Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

كفاءة اشتقاق السلائف القلب البشري وافرة القوة العضلية من خلايا المنشأ الجنينية البشرية التعريفي مع جزيء صغير

Published: November 3, 2011 doi: 10.3791/3274
Automatic Translation
1,2, 3,4, 1,2, 1,2,5, 1,2,6, 1,2
1San Diego Regenerative Medicine Institute, 2Xcelthera, 3Department of Neurosurgery, Harvard Medical School, 4Division of SCI Research, VA Boston Healthcare System, 5Program in Stem Cell & Regenerative Biology, Sanford-Burnham Medical Research Institute, 6La Jolla IVF

Summary

أقمنا على بروتوكول لتحريض مباشر من cardioblasts المحفزة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في ظل ظروف محددة المحافظة مع الجزيئات الصغيرة ، والتي تمكن من اشتقاق كميات كبيرة من أسلاف الإنسان والقلب العضلية وظيفية لإصلاح القلب والأوعية الدموية.

Abstract

حتى الآن ، كان عدم وجود مصدر الخلايا البشرية المناسبة لنكسة كبيرة في القلب في الإنسان تجديد عضلة القلب ، وإما عن طريق زرع خلية القاعدة أو أنسجة القلب 1-3 الهندسية. العضلية تصبح عضال ، متباينة بعد وقت قصير من الولادة ، وتفقد قدرتها على التكاثر. لا يوجد أي دليل على أن الجذعية / السلف الخلايا المشتقة من مصادر أخرى ، مثل نخاع العظم أو دم الحبل السري ، قادرة على أن تؤدي الى خلايا عضلة القلب مقلص التالية زرع في قلب 1-3. لم تكن الحاجة إلى تجديد أو إصلاح عضلة القلب التالفة التي اجتمع الكبار العلاج بالخلايا الجذعية ، سواء المحلية أو عبر تسليم خلية 1-3. ومستقرة وراثيا الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) وغير محدود القدرة على التوسع واللدونة غير مقيدة ، يقترحونها خزان المحفزة للاشتقاق في المختبر من كميات كبيرة من الخلايا الجسدية البشرية التي تقتصر على النسب في حاجةإصلاح وتجديد 4،5. نظرا لانتشار مرض القلب والأوعية الدموية في جميع أنحاء العالم والنقص الحاد في الأجهزة المانحة ، وهناك اهتمام كبير في العلاجات القائمة على hESC النامية كنهج بديل. ومع ذلك ، وكيفية التفريق قناة إمكانات واسعة من hESCs المحفزة بكفاءة ويمكن التنبؤ بها إلى النمط الظاهري المطلوب قد يشكل تحديا كبيرا لكلا دراسة تنموية والترجمة السريرية. المناهج التقليدية تعتمد على نسب متعددة من الخلايا المحفزة الميل التلقائي من خلال تمايز طبقة الجرثومية ، مما أدى إلى عدم كفاءة والتزام لا يمكن السيطرة عليها ، النسب التي يتم اتباعها في كثير من الأحيان عدم التجانس المظهري وعدم الاستقرار ، وبالتالي ارتفاع مخاطر tumorigenicity 6-8 (انظر التخطيطي في الشكل 1A). بالإضافة إلى ذلك ، قد غير معروف ملاحق البيولوجية الأجنبية / الحيوانية و / أو مغذيات التي عادة ما كانت تستخدم للعزل ، والتوسع ، والتفريق بين hESCs الاستفادة مباشرة من هذه الخلية specialiزيد الطعوم في المرضى الذين يعانون مشاكل 9-11. للتغلب على هذه العقبات ، ولقد عقدنا العزم على عناصر نظام ثقافة المعرفة الضرورية والكافية لإدامة الأديم الظاهر pluripotence من hESCs ، بمثابة منصة لاشتقاق نوفو دي hESCs سريريا مناسب وفعال توجيه مثل هذه hESCs موحد تجاه الأنساب سريريا ذات الصلة بواسطة الجزيئات الصغيرة 12 (انظر التخطيطي في الشكل 1B). بعد فحص مجموعة متنوعة من الجزيئات الصغيرة وعوامل النمو ، وجدنا أن هذه الشروط المحددة المقدمة نيكوتيناميد (NAM) كافية للحث على مواصفات cardiomesoderm مباشرة من hESCs المحفزة التي تقدم المزيد من cardioblasts التي ولدت مع الإنسان العضلية الضرب كفاءة عالية (الشكل 2 ). حددنا الشروط لتحريض مباشر من cardioblasts hESCs المحفزة دون التدخل المتعدد نسب مضغي الشكل مرحلة الجسم ، وكذلك تمكين لسيطرة فعالة على الاشتقاقكميات كبيرة من خلايا القلب البشرية عبر الطيف من المراحل التنموية لخلية مقرها المداواة.

