Summary
שיטת הקרח יתר מאפשר לגדל צמחים צלחות 96-היטב שאינם destructively שורש רקמה מן הקציר שתיל אחד. הדנ"א מופק רקמות השורש הזה יכול לשמש התגובות genotyping. מצאנו כי קרח יתר עובד היטב עבור
Abstract
זה הופך נפוץ עבור מדענים צמח לפתח פרויקטים הדורשים את genotyping של מספר גדול של צמחים. השלב הראשון בכל פרויקט genotyping היא לאסוף דגימת רקמה מצמח בנפרד. הגישה המסורתית משימה זו לצמחים מדגם אחד ב-פסק זמן. אם אדם רוצה גנוטיפ מאות או אלפי אנשים, לעומת זאת, באמצעות תוצאות האסטרטגיה צוואר בקבוק משמעותי בצנרת genotyping. שיטת הקרח יתר שאנו מתארים כאן מספק פתרון תפוקה גבוהה לאתגר זה בכך שהוא מאפשר מדען אחד לאסוף רקמה כמה אלפי שתילים ב 1,2 יום אחד. רמה זו של התפוקה מתאפשר על ידי העובדה כי רקמות שנקטפו מצמחים 96-at-פסק זמן, ולא אחת בכל פעם-a-.
שיטת הקרח יתר מספק פלטפורמה משולבת לביצוע צמיחה שתיל, קציר רקמות, מיצוי DNA. הבסיס יתר הקרח הצמיחה של seedliNGS בזוג מגובב של 96-גם הצלחות. הבארות של צלחת העליון מכילים תקעים של צמיחה התקשורת אגר בו שתילים בודדים לנבוט. השורשים לצמוח למטה דרך התקשורת אגר, צא צלחת העליון דרך חור, ומעבירים למים צלחת נמוך המכיל. כדי לקצור רקמה להפקת DNA, המים צלחת התחתון המכיל רקמות השורש הוא קפוא במהירות בעוד שתילי בצלחת העליונה להישאר בטמפרטורת החדר. צלחת העליון הוא קלופים אז מן הצלחת התחתון, מניב צלחת אחת עם 96 דגימות רקמה שורש קפואים בקרח אחד צלחת עם 96 שתילים קיימא. הטכניקה נקראת "קרח יתר", כי היא משתמשת קרח כדי ללכוד את רקמות השורש. צלחת 96-המכילה גם את השתילים אז יכול עטוף בנייר כסף והועבר בטמפרטורה נמוכה. תהליך זה משהה צמיחה נוספת של שתילים, אך אינו משפיע על יכולת הקיום שלהם. לאחר ניתוח גנוטיפ הושלמה, שתילים עם גנוטיפ הרצוי ניתן להעביר גם 96-pמאוחר לקרקע עבור התפשטות נוספת. אנחנו הדגימו את התועלת של השיטה קרח יתר באמצעות thaliana ארבידופסיס עגבניות, אורז ושתילים. אנו צופים כי השיטה צריכה גם לחול על מינים אחרים של צמחים עם הזרעים קטן מספיק כדי להתאים לתוך הבארות של 96-גם הצלחות.
Protocol
1. הכן את הקרח יתר פלטות שתיל עם Media צמיחה אגר
התקשורת הצמיחה מותכת (0.5X Murashige ו Skoog (MS) תערובת מלח הבסיס, 2 מ"מ Morpholinoethanesulfonic חומצה (MES), אגר 0.6% (w / v), pH 5.7) הוא חילק לתוך צלחות שתיל autoclaved באמצעות Dispenser microplate MicroFill. ליטר אחד של התקשורת נדרשת לכל 18 פלטות שתיל.
- הכן התקשורת צמיחה באחד בקבוקי זכוכית ליטר עם מכסים בראש הבורג החיטוי במשך 20 דקות.
- החיטוי ליטר אחד של מים מזוקקים בבקבוק זכוכית עם מכסה בורג בראש. באותו זמן גם החיטוי שתיל צלחות ריקות עטופות בנייר אלומיניום.
- העברת התקשורת autoclaved ומים להגדיר באינקובטור ב 65 ° C. טמפרטורה זו תשמור על התקשורת צמיחה במצב מותך.
