz, büyüme ortamı içinde iyice yıkandı ve 2x10-5 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon ile PBS içinde seyreltilmiş ve hemen buz üzerinde saklanır gerekir.
- Erkek Balb / c farelerinin (4-6 haftalık) izofluran ve% 1 izofluran bir dozda anestezi altında tutulan% 3 arasında bir indüksiyon dozu ile anestetize olmalıdır. Ile silmeli enjeksiyon yerinde hazırlayın% 70 izopropil alkol. Bir forseps kullanarak, hafifçe kavrayın ve 4. inguinal meme pedi çıkarın. Dikkatlice, 27,5 iğne konik tarafı yukarı yerleştirin ve karın boşluğuna iğne itmeyin özel bakımı, doğrudan meme altındaki meme yağ yastığı içine enjekte edilir. Bezi bırakın ve yavaşça meme yağ yastığı içine hücre süspansiyonu (1x10 4 hücreleri) 50 ul enjekte.
4. İlk Çift Luminescent Görüntüleme
- Hemen memenin yağlı pedine üzerine 4T1 hücreleri engrafting ve sonra fareler henüz anestezi iken, yanal kuyruk damarı içine RediJect Coelenterazine 100 ul enjekte edilir. Bu hayvan tarafından tolere satıcı ve en iyi tarafından önerilen optimum substrat konsantrasyonu.
- Hemen IVIS-200 görüntüleme sistemi içinde izofluran burun konisi içine fare koyun ve 0.5-1 dakikalık parlak görüntü elde. Enjeksiyon ve görüntü elde etme arasındaki Verimlilik sinyali olarak, çok önemlidirRenilla lusiferaz için precipitously düşer ~ 30 saniye enjeksiyon sonrası. Onun kafesine geri fare yerleştirin ve herhangi bir kalıntı Renilla lusiferaz sinyal harcanmış olduğunu ve fare tam anestezi kurtarıldı sağlar ≥ 1 saat için kurtarmak için izin verir.
- IP enjeksiyon yoluyla 150 mg / D-luciferase potasyum tuzu kg Yönet ve 5 dakika bekleyin. Bu, test hayvanları içine enjeksiyondan sonra 5-15 dakika boyunca sabit bir lüminesan sinyali sağlar D-lusiferin, en uygun konsantrasyon. Isoflourane kullanılarak fare anestezisi ve IVIS-200 yerine, özgün Renilla edinimi için göreli bir çok benzer bir konumda konumlandırmak için hayvan bakımı. Bu firefly sinyalin genel yoğunluk ilgi promotör aktivitesi bağlıdır, ve gibi, görselleştirme ateşböceği lusiferaz aktivitesini uzun edinme süreleri gerektirebilir.
- "Fotonlar" moduna IVIS Yaşayan Image yazılımı kullanarak, valu oluşturmakRenilla ve bazal bağıl ışıma oranları (RLR) kurmak için bir araç olarak ateşböceği devralmalar hem es.
5. Boyuna Luminescent Görüntüleme
- 4T1 hücreleri son derece agresif, 1x10 4 hücre şekilde aşılama genellikle 1 hafta içinde palpabl tümör oluşumuna yol açar, ve 4-5 hafta içinde hayvan ölümcül için. 4T1 tümörleri haftada 4 içsel bir eğilim ülser var. Ülsere tümör büyümesi ve bakımı ayrı IACUC onaylanması gerekebilir. Burada gösterilen 4T1 tümör çalışmaları Case Western Reserve Üniversitesi'nde IACUC tarafından onaylanmıştır.
- Yukarıda tarif edildiği gibi, genel olarak farelerde tümör büyümesini ve metastazı kontrol etmek, hem de D-lusiferin ile olduğu gibi tümör gelişiminin çeşitli aşamalarında özel sinyalleme yolunun izlenmesi için RediJect Coelenterazine ile haftalık enjekte edilmelidir. Renilla lusiferaz sinyal tamamen alımı öncesinde buharlaşıncaya sağlamak için her zaman özenfirefly lusiferaz sinyal.
- 4T1 tümörleri geliştirmek ve ilerleme olarak, Renilla lusiferaz devralmalar primer tümörün büyümesi normalleştirmek ve izlemek için bir araç olarak tümör hücre inokülasyon sırasında ölçülen başlangıç Renilla değerleri normalize edilmelidir. Daha da önemlisi, zamanla RLR değerlerini hesaplama tümör büyümesi ve ilerlemesi göreli bireysel sinyalizasyon sistemlerin zamansal düzenleme kuracak.
- Aşikar pulmoner metastaz meme yağ yastığı üzerine 4T1 hücre uyumunu takip eden 3-4 hafta içinde belirgin hale gelir. Primer tümör için hesaplanan sonuçlarla karşı pulmoner RLR değerleri karşılaştırarak tümör büyümesi ve metastaz oranla bireysel sinyalizasyon sistemlerin mekansal düzenlemesi kurar.
