Summary
Vertraagde type overgevoeligheid (DTH) is een ontstekingsreactie gemedieerd door CCR7-effector-geheugen T (TEM) lymfocyten. Hier laten we zien hoe de antigeen-specifieke TEM-cellen te activeren, te induceren adoptie-DTH bij Lewis ratten en toezicht op de ontstekingsreactie.
Abstract
Vertraagde type overgevoeligheid (DTH) is een ontstekingsreactie gemedieerd door CCR7-effector-geheugen T-lymfocyten die de plaats van de injectie van een antigen waartegen het immuunsysteem is gevuld te infiltreren. De ontstekingsreactie wordt gekenmerkt door roodheid en zwelling van de site van antigene uitdaging. Het is een handig model om vast te stellen de in vivo werkzaamheid van immunosuppressiva. Cutane DTH kan worden geïnduceerd door adoptieve overdracht van antigeen-specifieke T-lymfocyten of door actieve immunisatie met een antigeen, en de daaropvolgende intradermale uitdaging met het antigeen van de ontstekingsreactie in een bepaald huidgebied induceren. DTH reacties kunnen worden veroorzaakt aan verschillende antigenen, zoals ovalbumine, tuberculine, tetanustoxoïd of keyhole limpet hemocyanine. Dergelijke reacties kunnen ook worden geïnduceerd tegen autoantigen, bijvoorbeeld om basic protein (MBP) myeline in ratten met experimentele auto-immune encephalomyelitis geïnduceerd met MBP, een diermodel voor multiple sclerose (1). Hier laten we zien hoe een adoptie-DTH-reactie in Lewis ratten veroorzaken. We zullen eerst stimuleren ovalbumine-specifieke T-cellen in vitro en injecteer deze geactiveerde cellen intraperitoneaal toegediend aan ratten naïef. Na aftrek van de cellen in evenwicht in vivo voor twee dagen, zullen we tegen de ratten met ovalbumine in de oorschelp van een oor, terwijl het andere oor zul ontvangen zoutoplossing. De ontstekingsreactie is zichtbaar 3-72 uur later en oor de dikte wordt gemeten als een indicatie van de DTH ernst.
Protocol
1. Stimulatie van de ovalbumine-specifieke T-lymfocyten
Resting ovalbumine-specifieke T-cellen worden gestimuleerd met ovalbumine in de aanwezigheid van bestraalde Lewis rat thymocyten (30 Gy) als antigeen presenterende cellen (APC's), in Stimulatie Medium (Bereid in DMEM + Pen / Strep / L-Glut + + NEAA RPMI Vitaminen + + 2ME Rat Serum + ovalbumine, op de uiteindelijke concentraties vermeld in de materialen lijst.)
Rat serum voorbereiding
- Wij nemen serum van de ratten we offer als thymus donoren.
- Ratten zijn diep verdoofd door halothaan inademing en zo veel bloed als mogelijk wordt getrokken door cardiale perfusie (5-10 ml per rat) met behulp van 10 ml spuiten en 23 G 1 "naalden, waarna de ratten onmiddellijk onthoofde tot de dood te verzekeren.
- Het bloed mag stollen gedurende 10 min bij 37 ° C, gevolgd door 10 min op ijs.
- Het stolsel wordt verwijderd en de resterende vloeistof gesponnen.
- Het serum wordt verzameld, steriel gefiltreerd en opgeslagen bij -20 ° C.
Voorbereiding van het antigeen presenterende cellen
- Neem de thymus van een onthoofde rat met behulp van steriele instrumenten en plaats deze in PBS met penicilline en streptomycine (PBS-PS), op ijs.
- Neem de zwezerik op een weefselkweek kap, schoon te maken uit de vorming van bloedstolsels en andere contaminerende weefsel en snijd deze in kleine stukjes in een cel zeef (Fisher # 08-771-2), geplaatst in een 10 cm petrischaal met 10 ml PBS- PS.
- Elk stuk wordt gedrukt door de cel zeef met behulp van de achterkant van een steriele 1 ml spuit zuiger. Verzamel de enkele celsuspensie in een 50 ml buis op ijs.