- לאחר מעוקר, להסיר את פלטות שתיל מן לסכל ומניחים מכסה המנוע לזרום למינרית לייבוש. פלטות צריכה להיות יבשה לחלוטין לפני שתמשיך כך את הקלטת אריזה דבק יכוללחלוטין לאטום את החורים בחלק התחתון של הבארות של הצלחות.
- נגבו את ספסל במעבדה עם אתנול 95% לטהר.
- משרים מכסי פלסטיק שקוף על צלחות שתיל באתנול 95% לטהר. הסרת מכסי מ אתנול אוויר יבש במנדף תזרים למינרית. אל החיטוי את המכסים פלסטיק לעקר אותם כי הם יתמוססו ב החיטוי.
- החל קלטת אריזה לחלק התחתון של כל צלחת שתיל ובתקיפות חותם באמצעות הכלי הרים.
- מניחים את בקבוקי התקשורת צמיחה מותכת והמים מעוקרים באמבט מים נקבע על 65 ° C.
- צרף בקבוק המכיל אתנול 70% בטמפרטורת החדר למכונה MicroFill ולהפעיל את מחזור לטהר פעמיים כדי לטהר את הצנרת של מכונת MicroFill.
- צרף את הבקבוק עם מים סטריליים למכונה MicroFill. הפעל את מחזור לטהר שש פעמים כדי לחמם את הצנרת ולנקות את אתנול מחוץ למערכת. בקבוק המים צריכים להישאר באמבט 65 מעלות צלזיוס בכל הליך זה.
- לאחר שסיים את הטיהורים עם מים סטריליים, מיד לצרף את הבקבוק של התקשורת צמיחה מותכת למכונה MicroFill. הפעל את מחזור לטהר פעמיים כדי לנקות את מים מזוקקים מתוך הצנרת. הבקבוק של התקשורת צמיחה צריך להישאר באמבטיה 65 מעלות צלזיוס בכל הליך זה.
- לוותר על 450 מיקרוליטר של התקשורת צמיחה לתוך הבארות של כל צלחת שתיל. עבודה במהירות, כך התקשורת צמיחה לא לחזק בצנרת של מכונת MicroFill.
- כאשר כל פלטות שתיל מולאו, מיד לצרף את בקבוק המים 65 ° C סטרילי למכונה MicroFill ולהפעיל את מחזור לטהר 12 פעמים כדי לנקות את הצנרת. בקבוק המים צריכים להישאר באמבט 65 מעלות צלזיוס בכל הליך זה.
- אם מכונת MicroFill אינו זמין, צלחות שתיל יכול להיות גם שהוכן על ידי יד pipetting אגר מותכת לתוך צלחות אטום באמצעות pipettor רב.
- בדוק את בארות המים של לא כל שתיל פלטותo להבטיח כי התקשורת צמיחה לא דלפו בארות כלשהו. פיפטה יד נוספים מותכת צמיחה מדיה לתוך בארות בודדים לפי הצורך.
- כיסוי כל צלחת עם מכסה פלסטיק שקוף, ולאפשר צמיחה התקשורת לגבש את פלטות שתיל בטמפרטורת החדר. סטאק צלחות לעטוף בנייר אלומיניום עבור אחסון ב 4 ° C. צלחות חנות הפוך כדי למנוע הצטברות מים בבארות במהלך האחסון.
2. זרעים זרעו לתוך הקרח יתר פלטות שתיל ו שתילים לנבוט
תיארנו בעבר שיטה חצי אוטומטית מחלק זרעים ארבידופסיס לתוך צלחות שתיל באמצעות טעינת זרע התקן (2). למרות שהמכשיר הזה יכול להיות שימושי עבור כמה קבוצות של זרע, מצאנו כי השתנות גודל זרע מוצג על ידי קבוצות שונות של זרעי ארבידופסיס מגבילה את התועלת הכללית של המכשיר הזה. אנחנו נמצאים בתהליך של פיתוח שיטה אוטומטית חלופי מחלק זרעים, buלא כרגע מצאנו כי האסטרטגיה היעילה ביותר עבור מחלק זרעים לתוך צלחות שתיל הוא לבצע שלב זה על ידי יד כמתואר להלן.
- מפזרים זרעים יבשים על נייר פילטר Whatman.
- לוותר על 95% אתנול זרעים כך שכל הזרעים מכוסים אתנול. טיפול זה יהיה משטח לעקר את הזרעים.
- אפשר הזרעים לייבוש באוויר.