6. Tek Hayvan İki Benzersiz Hücre Tipleri Çift Bioluminescent Görüntüleme
- Yukarıda açıklandığı gibi stabil ifade CMV odaklı Renilla lusiferaz için Mühendisi biri meme kanseri hücre hattı. Bu işlemi tekrarlayınİkinci belirgin meme kanseri hücre hattında CMV odaklı ateşböceği lusiferaz kullanarak mühendislik süreci.
- Bu yazıda karışık Renilla lusiferaz ifade onların nonmetastatik ve izogenik ateşböceği lusiferaz eksprese 4T07 meslektaşları 10, 11 ile 4T1 hücreleri. Bu karma meme kanseri hücre popülasyonlarının farklı oranlarda daha sonra yukarıda tarif edildiği gibi memenin yağlı pedine içine enjekte edilir.
- Derhal verilen inoküle hücre karışımı ilk RLRs temsilcisi kurmak böceği ve Renilla lusiferaz görüntüleri hem kazanır.
- Uzunlamasına çift biyolüminesans görüntüleme görselleştirmek ve ana tümör içerisinde hücresel bileşiminde değişiklikler yanı sıra, tümör büyümesi ve ilerlemesi için göreli her meme kanseri türevi zamanmekansal metastaz takip edecektir.
- Alternatif olarak, bireysel meme kanseri hücre popülasyonlarının (sağ ve sol karın meme yağ yastıkları gibi) fare farklı yerlerde inoküle edilebilirsistemik etkileri değerlendirmek için bu iki popülasyonun tümör büyümesi ve metastaz çeşitli aşamalarında birbiri üzerinde sergileyecek.
7. Temsilcisi Sonuçlar:
Çift bioluminescent görüntüleme büyük bir gücü her görüntü tutarlı ve kontrollü bir önemli ölçüt olarak primer tümörün fonksiyonu türetilmiştir sürekli sinyaller her Renilla ve ateşböceği iktisap genel başarı veya başarısızlık ölçmek için böyle olduğu gerçeği yatıyor. Görüntüleme prosedürü bu yönü Coelenterazine substrat oksidasyonu son derece duyarlıdır Renilla lusiferaz, faaliyetinin satın almalar sırasında özellikle önemli olduğu oto-ışıldama yeteneği ile sonuçlanır. Şekil 1A hemen bağırsak değil, köklü primer tümörün türetilen nonspesifik Işıklı sinyaller olarak tezahür Bu yan etki, bir örnek gösterilmektedir. Genelde, bu nonspesifik Coelenterazine transpir sinyalleriE Aşağıdaki bu Renilla lusiferaz substrat intravenöz enjeksiyonlar başarısız oldu. Ancak, bir kez sağlam primer tümör kaynaklı Renilla sinyalleri (Şekil 1B, sol görüntü) elde edilmiştir, kimin D-luciferase görüntüleme ateşböceği lusiferaz (Şekil 1B, sağ panel), türetilen yolak spesifik sinyal ölçümleri yakalayan devam etmek güvenlidir substrat IP enjeksiyonu üzerine son derece istikrarlı ve arka plan otomatik lüminesans önemsiz düzeylerde üretmektedir.
Şekil 1. Renilla ve bağırsak nonspesifik sinyal sonuçlanan Coelenterazine başarısız bir IV enjeksiyon böceği-türetilmiş vivo RLRs yılında hesaplamak için bioluminescent görüntüleri. (A) Bir örnek alınıyor. Çember ve PT primer tümörün yaklaşık konumunu gösterir. (B) bir fare başarılı Renilla edinimi bir 4T1 primer tümör ve p taşıyanulmonary metastaz (sol panel; yağ yastığı engraftman sonra 4wk). İlgili ateşböceği edinimi primer tümörü ve akciğer metastazları hem RLRs hesaplamak için izin verir. Panel B gösterilmiştir fareler (n = 4) hesaplanan (C) primer tümörün grafiksel gösterimi ve pulmoner metastazı RLRs.
Discussion
Bioluminescent görüntüleme tekniklerinin mutlak güç Burada agresif 4T1 meme kanseri hücrelerinin kullanımı dahil karmaşık uzunlamasına çalışmalar, tümör büyümesi ve metastaz ölçmek için kendi yeteneği yatıyor. Bu işlemler hem lusiferaz muhabiri yapıları stabil entegrasyonu dayandıklarından bu teknikleri kolaylıkla adapte ve tümör latans ve metastatik yetenekleri değişen diğer kanser hücre hatları tercüme edilebilir. Burada gösterilen sonuçlar benzer şekilde, yavaş primer tümörleri ve onların nihai metastaz gelişmekte olan belirli RLRs hesaplanmasında gecikme sürelerine bakılmaksızın tümörlerin metastatik ilerlemesi esnasında sızmak belirli sinyal olayların gerçek zamanlı zamanmekansal tanımlama sağlar. Spesifik promotor düzenleyici olayların belirlenmesi üzerine, bunun tüketim primer tümör ve metastatik lezyonların standart immunohistokimyasal icrasında ve differentia hem önemlidirl gen ekspresyonunu analiz endojen genin ve / veya protein benzer düzenleme doğrulamak için.