- Spoel de cel zeef met 20-40 meer ml PBS-PS. Centrifugeer de suspensie bij 1250g en resuspendeer de pellet in PBS-PS, 5 ml / thymus, op het ijs.
- Bestralen deze opschorting (30 Gy) in een gamma bestraler en meteen twee keer wassen met 50 ml PBS-PS.
Opmerking: De beste thymus donoren zijn jong volwassen ratten, 5-7 weken oud. Ratten tot 10 weken kan worden gebruikt, maar het aantal cellen neemt af met de tijd. Gender is niet belangrijk, hoewel sommige mensen zeggen dat mannen beter zijn thymus donoren. Wij gebruiken altijd vrouwtjes omdat al onze dieren zijn gehuisvest in dezelfde kamer en we hebben geen mannen en vrouwen wil in dezelfde ruimte.
Stimulatie
- Een keer was de T-lymfocyten en tel ze.
- Tel de antigeen-presenterende cellen.
- Mix 3 x 10 6 ovalbumine-specifieke T-cellen met 150 x 10 6 APC's in een 10 cm petrischaal met 10 ml van de stimulatie medium.
- Incubeer gedurende 48 uur bij 37 ° C.
2. Adoptieve overdracht van de ovalbumine-specifieke T-lymfocyten
- De ratten die we gebruiken als ontvangers zijn vrouwen 7-10 weken oud.
- Tel de T-lymfocyten, moeten zij worden groot en rond. Het antigeen-presenterende cellen zullen dood zijn.
- Centrifugeer de T-lymfocyten en resuspendeer ze op 10 x 10 6 cellen / ml in PBS.
- Injecteer 1 ml intraperitoneaal gebruik van 3 ml spuiten en 23 G 1 "naalden.
3. Uitdaging met antigeen in het oor
- Twee dagen na de adoptieve overdracht, injecteer 20 ui van een 1 mg / ml ovalbumine-oplossing (= relevante antigeen) in een oor en zout (of irrelevante antigeen) in het andere oor. NIET filter het antigeen-oplossing als je kan verliezen aggregaten die de ontstekingsreactie te versterken.
Opmerking: De ratten moeten worden verdoofd om bewegingen te voorkomen. Als u rechtshandig bent, houdt het oor tussen je linker duim en wijsvinger, de wijsvinger wordt in het oor en de rat naar u toe.
- Injecteer de oplossing in de oorschelp van het oor met behulp van 27G ½ "naalden. Probeer om precies te injecteren alle ratten op dezelfde plaats.
4. Meting van DTH
- Het oor zal gaan draaien rood en zwellen als een teken van ontsteking. Meet de dikte van elk oor met een veerbelaste micrometer (bijvoorbeeld model PK-0505 van Mitutoyo).
- Neem 5-6 metingen voor elk oor op elk tijdstip-point en bereken het gemiddelde.
- De maximale zwelling moet plaatsvinden tussen 24 en 72 uur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De antigene uitdaging kan ook worden uitgevoerd op andere locaties, bijvoorbeeld in de huid van de rug (2). We echter vinden dat een uitdaging. Met behulp van de oorschelp van het oor, zoals in deze video, zorgt voor de meest nauwkeurige meting van de DTH-reactie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken dr. Alexander Flugel (Martinsried, Duitsland) voor het verstrekken van ons de GFP-gelabelde, ovalbumine-specifieke T-cel lijn die in dit protocol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12430-062 | 500ml |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | 1 mM final, in Stimulation medium |
| Penicillin – Streptomycin – L-Glutamine | Cambrex/BioWhittaker | 17-718R | 100 u/ml - 100 μg/ml - 4 mM respectively, final, in Stimulation Medium |
| Non essential amino acids | Sigma-Aldrich | R7131 | NEAA, 1% final, in Stimulation Medium |
| RPMI vitamins | Sigma-Aldrich | R7256 | 1% final, in Stimulation medium |
| beta-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | 2ME, 50 μM final, in Stimulation Medium |
| Syngeneic rat serum | 1% final. See explanation in Protocol. | ||
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5503 | 10 μg/ml final, in Stimulation Medium. |
References
- Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. , 166-936 (2001).
- Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH)in rats. J Vis Exp. (5), (2007).