- העברת זרעים בודדים לתוך הבארות של פלטות שתיל באמצעות שינוי חד פעמיות זכוכית פיפטה פסטר. בסופו של פיפטה פסטר נחרץ על ידי בוערים קצה. טיפ הזכוכית המתקבלת היא הרטיבה ידי בעדינות נוגע לתקשורת אגר, אשר מאפשר זרעים יחיד להיות נטל בקלות מעלה הועבר השטח של אגר ב הבארות של רפידת שתיל. גרסה פעמיים בראשותו של כלי זה ציפוי הזרע יכול לשמש גם כדי להגדיל את התפוקה.
- כיסוי כל פלייט שתיל עם מכסה פלסטיק שקוף לאטום עם פלסטר micropore. לעטוף את הצלחות בערמהעם רדיד אלומיניום ארבידופסיס זרעים חנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך ארבעה ימים כדי לרבד את הזרעים ולסנכרן נביטה. זרעי עגבניות יש לאחסן בחושך על 12 מעלות צלזיוס במשך ארבעה ימים.
- מניחים את פלטות שתיל תחת אור ניאון ב · 18 to 20 ° C ליזום נביטה.
3. העברת פלטות שתיל אל מזרקת קרח יתר
לאחר צלחות שתיל כבר באור במשך ארבעה ימים, להעביר את פלטות שתיל מזרקה קרח יתר. עבור ארבידופסיס, שתילים נותרים בדרך כלל מזרקה הקרח שווי של 10 עד 14 ימים.
- להרכיב את מזרקת קרח יתר על ידי הנחת נייר אפייה על גבי מבנה מתלה מנהג אשר הושם בתוך קופסת אחסון מפלסטיק. השתמש אגוזים פילוס כדי להתאים את רמת הגיליון עוגייה. המקום משאבת הצוללת בתיבת אחסון לצרף את הצינור הפלט מהמשאבה לצד הגיליון עוגיה באמצעות קפיץ CLAmp. להרכיב את מזרקת קרח יתר על מדף בחדר צמח צמיחה או צמיחה קאמרית כך את פני השטח של מזרקת קרח יתר מקבל תאורת פלורסנט ישירה.
- מלאו את מזרקת קרח יתר בתערובת של 3 חלקים מים מזוקקים למי ברז חלק 1. מים יש להוסיף את המזרקה עד משאבת הצוללת היא כמה סנטימטרים מתחת לפני המים. סמן את מפלס המים הסופי בתיבת אחסון מפלסטיק באמצעות קלטת המעבדה עט סימון.
- הכינו צלחות רוט ידי הוספת בקוטר 3/32-inch כדור פלדה אל חלד היטב כל צלחת רוט.
- כדורי נירוסטה ניתן להוסיף את הלוחות באמצעות שורש מנהג עשה הכדור התקן מחלק 1. מכשיר זה נעשה על ידי הצבת גיליון בודד של רדיד אלומיניום על פני השטח של צלחת 96-PCR גם באמצעות עט סימון כדי לסמן את מיקומם של מרכזי גם כל על פני השטח של לסכל את. גיליון זה סימן של רדיד ממוקם מכן על גבי 6 גליונות נוספים של אלומיניוםil וכרך סביב השטח החלקים של מכסה של קופסת בשימוש קצה פיפטה. כלי חד כגון שיפוד עץ לאחר מכן נעשה שימוש כדי ליצור divot גדול מספיק כדי להכיל כדור מתכת יחיד בכל אחד 96 עמדות. כדי למלא את המכשיר עם מחלק כדורים, עודף של כדורי מתכת הוא שפך על המכשיר והוא מזועזע בעדינות כדי להסיר את הכדורים עודף. פלייט שורש ממוקם אז מעל התקן מחלק, אשר התהפכה לירידה כדור אחד לתוך הבאר כל צלחת הבסיס.
- הוסף 340 מיקרוליטר מתערובת של 3 חלקים מים מזוקקים למים 1 ברז בחלקו של כל אחד פלייט שורש השימוש במכונה MicroFill. ודא כי כדורי פלדה נוספו לוחות שורש לפני מחלק את המים.
- פיל בסרט דביק את התחתון של פלטות שתיל להסיר את מכסי פלסטיק שקוף מן הצלחות. מניחים כל צלחת שתיל בצלחת שורש המכיל כדור מתכת ומים לאבטח את שתי צלחות יחד באמצעות שני חי אלסטיr להקות.