Protocol

1. الحل وإعداد وسائل الإعلام

  1. حل طلاء الجيلاتين : 0.1 ٪ (ث / ت) الجيلاتين في DDH 2 O ، تعقيمها وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  2. Matrigel حلول الطلاء. محلول المخزون : تحسن بطيء Matrigel (10 مل) في 4 درجات مئوية خلال الليل ، إضافة 10 مل من الجليد الباردة أو DMEM DMEM/F12 ، تخلط جيدا وقسامة 1 مل / أنبوب تعقيم الأنسجة تحت غطاء محرك السيارة والثقافة ، ومخزن في -20 درجة مئوية. يعمل الحل : 1 تحسن بطيء قسامة Matrigel مل عند 4 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعات ، ونقل إلى 14 مل أو مبردة DMEM DMEM/F12 وتخلط جيدا تعقيم الأنسجة تحت غطاء الثقافة مباشرة قبل الطلاء.
  3. الإنسان حل طلاء laminin : 1 مل تمييع الحل laminin الإنسان (0.5 ملغ / مل في تريس التخزين المؤقت كلوريد الصوديوم ، وتخزينها في -80 درجة مئوية ، وتحسن بطيء في 4 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة) مع الثلج الباردة DMEM أو لDMEM/F12 12.5 مل محلول العمل (40 ميكروغرام / مل) تحت غطاء الثقافة تعقيم الأنسجة مباشرة قبل الطلاء.
  4. حلول نمو المخزون عامل (500 - 1000X) : حل عامل النمو بنسبة 10 ميكروغرام/ مل في تعقيم العازلة (0.5 ٪ BSA ، 1.0 ملي DTT ، الجلسرين 10 ٪ ، 1XPBS) والمخزن كما aliquots ميكروليتر / 50-100 في أنبوب -80 درجة مئوية.
  5. وسائل الاعلام HESC : DMEM/F12 أو KO - DMEM (80 ٪) ، KO استبدال المصل (20 ٪) ، L - ألانيل GLN - L - L - GLN أو (2 ملم) ، والأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (MNAA ، 1X) ، و β - المركابتويثانول (100 ميكرون) وتصفيتها وتخزينها في 4 درجات مئوية ، على أن تستكمل مع bFGF نانوغرام / مل 20 قبل استخدامها. أو استبدال "استبدال المصل KO" مع عناصر محددة : DMEM/F12 أو KO - DMEM (100 ٪) ، L - ألانيل GLN - L - L - GLN أو (2 ملم) ، MNAA (1X) والأحماض الأمينية الأساسية MEM (MEAA ، 1X) ، وβ - المركابتويثانول (100 ميكرون) وتصفيتها وتخزينها في 4 درجات مئوية ، على أن تستكمل مع bFGF (20 نانوغرام / مل) ، الأنسولين البشري (20 ميكروغرام / مل) ، وحمض الاسكوربيك (50 ميكروغرام / مل) ، والبشرية activin A (50 نانوغرام / مل) ، والبشرية Albumax ألبومين / (10 ملغ / مل) ، وترانسفيرين الإنسان (8 ميكروغرام / مل) قبل الاستعمال.
  6. وسائل الاعلام HESC تمايز القلب : DMEM/F12 (90 ٪) ، FBS محددة (10 ٪) ، وL - ألانيل - L - L أو GLN GLN - (2 ملم).
  7. وسائل الإعلام التي تحتوي على نيكوتيناميد (NAM) : إضافة Nصباحا إلى وسائل الإعلام أو وسائل الإعلام HESC HESC تمايز القلب إلى التركيز النهائي من 10 ملم ، وتمت تصفيتها وتخزينها في 4 درجات مئوية واستخدامها في حدود 2 أسابيع من التحضير.