Teknik olarak ikili bioluminescent analizlerin birincil sorun Renilla lusiferaz sinyalleri nispeten kısa süre içinde yatıyor, konuşma. Bu nedenle, bu görüntüleme tekniği kuyruk damarından enjeksiyon işleminin önemli bir iyileştirme, aynı zamanda ayrı ayrı enjekte edilen hayvanların hemen görüntüleme, zaman görüntüleme ateş böceği lusiferaz için alıcı ve biraz verimsiz göreceli olan bir işlem gerektirir. Son zamanlarda, Promega oksidasyon siteleri molekülü hızla de-esterifiye hangi noktada hücreler içine bu molekülün kazandığı girinceye kadar esterleşme tarafından engellenen bir ikinci nesil lusiferaz substratı temsil "Viviren," tanıtıldı. Topluca, bu roman substrat etkili Renilla bağlı oto-lüminesans 12 akuple otomatik ışıldama ve nonspesifik modifikasyonu ve / veya bozulması düşürür. Bunu yaparken, bu yeni renillBir lusiferaz substratı parlak ışıltılı sinyalleri üretir, ancak "Viviren" edinimi ve kullanımı ile bağlantılı aşırı maliyetler çift bioluminescent analizlerde bu substrat genel yararını değerlendirmek için gerekli görece az sayıda çalışma hazırladık. Son olarak, herhangi bioluminescent testin duyarlılığı ayrı aydınlatma üniteleri edinme edimsel CCD kamera üzerine eleştirel bağlıdır. Bu teknolojiler geliştirmek Nitekim, biz karmaşık ışık aracılı bioluminescent reaksiyonlar görselleştirmek için yeteneğimizi serbest hareket eden hayvanlar 13 verimli sızmak olabilir gelecekte bir noktada öngörüyoruz.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
MKW bir tarafından desteklenen ise WPS Ulusal Sağlık Enstitüleri (CA129359), Cure Vakfı (BCTR0706967), Savunma Bakanlığı (BC084561) ve Seidman Kanser Merkezi için Susan G. Komen, hibe tarafından kısmen desteklenmiştir Amerikan Kanser Derneği (PF-09-120-01) den burs. Bu iş için ek destek Görüntüleme Araştırma Vaka Merkezi, Olgu Kapsamlı Kanser Merkezi (P30 CA43703) ve Kistik Fibrozis Merkezi (P30 DK027651) tarafından sağlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pGL4.2-Puro [luc2/Puro] Vector | Promega Corp. | E6751 | |
| Glomax Mult-idection system | Promega Corp. | ||
| IVIS 200 series | Caliper Life Sciences | ||
| Dual luciferase reporter Assay system | Promega Corp. | E1960 | |
| Rediject c–lenterazine-h | Caliper Life Sciences | 760506 | |
| D-Luciferin K-Salt | Caliper Life Sciences | 122796 |
References
- Wetterwald, A. Optical imaging of cancer metastasis to bone marrow: a mouse model of minimal residual disease. Am. J. Pathol. 160, 1143-1153 (2002).
- Wendt, M. K., Drury, L. J., Vongsa, R. A., Dwinell, M. B. Constitutive CXCL12 Expression Induces Anoikis in Colorectal Carcinoma Cells. Gastroenterology. 135, 508-508 (2008).
- Wendt, M., Schiemann, W. Therapeutic targeting of the focal adhesion complex prevents oncogenic TGF-beta signaling and metastasis. Breast Cancer Research. 11, R68-R68 (2009).
- Korpal, M. Imaging transforming growth factor-beta signaling dynamics and therapeutic response in breast cancer bone metastasis. Nat Med. , (2009).
- Giampieri, S. Localized and reversible TGFbeta signalling switches breast cancer cells from cohesive to single cell motility. Nat Cell Biol. 11, 1287-1296 (2009).
- Giampieri, S., Pinner, S., Sahai, E. Intravital imaging illuminates transforming growth factor beta signaling switches during metastasis. Cancer Res. 70, 3435-3439 (2010).
- DeNardo, D. G. CD4(+) T cells regulate pulmonary metastasis of mammary carcinomas by enhancing protumor properties of macrophages. Cancer Cell. 16, 91-102 (2009).
- Wyckoff, J. A Paracrine Loop between Tumor Cells and Macrophages Is Required for Tumor Cell Migration in Mammary Tumors. Cancer Res. 64, 7022-7029 (2004).
- Kim, M. Y. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139, 1315-1326 (2009).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Res. 52, 1399-1405 (1992).
- Wendt, M. K., Smith, J. A., Schiemann, W. P. Transforming growth factor-beta-induced epithelial-mesenchymal transition facilitates epidermal growth factor-dependent breast cancer progression. Oncogene. 29, 6485-6498 (2010).
- Hawkins, E., Unch, J., Murhpy, N., Vidugiriene, J., Scurria, M., Klaubert, D., Wood, K. Bright Light, No Lysis. Measuring Renilla Luciferase Luminescence in Living Cells. , Promega. (2005).
- Roncali, E. New device for real-time bioluminescence imaging in moving rodents. J. Biomed. Opt. 13, 054035-054035 (2008).