- הנח את הקרח מוערמים יתר צלחות מזרקת קרח יתר. מכסי פלסטיק שקוף לא אמור לשמש כאשר הלוחות נמצאים מזרקת קרח יתר. בדוק כדי לוודא היטב-01 של רפידת שתיל מיושר היטב עם A-01 של רפידת רוט.
- מוערמים שתיל / שורש פלטות יש להשאיר מזרקת קרח יתר עד רוב השתילים יש רקמת שורש חדרה לתוך צלחות רוט. טמפרטורת גידול אידיאלי עבור השתילים ארבידופסיס מזרקה קרח יתר היא CA. 18 ° C. מפלס המים בגיליון עוגיה צריך להיות כזה מים יכולים לזרום לתוך הבארות של פלטות שורש, אך לא עמוק כל כך את השתילים בצלחת שתיל שקועות. אם מפלס המים אינה נכונה תצטרך לקבל נייר אפייה שונים של עומק הנכון.
- הוסף מים מזוקקים מעת לעת מזרקת קרח יתר כדי לשמור על מפלס המים המקורית. על ידי הוספת מים מזוקקים טהורה המזרקה תוכלו להחליף אתנוזל איבדו בשל התאדות מבלי לשנות את הרכב המינרלים של המים במזרקה. רמת המים יש לבדוק מדי יום מזרקת קרח יתר.
4. שורש קציר רקמות
רקמה היא שורש שנקטפו על ידי הקפאת מים בצלחת שורש ולאחר מכן לקלף את פלייט שתיל הרחק פלייט השורש.
- יום לפני הקציר רקמות השורש, להסיר את מוערמים קרח יתר צלחות מן מזרקת קרח יתר.
- הכנס three שיפודי עץ בין הבארות של הנבט מוערמים וצלחות רוט. מטרת שיפודי היא להעלות את ציפורני של פלטות שתיל מתוך בארות של פלטות שורש כהכנה לתהליך הקפאה.
- אפשר מוערמים קרח יתר צלחות עם שיפודי העץ מוכנס לעמוד לילה תחת אורות. הדגירה זה מאפשר אידוי קל של הנוזל בתוך צלחות רוט, אשר מקל על הקפאת הבאים והפרדה תהליכים צלחת.
- עליום הקציר רקמות, להכין אמבטיה ההקפאה. המקום בלוק 96-היטב מתכת תרמית בצלחת פיירקס עם תערובת של קרח יבש אתנול 95%. אפשר לחסום לאזן תרמית בטמפרטורה של CA. 20 דקות. מניחים את צלחת פיירקס על גבי סוג כלשהו של חומר בידוד כגון החיטוי הכפפה כך בטמפרטורה נמוכה אינו גורם נזק לפני השטח של הספסל מעבדה.
- הנח את הקרח מוערמים יתר צלחות עם שיפודי עץ לבלוק דגירה התרמית צונן במשך 5 דקות. במהלך תקופה זו את המים בצלחת רוט יהיה להקפיא מוצק. שתילים בצלחת שתיל לא להקפיא במהלך הטיפול הזה ולהישאר קיימא לחלוטין.
- הסר את מוערמים קרח יתר צלחות מהגוש תרמית ומניחים אותם על הספסל מעבדה בטמפרטורת החדר. הסר את גומיות ואת שיפודי עץ מהצלחות מגובב. היטב ומהדקים על גבי הצלחת שתיל כדי "לפצח" את הצלחות. ואז בזהירות לקלף פלייט שורש ואת פלייט שתיל apהאמנות.
- אפשר מים פלטות רוט להפשיר בטמפרטורת החדר. הפשרה יכולה להיות מזורזת על ידי דוגרים צלחות רוט בבלוק תרמי נקבע על 25 ° C.
5. חנות פלייט שתיל בטמפרטורה נמוכה in the Dark
לאחר הקציר רקמות, הצלחות שתיל ניתן לאחסן בחושך בטמפרטורה נמוכה אשר ישמרו את הכדאיות של השתילים בזמן ניתוח גנוטיפ מבוצע. שתילים ניתן לאחסן אלה הטמפרטורות במשך כמה שבועות מבלי להשפיע על הכדאיות.
- לאחר הקציר רקמות, לאטום את החלק התחתון של הצלחת שתיל עם דבק.