2. لوحة طلاء

  1. لوحات معطف مع الجيلاتين : إضافة 2.5 مل / بئر حل الجيلاتين إلى 6 لوحات جيدة واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية حاضنة مرطب.
  2. gelatinized البرد الجيلاتين المغلفة لوحات وإزالة الجيلاتين ، إضافة 2.5 مل / Matrigel الإنسان جيدا أو حل طلاء laminin مبردة تعمل على مرحلة ما قبل 6 لوحات وكذلك احتضان عند 4 درجات مئوية ليلا : لوحات معطف مع laminin.

3. الركض والبذر hESCs غير متمايزة في ظل ظروف محددة

  1. السماح لتنمو المستعمرات hESC 5-7 أيام من العمر ، واتخاذ hESC الثقافة لوحة مجهر تشريح (ما قبل المرحلة الدافئة تشريح إلى 37 درجة مئوية) تحت غطاء محرك السيارة تشريح تعقيمها.
  2. حدد لتقسيم المستعمرات hESC. شكليا ، ينبغي لهذه المستعمرات وغير متمايزة hESCs> 75 ٪ (SMكافة الخلايا المدمجة) ، وعادة مبهمة قليلا (وليس أبيض مكدسة المتابعة الخلايا ، وليس واضحا عن اختلاف الخلايا) مع حافة محددة تحت مجهر تشريح. مخطط بعناية المستعمرات المختارة وإزالة طبقة الخلايا الليفية المحيطة متباينة المستعمرة ، وجميع أجزاء متمايزة (إن وجدت) من مستعمرة مع حافة الحافة P2 ماصة معقمة أو سحب الزجاج الشعرية.
  3. إزالة وسائل الإعلام القديمة التي تحتوي على خلايا متمايزة منفصلة عائمة بواسطة الشفط. تغسل مع وسائل الاعلام hESC (بدون bFGF) مرة واحدة. أضف 3 مل / وسائل الإعلام hESC الطازجة جيدا تحتوي على 20 نانوغرام / مل bFGF.
  4. قطع المستعمرات hESC غير متمايزة الى قطع صغيرة ، وفصل مع تلميح ماصة معقمة أو الزجاج سحبت الشعرية.
  5. تجمع وسائل الإعلام التي تحتوي على قطع مستعمرة منفصلة معا في أنبوب مخروطية 50 مل. غسل لوحة واحدة مع 1 مل / وسائل الإعلام hESC كذلك تحتوي على 20 نانوغرام / مل bFGF وحمام سباحة معا.
  6. نضح في Matrigel أو حل laminin الإنسان من الصفائح الطازجة المغلفة. قسامة 4 مل / ح جيداESC وسائل الإعلام التي تحتوي على قطع مستعمرة لوحة 6 - جيدا. نقل بلطف لوحة الحاضنة دون أن تهتز والسماح مستعمرة قطعة البذور بين عشية وضحاها من دون إزعاج في ترطيب 37 درجة مئوية مع حاضنة جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ 2.

4. القلب تحريض hESCs بموجب نظام محدد مع الثقافة نيكوتيناميد

  1. في يوم 3 بعد الغرس وإزالة معظم وسائل الإعلام القديمة من كل بئر من لوحة وترك وسائل الاعلام بما فيه الكفاية للسماح للمستعمرات hESC أن تكون مغمورة (hESCs تسمح ابدا لتجف). استبدال 4 مل / وسائل الإعلام hESC الطازجة جيدا تحتوي على 20 نانوغرام / مل و 10 bFGF نيكوتيناميد ملم (NAM).
  2. استبدال القديم مع وسائل الاعلام وسائل الاعلام hESC الطازجة تحتوي على 20 نانوغرام / مل و 10 bFGF ملي الحركة كل يوم ، والسماح للمستعمرات hESC القلب الناجم عن النمو من 8-10 يوم. عند تعريض لحركة عدم الانحياز ، وجميع الخلايا داخل المستعمرة تغيرات مورفولوجية لخلايا متمايزة الكبيرة التي سوف تستمر في التكاثر. فإن الزيادة في حجم المستعمرات ، وبحلول يوم 10/08 ، وهووسوف تبدأ الخلايا د تتراكم في بعض المناطق في المستعمرات.