- מניחים מכסה פלסטיק שקוף על גבי צלחת שתיל ובטוחה עם הקלטת micropore.
- סטאק פלטות שתיל כמה יחד ועוטפים בנייר אלומיניום.
- עבור השתילים ארבידופסיס, במקום צלחות ב 4 ° C. עבור שתילי עגבניות, במקום צלחות ב 12 ° C. לאחר genotyping תושלם, seedlings ניתן להסיר הדגירה הזה בטמפרטורה נמוכה מושתלים אדמה כמתואר להלן.
6. הפקת DNA
ה-DNA מתאים PCR תגובות ניתן להוציא בקלות דגימות רקמה מן השורש. התשואה של ה-DNA הכולל התאושש דגימות רקמה ארבידופסיס השורש CA. 400 ng בממוצע 2.
- ודא כי המים פלטות שורש יש מופשר לחלוטין לפני ביצוע הליך מיצוי דנ"א. בדוק את הלוחות כדי לקבוע אם יש כל בארות המים באופן משמעותי פחות מהממוצע. פיפטה יד מים מזוקקים לתוך בארות הדורשים מים נוספים.
- השתמש במכונת MicroFill להוסיף 25 מיקרוליטר של פתרון טריס-EDTA (500 מ"מ טריס, pH 8, 50 mM EDTA, pH8) היטב כל אחד פלטות רוט.
- חותם את הבארות של רוט באמצעות פלטות אלומיניום איטום תרמי ואיטום מכונת חום.
- מקמי את הצלחות שורש חתום על מכונת GenoGrinder עםסוף חתום של צלחות כלפי מטה. זה הכיוון צלחת מספק תנועה חרוז אופטימלי ומונע את החרוזים יידבקו בבארות. נער את צלחות GenoGrinder במשך 3 דקות וחצי בשעה 1350 שבץ לדקה.
- מעבירים את צלחות צנטריפוגה עם ספקים microplate ואת הספין צלחות במשך 10 דקות ב 3500 סל"ד ב 4 ° C עד גלולה רקמת השורש הכתוש.
- תמצית מדוללת כתוצאה מכיל הדנ"א הגנומי שניתן להשתמש בהם ישירות התגובות PCR. בדרך כלל אחד יהיה להוסיף 2 מיקרוליטר של תמצית זו DNA לתגובה PCR.
- במשך האחסון של דגימות ה-DNA, לאטום את האריזה באמצעות סרט microplate מקום דבק על מינוס 20 ° C. דגימות DNA יכול להיות מאוחסן במשך מספר חודשים עם ירידה נראית לעין באיכות.
7. העברת שתילים עם גנוטיפ הרצוי קרקע
לאחר ניתוח גנוטיפ תושלם, שתילים עם גנוטיפ הרצוי ניתן להעביר שתילפלטות לקרקע.
- הסר את פלטות שתיל של אחסון קר להכין סירים בתערובת מים רוויים אדמה.
- כדי להסיר שתיל בודדים פלייט שתיל, יש להשתמש במלקחיים המאפשר אחד כדי לתפוס את התקע אגר ללא ריסוק שתיל. תפוס את התקע אגר עם המלקחיים בעדינות להחליק את התקע אגר מתוך פלייט שתיל נזהרים שלא לפגוע שתיל. לחלופין, אוויר דחוס ניתן להשתמש בעדינות לירות את התקע אגר ו שתיל מתוך הבאר. החל הלחץ חור קטן בתחתית הבאר עד התקע קופץ החוצה על הספסל המעבדה.
- הכן חור קטן באדמה בגודל של התקע אגר. מניחים את אגר תקע בקרקע ולארוז באדמה לחה סביב לחבר את אגר כדי לאבטח את שתיל באדמה. אל תנסה להסיר כל אגר מרחבי הנבט.
- מניחים את השתילים המושתלים בחדר צמיחה צמיחה בתנאים סטנדרטיים. מכסים את הסיר עם מכסה פלסטיקביומיים הראשונים לאחר ההשתלה. לאחר מכן להסיר את המכסה וממשיכים לגדול הצמחים באמצעות תנאים סטנדרטיים.
8. נציג תוצאות:
דוגמה שתילים בוגרים ארבידופסיס באמצעות מערכת קרח יתר מוצג באיור 4 א. שתילים אלו היו במזרקה קרח יתר במשך שבועיים כאשר צולמה התמונה והיו מוכנים לקציר רקמות. רקמת שורש מן שתיל אלה זהה מוצגת באיור 4 ב. הסכום הכולל של ה-DNA שנלקחו מדגם אחד של רקמות השורש ארבידופסיס הוא בדרך כלל בטווח של ng 100-700 ng 2. חישוב תשואה זה מבוסס על שימוש של חלק אחד בלבד של תמצית שורש גולמי. כי רק CA. 10% תמצית שורש גולמי משמש בדרך כלל את תהליך החילוץ DNA, ניתן להשיג DNA גנומית משמעותית יותר לניתוח במורד הזרם על ידי שמירה של יותר לחלץ את גולמי. הסכום הכולל של הדנ"א הגנומי שהושגו באמצעות קרחהליך שווי מספיקה כדי לבצע מאות של תגובות PCR 2.
איור 1: תרשים זרימה של תהליך קרח יתר. א) שתיל צלחת המכילה אגר צמיחה התקשורת שבו שתילים לנבוט. שורשים חודרים אגר ולגדול לכיוון החלק התחתון של הצלחת. חורים בתחתית בארות הצלחת חתומות עם סרט דביק. ב) פלייט שתיל הוא מוערמים זה על גבי מים שורש פלייט המכיל וכדור מתכת. שורשים היציאה חורים בתחתית הבארות של רפידת שתיל ולגדול לתוך הבארות של רפידת רוט. ג) שיפודי עץ מוכנסים בין פלייט שתיל ואת פלייט רוט יום לפני שווי צלחות מגובב הקרח ממוקמים thermoblock באמבט קרח / אתנול יבש. ד) לאחר שהמים פלייט שורש הקפיאה מוצק, צלחת שתיל הוא התקלף מהצלחת שורש, מניב פלייט רוט עם 96 דגימות רקמהוצלחת עם 96 שתילים שתיל קיימא. שיפודי עץ להקל על ההפרדה בין שתי צלחות במהלך שלב זה.
איור 2: תצלומים של שתיל צלחת וצלחת רוט. א) שתיל צלחת וצלחת רוט ראה בנפרד. ב) צלחת שתיל מוערמים זה על גבי צלחת רוט. כדורי פלדה המשמשים להפקת DNA ניתן לראות את בארות המים של פלייט השורש. גומיות משמשים כדי לאבטח את שתי צלחות ביחד.
איור 3: מזרקת קרח יתר. מזרקת קרח יתר משמש כדי לשמור על רמת מים קבועה בגובה המדויק של ראשי הבארות של פלטות רוט. זו מערכת השקיה רציפה מבטיח כי המים בבארות של צלחות שורש לא נעשה מדולדל בשל התאדות או דיות. א) תוצרת בית המדףהתומך נייר אפייה שעליו נערמו קרח יתר פלטות לשבת. ב) להציג תקריב של אחד 1 "אגוזים המספק אמצעי בדיוק התאמת רמת גיליון עוגיה כך עומק המים אחידה מושגת על פני המזרקה. C) תמונה זו מציגה את כל החלקים הדרושים כדי לבנות את תוצרת בית מתלה עבור מזרקת קרח יתר. ד ') התאספו קרח יתר מזרקה. משאבת מזרקה הצוללת הזמן נע מים מהמאגר התחתון אל הסדין עוגיה, הנשענת על גבי תוצרת בית מתלה. מהדק קפיץ המשמש לצרף את הצינור עד לקצה הגיליון עוגייה.
איור 4: שתילים ארבידופסיס גדל באמצעות תהליך קרח יתר. א) להציג למעלה מביט למטה לתוך שתי בארות צלחת שתיל. גם מכילה שתיל ארבידופסיס. ב) הצד לנוכח שתי בארות צלחת רוט. שורשים ניתן לראות פיתולסביב המשטח הפנימי של בארות. השתילים בתמונה הזאת היה מזרקת קרח יתר על CA. שבועיים נמצאים בשלב הצמיחה שם יבול רקמות בדרך כלל להתבצע.
Discussion
שיטת הקרח יתר המוצגים כאן מאפשרת מדען כדי לאסוף דגימות רקמה מתוך מאות או אפילו אלפים, של צמחים בודדים ביום אחד וביעילות לחלץ הדנ"א הגנומי ממדגמים אלה לשימוש התגובות genotyping. על ידי מתן מדען הפרט את היכולת גנוטיפ אלפי שתילים בתקופה קצרה של זמן, את שיטת הקרח יתר יש פוטנציאל להקל על מספר ניסויים גנטיים שאחרת לא להיות מעשיים לביצוע. דוגמאות אחדות מוצגים להלן.