5. القلب التمايز المستمر في الثقافة تعليق

  1. تأخذ لوحة hESC الثقافة تشريح المجهر (ما قبل المرحلة الدافئة تشريح إلى 37 درجة مئوية) تحت غطاء محرك السيارة تشريح تعقيمها. مخطط بعناية المستعمرات وإزالة طبقة الخلايا الليفية المحيطة مستعمرة (خلايا متمايزة هاجروا من مستعمرة) مع حافة الحافة P2 ماصة معقمة أو سحب الزجاج الشعرية.
  2. إزالة وسائل الإعلام القديمة التي تحتوي على الخلايا الليفية عائمة منفصلة بواسطة الشفط. تغسل مع وسائل الاعلام hESC (بدون bFGF) مرة واحدة. أضف 3 مل / وسائل الإعلام hESC الطازجة جيدا (بدون bFGF).
  3. قطع المستعمرات hESC القلبية التي يسببها الى قطع صغيرة ، وفصل مع تلميح ماصة معقمة أو الزجاج سحبت الشعرية.
  4. تجمع وسائل الإعلام التي تحتوي على قطع مستعمرة منفصلة معا في أنبوب مخروطية 50 مل. غسل لوحة واحدة مع 1 مل / وسائل الإعلام hESC جيدا (بدون bFGF) ، وتجمع معا.
  5. قسامة 4 مل / وسائل الاعلام بشكل جيد hESC المصل خالية من القطع تحتوي على مستعمرة لوحة ultralow مرفق 6 جيدا واحتضان في 37 درجة مئوية ترطيب حاضنة للسماح للكتل عائمة الخلوية (cardioblasts) لتشكيل لأيام 4-5.

6. الضرب Cardiomyocyte نضوج النمط الظاهري في الثقافة لاصق

  1. تجمع وسائل الإعلام التي تحتوي على cardioblasts العائمة معا في أنبوب مخروطية 50 مل. 1400 دورة في الدقيقة في أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق. نضح في وسائل الإعلام القديمة بقدر ما تستطيع ، وإضافة كمية مساوية من وسائل الاعلام hESC تمايز القلب الطازجة تحتوي على 10 لحركة عدم الانحياز ملم.
  2. ماصة صعودا وهبوطا لخلط cardioblasts العائمة وقسامة 4 مل / إضافة إلى 6 لوحات جيدا. نقل لوحات إلى 37 درجة مئوية حاضنة مرطب للسماح لإرفاق cardioblasts بين عشية وضحاها.
  3. استبدال وسائل الاعلام hESC تمايز القلب تحتوي على 10 ملي كل يوم حركة عدم الانحياز الأخرى.
  4. في يوم 8 ، مع وسائل الإعلام محل القلب من دون تمايز hESC حركة عدم الانحياز ، وتستمر لتحل محل القلب HESC التمايز وسائل الإعلام الإلكترونيةالأخرى للغاية اليوم. وسوف يضربون العضلية تبدأ في الظهور في حوالي 1-2 أسابيع من زراعة المستمرة بعد انسحاب حركة عدم الانحياز وزيادة في أعداد مع مرور الوقت ، ويمكن الاحتفاظ تقلصات قوية والايقاعي لأكثر من 3 شهور.

7. ممثل النتائج :

نيكوتيناميد (NAM) يتم تقديم ما يكفي للحث على المحافظة على hESCs في منظومة ثقافة محددة للانتقال من تعدد القدرات حصرا إلى النمط الظاهري cardiomesodermal (الشكل 2B). عند التعرض للhESCs غير متمايزة لحركة عدم الانحياز ، وجميع الخلايا داخل المستعمرة تغيرات مورفولوجية لخلايا متمايزة الكبيرة التي أسفل تنظيم التعبير عن - 4 أكتوبر ويبدأ في التعبير عن القلب عامل النسخ محددة (CSX) Nkx2.5 و- α actinin ، بما يتفق مع النمط الظاهري cardiomesoderm (الشكل 2B). وسوف تستمر هذه الخلايا المتمايزة لضرب المستعمرات وزيادة في الحجم. وزيادة كثافة Nkx2.5لاحظ أن عادة في مناطق المستعمرات حيث تبدأ الخلايا تتراكم (الشكل 2B). بعد فصل ، فإن حركة عدم الانحياز hESCs المعاملة شكل كتل عائمة الخلوية (cardioblasts) في ثقافة التعليق على مواصلة عملية التمايز في القلب. بعد السماح لإرفاق cardioblasts ومواصلة علاج مع حركة عدم الانحياز : 1 الأسبوع ، وسوف يضربون العضلية تبدأ في الظهور في حوالي 1-2 أسابيع من زراعة المستمرة بعد انسحاب حركة عدم الانحياز مع زيادة كبيرة في كفاءة بالمقارنة مع النسب التمايز المتعدد العفوي hESCs دون علاج على مدى نفس الفترة الزمنية (الشكل 2C). والخلايا داخل التجمعات cardiomyocyte الضرب التعبير عن علامات مميزة للالعضلية ، بما في ذلك Nkx2.5 وactinin - α (الشكل 2C). وأكد الانقباضات العضلية للضرب من قبل التشكيلات الكهربائية لتكون قوية ، والإيقاعية ، منسقة تنسيقا جيدا ، وكذلك مجرور ، مع نبضات منتظمة تذكرنا ع- QRS - T - المجمعات يتضح من أقطاب كهربية في سطح الجسم السريرية (الشكل 2C ، وانظر أيضا الفيديو). يمكن أن تحتفظ انقباض العضلية القوية لأكثر من 3 شهور.

الشكل 1
الشكل 1. عموما مخططات النهج التقليدي في مقابل نهج الصغيرة جزيء التعريفي للتمايز الخلايا الجذعية المحفزة نحو خلايا وظيفية متخصصة. (أ) من النهج التخطيطي التقليدية باستخدام نسب متعددة ميل الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة من خلال عفوية الجرثومية تمايز الطبقات. (ب) والتخطيطي بشكل جيد للرقابة فعالة من تحريض الخلايا الجذعية المحفزة حصرا على نسب معينة سريريا ذات الصلة عن طريق توفير بسيط من الجزيئات الصغيرة.

الشكل 2
الشكل 2. نيكوتيناميد يدفع القلب مواصفات النسب المباشر لتعدد القدرات في ظل ظروف محددة والتقدم نحو الضرب العضلية. (أ) التي تصور تخطيطي للخط الوقت بروتوكول تمايز القلب موجهة من hESCs. (ب) عند التعرض لhESCs غير متمايزة إلى نيكوتيناميد (NAM) في إطار منظومة ثقافة محددة ، واسعة متباينة - 4 أكتوبر (أحمر) خلايا السلبية داخل مستعمرة بدأت في الظهور ، مقارنة hESCs (DMSO) وهمية ، تعامل على أنها عنصر التحكم. بدأت حركة عدم الانحياز التي يسببها الخلايا أكتوبر - 4 - السلبية للتعبير عن Nkx2.5 (الخضراء) وα actinin - (الحمراء) ، بما يتفق مع التمايز في القلب في وقت مبكر. وقد لوحظ زيادة الكثافة عادة تدريجيا من Nkx2.5 في المناطق المستعمرة حيث الخلايا بدأت تتراكم. يشار إلى كافة الخلايا التي تلطيخ دابي من النواة (الأزرق). (ج) أسفرت عن حركة عدم الانحياز التي يسببها القلب العضلية ، ارتكبت hESCs الضرب مع زيادة كبيرة في الكفاءة والمقدرة على النحو الذي clus الخلويةالنسب التي يتم عرضها الانقباضات الإيقاعية (انظر ملف الكهربية والفيديو) ، ووimmunopositive لNkx2.5 (الخضراء) وα actinin - (الحمراء). وتظهر الصور المرحلة ممثل الكتل الكبيرة cardiomyocyte الضرب والصور أعلى سلطة تمثيلية التعاقد عضلات القلب (انظر أيضا أشرطة فيديو المقابلة). الأسهم تشير إلى الضرب cardiomyocyte كبيرة العنقودية التي استخدمت لتسجيل الكهربية. ملف الكهربية العضلية للضرب معارض ، مجرور العادية ، نبضات إيقاعية تشبه المجمعات - P - QRS - T ينظر في كهربية السريرية. أشرطة النطاق : 0.1 مم.