- מיפוי גנטי. פיין בקנה מידה מיפוי גנטי יכול להיות מהיר אם החוקר הוא מסוגל לזהות אירועי רקומבינציה בתוך מרווח מסוים לאורך כרומוזום 3. אם מרווח זה כרוך מרחק גנטי קצר מאוד, אז האירועים רקומבינציה תהיה נדירה יחסית באוכלוסייה מיפוי segregating. מסיבה זו, ייתכן שיהיה צורך לאלפי מסך של צמחים בודדים כדי למצוא מחדש את הרצויאנשים combinant. תהליך זה יכול להיות מהיר מאוד על ידי שימוש יתר קרח. גם בעידן של סידור מחדש הגנום כולו, הוא עדיין צריך להוכיח ישירות מוטציה נתון הוא אחראי ישירות הפנוטיפ של עניין. במקרים אלה, יהיה צורך להפריד את המוטציה עניין הרחק מוטציות קשר הדוק אחרים כדי להוכיח מוטציה מועמד היא בעצם סיבתי. במצבים כאלה, קרח יתר יספק שיטה יעילה לשבירת הקשר בין זוג של מוטציות קשור קשר הדוק.
- Multi-מוטנטים. זה הפך להיות משותף לחוקרים ללמוד ארבידופסיס לשלב אללים מוטנטים שונים של לוקוסים מספר לתוך אדם אחד כדי להתגבר על יתירות תפקודית 4-6. כדוגמה, לשקול מקרה שבו אדם רוצה לשלב אללים מוטנטים מארבע לוקוסים שונים לתוך הצמח יחיד דרך מעבר גנטית. עבור פרויקט זה, יהיה צורך ליצורn אדם אשר הטרוזיגוטיים על ארבעת לוקוסים כחלק מתוכנית המעבר. כאשר הזרע הזה מרובעת-heterozygote קובע, הומוזיגוטי מרובעת צפוי להיות נוכח בשיעור של אחד מתוך 256 באוכלוסייה כתוצאה של הצאצאים. הקרנת לאדם זה נדיר על ידי שיטות מסורתיות יהיה מאוד עבודה אינטנסיבית. לשם השוואה, באמצעות קרח יתר עבור פרויקט זה יספק את המדען עם אסטרטגיה יעילה לזיהוי הומוזיגוטי מרובעת נדיר בדור אחד.
- iTILLING. במעבדה שלנו לאחרונה תיאר גישה חדשנית סינון עבור נוכחות של מוטציות בגנים המושרה עניין 7 ארבידופסיס. שיטה זו היא וריאציה על טכניקה ממוסדת בשם חורש המשמש למצוא מוטציות הורה אוכלוסיות של אנשים שטופלו mutagen כימיים 8-10. יש לנו שם השיטה שלנו iTILLING כי הוא גרסה אישית של חורש המאפשר indמדען ividual להשיג משהו שיש לו חובה מסורתי צוות מחקר גדול להשלים. Ice יתר מהווה חלק בלתי נפרד של השיטה iTILLING 7, כמתואר להלן.
הרעיון מאחורי iTILLING היא לייצר האוכלוסייה מוטציה חלוף, אשר עומד בניגוד לאוכלוסיות מוטנטים עמידים נוצר לפרויקטים לעבד המסורתית. עבור iTILLING, זרעים מתוך אוכלוסייה M2 התנשא נזרעים לתוך 50-100 בלוקים שווי קרח, ו-DNA מופק בשיטת קרח יתר. שתילים ארבידופסיס ממוקמות אז 4 ° C תוך הקרנת מוטציה מתבצעת באמצעות ה-DNA קרח יתר preps. שתילי עגבניות מאוחסנים על 12 ° C.. לאחר שתילים מוטציות הרצוי נושאת זוהו, הם התאוששו הקרח יתר צלחות הועבר אדמה. iTILLING אינו מיועד לספק לאוכלוסייה לטווח ארוך מוטציה למען הקהילה המחקר כולו למסך. במקום זאת, iTILLING מספק האסטרטגיה שבאמצעותהמדען אחד יכול מסך האוכלוסייה מוטציה מותאמות אישית עבור מוטציות קומץ של גנים במהירות, ביעילות, ובמחיר נמוך יחסית.
מצאנו קרח יתר להיות שיטה יעילה לגידול genotyping, ארבידופסיס עגבניות ואורז. אנו צופים כי מינים אחרים של צמחים צריכים גם להיות מקובל יתר קרח. מגבלה אחת על מגוון המינים שניתן לאכלס על ידי Ice-Cap הוא בגודל של הזרעים. רק צמחים עם הזרעים קטן מספיק כדי להתאים לתוך הבארות של צלחת 96-טוב יהיה תואם יתר קרח בתצורה הנוכחית.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי מענק מטעם הקרן הלאומית למדע (מענק מספר MCB-0447750).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GenoGrinder | Spex/CertiPrep, Metuchen, NJ | 2000 Geno/Grinder | Machine for shaking Root Plates for DNA extraction |
| ABgene Thermo-Sealer | ABgene Limited | AB-0384 | Manual heat sealing machine used to Root Plates prior to tissue disruption |
| Centrifuge equipped with swinging microplate carriers | Beckman Coulter Inc. | Allegra 25R | Any centrifuge with swinging microplate carriers would be suitable |
| MicroFill Microplate Dispenser | BioTek | AF1000A | Automated liquid dispenser for filling microplates |
| Bialetti brand 17x11 inch Commercial Large Cookie Sheet | Target Department Store | www.bialetti.com | This specific cookie sheet has the ideal depth for Ice-Cap |
| Custom Made Metal Rack | Hardware Store | See text for full description | |
| 33 Liter plastic storage box | Target Department Store | Sterilite Brand | For Ice-Cap Fountain. Plastic storage box large enough to hold the 17x11 inch cookie sheet |
| 30 gallon per hour Fountain Pump | Sunterra | 104506 | Small submersible fountain pump available at garden supply stores |
| Hose for fountain pump | Any Supplier | Hose compatible with fountain pump | |
| Plastic Clamp | Hardware Store | Clamp to hold hose to cookie sheet | |
| Clear plastic lids from Falcon Microtest flat bottom 96-well polystyrene plates | BD Biosciences | 351172 | Clear plastic lids for covering Ice-Cap Seedling Plates |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| 3/32-inch diameter stainless steel balls | Hartford Technologies, Rocky Hill, CT | 034-006-1K | Used to disrupt root tissue after harvest |
| 3 inch Elastic hair bands | Local Grocery Store | Used to secure Root Plate to Seedling Plate | |
| 4 mm diameter wooden skewers | Local Grocery Store | These skewers are typically used to prepare kabobs | |
| Fisher Scientific Nunc brand, 1-mL filter plates without frit | Fisher Scientific | 278012 | 96-well Seedling Plates with holes in bottom. |
| Fisherbrand 96-Well Tall-Chimney PCR Plate | Fisher Scientific | 14-230-242 | 96-well Root Plates |
| Agar - cell culture tested | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| 4-Morpholin–thanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture | Sigma-Aldrich | M-5524 | |
| Easy Peel heat sealing foil | ABgene Limited | AB-0745 | Heat sealing film for sealing Root Plates prior to tissue disruption |
| Duck Brand Extra Wide Packaging Tape, 3.00" x 54.6 yd | Office Max | Item no. 21242139 | Adhesive tape for sealing microplates containing DNA extracts for storage |
| Sealing Roller | Bio-Rad | MSR-0001 | Hand held rolling tool for pressing adhesive sealing tape onto microplates |
| 96-well metal thermal block | Cole-Parmer | 36400-66 | Used to freeze the Root Plates for tissue harvest |
| Whatman Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1002 090 | Used for surface sterilizing seeds |
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | 5 ¾"disposable Pasteur pipette used for transferring seeds to Seedling Plate |
| Pyrex baking dish (20 cm x 30 cm) | Target Department Store | Used to construct a dry ice/ethanol bath. | |
References
- Clark, K. A., Krysan, P. J. Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0). Plant Methods. 3, 8-8 (2007).
- Krysan, P. I. ce-cap A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis. Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).
- Jander, G. Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era. Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).
- Liljegren, S. J. SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis. Nature. 404, 766-770 (2000).
- Buechel, S. Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration. Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).
- Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis. Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis. Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).
- Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery. Plant J. 45, 684-694 (2006).
- Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics. Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).
- McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).