فيديو : للمقاولات العضلية المتباينة من حركة عدم الانحياز التي يسببها hESCs. الفيديو 1 و 2 عرض ممثل كبير فيديو ضرب تجمعات cardiomyocyte في حوالي 1 و 3 بعد شهر من الحجز. فيديو 3 و 4 ممثل تظهر التعاقد عضلات القلب في أعلى السلطة. 5 يظهر typicaل cardiomyocyte ضرب كتلة صغيرة متباينة بشكل عفوي من دون معالجة hESCs حركة عدم الانحياز والسيطرة عليها.

انقر هنا لمشاهدة الفيديو 1.
انقر هنا لمشاهدة الفيديو 2.
انقر هنا لمشاهدة الفيديو 3.
انقر هنا لمشاهدة الفيديو 4.
انقر هنا لمشاهدة الفيديو 5.

Discussion

كان واحدا من التحديات الكبرى على حد سواء دراسة تنموية والترجمة السريرية كيفية توجيه إمكانات واسعة من تمايز الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان إلى النمط الظاهري المطلوب بكفاءة ويمكن التنبؤ به. على الرغم من أن مثل هذه الخلايا يمكن التفريق بصورة عفوية إلى خلايا في المختبر من كل الطبقات الجرثومية التي تمر في مرحلة تجميع متعددة النسب ، في hESC المستمدة متعددة النسب المجاميع (الهيئات مضغي الشكل) ، سوى جزء صغير جدا من الخلايا (<2 ٪) بشكل عفوي تفرق في العضلية 13-15 (الشكل 1A). انتقاء مناعي التالية ، كانت من أثرى السكان العضلية قادرة على العمل وأجهزة ضبط نبضات القلب البيولوجي لانقاذ ظيفة عضلة القلب التالفة ميكانيكيا والكترونيا بعد حقنها في قلب النماذج الحيوانية 13. في النماذج احتشاء القوارض ، تم engrafted hESC المستمدة السلالات القلب قادرة على البقاء وناضجة تصل إلى 12 أسبوعا ، وremuscular جزئياإيزي قلب المصابين وتحسين وظيفة مقلص 14،15. ومع ذلك ، فقد أعاق انعدام الكفاءة في توليد الإنسان التي ارتكبت في القلب ، من خلال خلايا متعددة النسب تمايز الخلايا المحفزة ومخاطر عالية من زرع مزيد من الترجمة التالية tumorigenicity السريرية. وضع استراتيجيات لتوجيه إمكانات واسعة من تمايز hESCs المحفزة وحدها ، ويمكن التنبؤ بها إلى النمط الظاهري القلب هو أمر حيوي لتسخير قوة البيولوجيا hESC في مجال القلب. استخدمنا من أجل تحقيق تحويل موحد للخلايا الجذعية المحفزة لنسب معينة ، وهو نظام قادر على تعريف الثقافة تأمين انتشار hESCs غير متمايزة لتحديد الظروف التي تسيطر عليها بشكل جيد للتحريض كفاءة hESCs المحفزة حصرا على وجه الخصوص النسب ذات الصلة سريريا عن طريق توفير بسيط من الجزيئات الصغيرة (الشكل 1B). وجدنا أن يسببها نيكوتيناميد القلب ، نسب التزام مباشر من عluripotent hESCs تحت ثقافة المعرفة التي تقدم للضرب مزيد من العضلية ذات كفاءة عالية (الشكل 2). Nkx2.5 هو النسخ المحفوظة homeobox evolutionally عاملا لا غنى عنه لتحقيق التنمية القلب الطبيعي والطفرات في الجينات البشرية المقترنة مع أمراض القلب الخلقية (CHD) ، وأكثرها شيوعا عيب خلقي الإنسان 16. التعبير عن Nkx2.5 هو اقرب علامة للحصول على خلايا القلب السلائف في جميع الفقاريات حتى الآن فحص وضروري لتحوجز القلب السليم وتكوين / نضوج نظام التوصيل الكهربائي 16. في الفقاريات ، وظهور نمط من التعبير Nkx2.5 المبكر تتزامن تقريبا مع توقيت ومجال المواصفات القلب في مرحلة التطور الجنيني المبكر ، وNkx2.5 الجين لا يزال يعبر عنها من خلال التنمية في القلب 16. في نموذج hESC لدينا ، وبدا حركة عدم الانحياز لتحريك القلب تحريض مباشر من hESCs المحفزة من خلال تشجيع التعبير عن القلب محددة transcription Nkx2.5 عاملا في العملية التي قد تحاكي مواصفات cardiomesoderm من الأديم الظاهر في المحفزة تخلق القلب الجنينية البشرية. وسوف تكشف الدراسات المستقبلية مراقبة الجزيئات الجينية وجينية في مجال التنمية البشرية كبدائل القلب ، مما قد يمهد الطريق للسيطرة على جزيء صغير بوساطة مباشرة والتشكيل مصير المحفزة hESC عند اشتقاق الأنساب سريريا ذات الصلة لعلاجات التجدد. حركة عدم الانحياز من دون علاج ، فإن <hESCs 2 ٪ الخضوع التمايز عفوية إلى الضرب العضلية 12-15. مع العلاج حركة عدم الانحياز ، وكنا قادرين على توليد> 95 ٪ السلائف القلب العضلية الجنينية والضرب> 50 ٪ من hESCs حافظت ظل ثقافة تحدد في عملية التنمية البشرية قد تحاكي القلب الجنينية 12. في الآونة الأخيرة ، استخدمت يعرف مصير القلب ، لتحديد الجينات transdifferentiate الليفية الماوس إلى ما بعد الولادة العضلية الضرب مع انخفاض كفاءة 0.5 ٪ <17 ، 18 </ سوب>. ومع ذلك ، فقد تم إعادة برمجة الخلايا تاريخيا الجسدية المرتبطة الشاذ التعبير الجيني وتسارع الشيخوخة مع فائدة علاجية ضعاف 19-21. أخيرا ، تقتصر على البروتوكول وضعناها هنا لhESCs المحفزة المستمدة من الكتلة الخلوية الداخلية (ICM) أو الأديم الظاهر من 4،5 الكيسة الإنسان ، قد لا ينطبق على الخلايا المحفزة الأخرى ، بما فيها المجالس الاقتصادية والاجتماعية ، نشأت المجالس الاقتصادية والاجتماعية الحيوانية المستمدة من morula في وقت سابق (ثماني خلايا) في المرحلة 22 الأجنة والخلايا برمجتها بشكل مصطنع 23.

Disclosures

الكتاب تعلن المصالح المتنافسة. XHP هو مؤسس Xcelthera. XHP EYS ولها خصائص الفكرية المتصلة hESCs.

Acknowledgments

وقد تم دعم XHP بواسطة المعهد الوطني للمنح (NIH) الصحة من المعهد الوطني للشيخوخة (NIHK01AG024496) يونيس كينيدي وشرايفر المعهد القومي لصحة الطفل والتنمية البشرية (NIHR21HD056530).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gelatin Sigma-Aldrich G1890
Matrigel BD Biosciences 356231 Growth factor reduced
Human laminin Sigma-Aldrich L6274
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
DMEM/F12 Invitrogen 10565042
DMEM Invitrogen 31053036
DMEM-KO Invitrogen 10829018
Knock-out serum replacement Invitrogen 10828028
MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) Invitrogen 11140050
MEM amino acids solution(MEAA, 100X) Invitrogen 11130050
β-Mercapt–thanol Invitrogen 21985023
Albumax Invitrogen 11020021
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4403
Human transferrin Sigma-Aldrich T8158
Human bFGF PeproTech Inc AF-100-18B
Human insulin Invitrogen 12585014
Human activin A PeproTech Inc 120-14E
Defined FBS Hyclone SH30073-03
6-well ultralow attachment plate Corning 3471
6-well plate Corning 3516

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jawad, H., Ali, N. N., Lyon, A. R., Chen, Q. Z., Harding, S. E., Boccaccini, A. R. Myocardial tissue engineering: a review. J. Tissue. Eng. Regen. Med. 1, 327-342 (2007).
  2. Passier, P., van Laake, L. W., Mummery, C. L. Stem-cell-based therapy and lessons from the heart. Nature. 453, 322-329 (2008).
  3. Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. Human embryonic stem cells and cardiac repair. Transplant Rev. 23, 53-68 (2009).
  4. Parsons, X. H., Teng, Y. D., Snyder, E. Y. Important precautions when deriving patient-specific neural elements from pluripotent cells. Cytotherapy. 11, 815-824 (2009).
  5. J, J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. , 282-1145 (1998).
  6. Aubry, L., Bugi, A., Lefort, N., Rousseau, F., Peschanski, M., Perrier, A. L. Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16707-16712 (2008).
  7. Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. A. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nature Medicine. 12, 1259-1268 (2006).
  8. Wernig, M., Zhao, J. P., Pruszak, J., Hedlund, E., Fu, D., Soldner, F., Broccoli, V., Constantine-Paton, M., Isacson, O., Jaenisch, R. Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5856-5861 (2008).
  9. Richards, M., Fong, C., Chan, W., Wong, P., Bongso, A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nature. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).
  10. Xu, C., Inokuma, M. S., Denham, J., Golds, K., Kundu, P., Gold, J. D., Carpenter, M. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
  11. Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nature Methods. 2, 185-190 (2005).
  12. Parsons, X. H., Teng, Y. D., Moore, D. A., Snyder, E. Y. Patents on technologies of human tissue and organ regeneration from pluripotent human embryonic stem cells. Recent Patents on Regenerative Medicine. 1, 142-163 (2011).
  13. Kehat, I., Khimovich, L., Caspi, O., Gepstein, A., Shofti, R., Arbel, G., Huber, I., Satin, J., Itskovitz-Eldor, J., Gepstein, L. Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 22, 1282-1289 (2004).
  14. Laflamme, M. A., Chen, K. Y., Naumova, A. V., Muskheli, V., Fugate, J. A., Dupras, S. K., Reinecke, H., Xu, C., Hassanipour, M., Police, S., O'Sullivan, C., Collins, L., Chen, Y., Minami, E., Gill, E. A., Ueno, S., Yuan, C., Gold, J., Murry, C. E. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infracted rat hearts. Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  15. Caspi, O., Huber, I., Kehat, I., Habib, M., Arbel, G., Gepstein, A., Yankelson, L., Aronson, D., Beyar, R., Gepstein, L. Transplantation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes improves myocardial performance in infarcted rat hearts. J. Am. Coll. Cardiol. 50, 1884-1893 (2007).
  16. Akazawa, H., Komuro, I. Cardiac transcription factor Csx/Nkx2-5: Its role in cardiac development and diseases. Pharmacol. Ther. 107, 252-268 (2005).
  17. Leda, M., Fu, J. D., Delgado-Olguin, P., Vedantham, V., Hayashi, Y., Bruneau, B. G., Srivastava, D. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142, 375-386 (2010).
  18. Efe, J. A., Hilcove, S., Kim, J., Zhou, H., Ouyang, K., Wang, G., Chen, J., Ding, S. Conversion of mouse fibroblasts into cardiomyocytes using a direct reprogramming strategy. Nat. Cell. Biol. 13, 215-222 (2011).
  19. Kim, K., Doi, A., Wen, B., Ng, K., Zhao, R., Cahan, P., Kim, J., Aryee, M. J., Ji, H., Ehrlich, L. I. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467, 285-290 (2010).
  20. Gore, A., Li, Z., Fung, H. L., Young, J. E., Agarwal, S., Antosiewicz-Bourget, J., Canto, I., Giorgetti, A., Israel, M. A., Kiskinis, E. Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells. Nature. 471, 63-67 (2011).
  21. Feng, Q., Lu, S. J., Klimanskaya, I., Gomes, I., Kim, D., Chung, Y., Honig, G. R., Kim, K. S., Lanza, R. Hemangioblastic derivatives from human induced pluripotent stem cells exhibit limited expansion and early senescence. Stem Cells. 28, 704-712 (2010).
  22. Klimanskaya, I., Chung, Y., Becker, S., Lu, S. -J., Lanza, R. Derivation of human embryonic stem cells from single blastomeres. Nat. Protocols. 2, 1963-1972 (2007).
  23. Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).

Tags

التنموية علم الأحياء ، العدد 57 ، الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، والبشرية ، سلف القلب ، والعضلية ، خلية الإنسان المحفزة ، والتمايز القلب ، والحث جزيء صغير ، والثقافة الخلية ، العلاج بالخلايا
كفاءة اشتقاق السلائف القلب البشري وافرة القوة العضلية من خلايا المنشأ الجنينية البشرية التعريفي مع جزيء صغير
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parsons, X. H., Teng, Y. D.,… More

Parsons, X. H., Teng, Y. D., Parsons, J. F., Snyder, E. Y., Smotrich, D. B., Moore, D. A. Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction. J. Vis. Exp. (57), e3274, doi:10.3791/3274 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter