Summary
The Ice-Cap-metoden gjør det mulig å dyrke planter i 96-brønn plater og non-destruktivt høster rot vev fra hver frøplante. DNA ekstrahert fra denne roten vev kan brukes for genotyping reaksjoner. Vi har funnet ut at Ice-Cap fungerer godt for
Abstract
Det er blitt vanlig for plante forskere å utvikle prosjekter som krever genotyping av et stort antall planter. Det første trinnet i enhver genotyping prosjektet er å samle en vevsprøve fra hver enkelt plante. Den tradisjonelle tilnærmingen til denne oppgaven er å prøve planter one-på-en-gang. Dersom man ønsker å genotype hundrevis eller tusenvis av individer, men bruker denne strategien resulterer i en betydelig flaskehals i genotyping rørledningen. The Ice-Cap metode som vi beskriver her gir en high-throughput løsning på denne utfordringen ved å la en forsker å samle vev fra flere tusen frøplanter på en enkelt dag 1,2. Dette nivået av gjennomstrømning er gjort mulig ved at vevet er høstet fra planter 96-på-en-gang, snarere enn en-at-a-time.
The Ice-Cap metoden gir en integrert plattform for å utføre frøplante vekst, vev høst, og DNA-ekstraksjon. Grunnlaget for Ice-Cap er fremveksten av seedliNGS i en stablet par 96-brønn plater. Brønnene i øvre plate inneholder plugger av agar vekstmedier som individuelle frøplanter spire. Røttene vokser ned gjennom agar media, avslutter den øvre platen gjennom et hull, og gå over i en lavere plate som inneholder vann. Å høste vev for DNA utvinning, vannet i den nedre plate som inneholder roten vev er raskt frosset mens frøplantene i den øvre platen oppbevares ved romtemperatur. Den øverste platen er da skrellet vekk fra nedre plate, gir en plate med 96 roten vevsprøver frosset i is og en plate med 96 levedyktige frøplanter. Teknikken heter "Ice-Cap" fordi den bruker isen for å fange opp roten vev. 96-brønn plate inneholder frøplantene kan deretter pakket i folie og overført til lav temperatur. Denne prosessen suspenderer videre vekst av frøplantene, men påvirker ikke deres levedyktighet. Når genotype analyser har blitt fullført, kan frøplanter med ønsket genotype bli overført fra 96-brønn Psent til jord for videre forplantning. Vi har vist nytten av Ice-Cap metode å bruke Arabidopsis thaliana, tomat og ris frøplanter. Vi forventer at metoden også bør gjelde for andre arter av planter med frø liten nok til å passe inn i brønnene av 96-brønn plater.
Protocol
1. Forbered Ice-Cap frøplante Plater med Agar Vekst Media
Molten vekstmedier (0.5X Murashige og Skoog (MS) basal salt blanding, 2 mM Morpholinoethanesulfonic syre (MES), 0,6% agar (w / v), 5,7 pH) er utlevert til autoklaveres frøplante Plater med en MicroFill Mikroplate dispenser. En liter av media er nødvendig per 18 frøplante Plates.
- Klargjør vekstmedier i ett liters glassflasker med skrukork lokk og autoklav i 20 minutter.
- Autoclave en liter destillert vann i en glassflaske med skrukork lokk. Samtidig også autoklav tom frøplante Plates innpakket i aluminiumsfolie.
- Overfør autoklaveres media og vann til en inkubator innstilt på 65 ° C. Denne temperaturen vil opprettholde veksten media i smeltet tilstand.
- Etter autoklavering, fjerne frøplante Plates fra folie og legg i laminær flow hette til tørk. Plater må være helt tørt før du fortsetter, slik at limet pakking tape kanfullstendig forsegle hullene på bunnen av brønnene av platene.
- Tørk ned lab benk med 95% etanol for å rense.
- Sug klar plast lokk for frøplante Plates i 95% etanol for å rense. Fjern lokk fra etanol og lufttørke i laminær flow hette. Ikke autoklaver plastlokk å sterilisere dem fordi de vil smelte i autoklaven.
- Gjelder pakking tape til bunnen av hver frøplante Plate og fast forsegle med valsen verktøyet.
- Plasser flaskene av smeltet vekstmedier og sterilisert vann i et vannbad innstilt på 65 ° C.
- Fest en flaske som inneholder 70% etanol ved romtemperatur til MicroFill maskinen og kjør rense syklus to ganger for å rense avløp av MicroFill maskinen.
- Fest flaske med sterilt vann til MicroFill maskinen. Kjør purge syklus seks ganger for å varme avløp og tømme etanol ut av systemet. Den flaske vann bør forbli i 65 ° C bath gjennom denne prosedyren.
- Etter endt utrenskninger med sterilt vann, umiddelbart fester flasken av smeltet vekstmedier til MicroFill maskinen. Kjør purge syklus to ganger for å tømme destillert vann ut av VVS. Flasken av vekstmedier bør forbli i 65 ° C bath gjennom denne prosedyren.
- Tilsett 450 mikroliter av vekstmedier til brønnene i hver frøplante Plate. Arbeid raskt slik at veksten media ikke stivne i avløp av MicroFill maskinen.
- Når alle frøplante platene har blitt fylt, umiddelbart fester flasken på 65 ° C sterilt vann til MicroFill maskinen og kjør rense syklus 12 ganger for å rense avløp. Den flaske vann bør forbli i 65 ° C bath gjennom denne prosedyren.
- Hvis en MicroFill maskin ikke er tilgjengelig, kan frøplante Plates også være forberedt for hånd-pipettere smeltet agar i forseglede platene ved hjelp av en flerkanals pipette.
- Inspiser brønnene i hver frøplante Plater to sikre at veksten media ikke har lekket ut av noen brønner. Hånd pipette ekstra smeltet vekstmedier i individuelle brønner som trengs.
- Dekk hver plate med klar plast lokk, og la vekstmedier til å stivne i frøplante Plates ved romtemperatur. Stack plater og pakk inn i aluminiumsfolie for lagring ved 4 ° C. Oppbevar plater opp ned for å hindre at vann akkumulering i brønnene under lagring.
2. Så frø i Ice-Cap frøplante Plater og spire Seedlings
Vi har tidligere beskrevet en semi-automatisert metode for dispensering Arabidopsis frø til frøplante Plater med et frø lademekanisme (2). Selv om denne enheten kan være nyttig for noen grupper av frø, har vi funnet at variasjonen i frø størrelse vises av ulike grupper av Arabidopsis frø begrenser den generelle nytten av denne enheten. Vi er i ferd med å utvikle en alternativ automatisert metode for frø dispensering, but i dag har vi funnet at den mest effektive strategien for dispensering frø inn i frøplante Plates er å utføre dette trinnet for hånd som beskrevet nedenfor.
- Dryss tørt frø på Whatman filter papir.
- Tilsett 95% etanol på frø, slik at alle frøene er dekket med etanol. Denne behandlingen vil overflaten sterilisere frøene.
- La frø lufttørke.
- Overfør individuelle frø i brønnene på frøplante Plater hjelp av en modifisert engangs glass Pasteur pipette. Slutten av Pasteur pipette er forseglet av flammende spissen. Den resulterende glass tips er fuktet med forsiktig berøring til agar media, som lar en enkelt frø å være lett plukket opp og overføres til overflaten av agar i brønnene til frøplante Plate. En tohodet versjon av dette frøet plating verktøyet kan også brukes til å øke gjennomstrømningen.
- Cover hver frøplante Plate med et klart plastlokk og forsegle med Micropore kirurgisk tape. Vikle stablet tallerkenermed aluminiumsfolie og oppbevar Arabidopsis frø ved 4 ° C i fire dager for å stratify frøene og synkronisere spiring. Tomat frø bør lagres i mørke ved 12 ° C i fire dager.
- Plasser frøplante Plates under fluorescerende lys ved 18 ° til 20 ° C for å starte spiring.
3. Transfer frøplante Plates til Ice-Cap Fountain
Etter frøplante platene har vært under lys for fire dager, overføre frøplante Plates til Ice-Cap fontene. For Arabidopsis blir frøplantene vanligvis igjen i Ice Cap fontenen i 10 til 14 dager.
- Monter Ice-Cap fontenen ved å plassere en cookie ark på toppen av den tilpassede racket struktur som har vært plassert inne i en plastboks. Bruk leveling nøtter for å justere nivået på cookie sheet. Plasser en nedsenkbar pumpe i oppbevaringsboks og fest ut slangen fra pumpen til side av cookie ark ved hjelp av en fjærbelastet CLAmp. Monter Ice-Cap Fountain på en hylle i plantevekst rommet eller vekst kammer, slik at overflaten på Ice-Cap Fountain mottar direkte lysstoffrør.
- Fyll Ice-Cap Fountain med en blanding av tre deler destillert vann til 1 del vann fra springen. Vann bør legges til fontenen til den nedsenkbare pumpen er flere centimeter under vann nivå. Marker den endelige vannivået i plastboks med lab tape og en tusjpenn.
- Forbered Root Plater ved å legge en 3/32-inch diameter rustfritt stål ball til hver brønn av et Root Plate.
- Den rustfrie baller kan legges til Root plater ved hjelp av en skreddersydde ball dispensing enhet 1. Denne enheten er laget ved å plassere en enkelt ark med aluminiumsfolie over overflaten av en 96-brønns PCR plate og bruke en tusjpenn for å markere plasseringen av sentrene for hver brønn på overflaten av folien. Dette markerte ark med folie blir deretter plassert på toppen av ytterligere seks plater av aluminium foril og pakket rundt den glatte overflaten av et lokk fra en brukt pipettespiss boksen. Et skarpt redskap som en trepinne blir så brukt til å lage en divot stor nok til å holde et enkelt metall ball på hvert av de 96 stillingene. For å fylle dette dispensering enhet med baller, er et overskudd av metall baller helles over enheten, og det er forsiktig ristes for å fjerne overflødig baller. The Root Plate er deretter plassert over toppen av dispensering enheten, som er snudd til å droppe en ball i hver brønn av Root Plate.
- Legg til 340 mikroliter av en blanding av tre deler destillert vann til 1 del vann fra springen til hver brønn på Root Plate med MicroFill maskinen. Kontroller at stålkuler har blitt lagt til Root Plates før dispensering vannet.
- Skrell limet filmen off bunnen av frøplante Plater og fjern den gjennomsiktige plastlokk fra platene. Plasser hver frøplante Plate i en Root Plate som inneholder et metall ball og vann og sikre de to platene sammen med to elastiske hair band.
- Plasser stablet Ice-Cap platene i Ice-Cap Fountain. Den klare plastlokk bør ikke brukes når platene er i Ice-Cap Fountain. Kontroller at brønn A-01 av frøplante Plate er på linje med brønn A-01 av Root Plate.
- Den stablede frøplante / Root Plater bør overlates i Ice-Cap Fountain inntil flertallet av frøplantene har rot vev som har trengt inn i Root Plates. Den ideelle vekst temperatur for Arabidopsis frøplanter i Ice-Cap-fontenen er ca. 18 ° C. Vannstanden i cookie sheet bør være slik at vannet kan strømme inn i brønner på Root plater, men ikke så dypt at frøplantene i frøplante Plate er neddykket. Hvis vannivået er ikke riktig trenger du å få en annen cookie ark med riktig dybde.
- Legg destillert vann regelmessig til Ice-Cap Fountain å beholde den opprinnelige vannstand. Ved å legge rent destillert vann i fontenen, vil du erstattevæske tapt på grunn av fordamping uten å endre mineral sammensetningen av vannet i fontenen. Vann nivået bør kontrolleres daglig i Ice-Cap Fountain.
Fire. Høste Root Tissue
Root vev er høstet ved å fryse vannet i Root Plate og deretter peeling den frøplante Plate unna Root Plate.
- Dagen før høsting roten vevet, fjerner stablet Ice-Cap Plater fra Ice-Cap Fountain.
- Sette inn tre tre grillspyd mellom brønnene av stablet frøplante og Root plater. Formålet med grillspyd er å heve nibs av frøplante Plater ut av brønnene på Root plater i forberedelse til frysing.
- La stablet Ice-Cap Plater med tre grillspyd satt til å stå over natten i henhold til lys. Dette inkubasjon gjør liten fordampning av væsken i Root Plater, som letter den påfølgende frysing og plate separasjon prosesser.
- Pådagen av vev innhøsting, utarbeide en frysing bad. Plasser en 96-godt metall termisk blokk i en Pyrex tallerken med blanding av tørris og 95% etanol. La den termiske blokken til stabilisering i temperatur for ca. 20 minutter. Plasser Pyrex tallerken på toppen av noen type av isolerende materiale slik som en autoklav votten slik at den lave temperaturen ikke skader overflaten på lab benken.
- Plasser stablet Ice-Cap plater med tre grillspyd i kjølt termiske blokken og inkuberes i 5 minutter. I løpet av denne tiden at vannet i Root Plate vil fryse solid. Den seedlings i frøplante Plate ikke fryser under denne behandlingen og fortsatt være fullt levedyktig.
- Fjern stablet Ice-Cap plater fra den termiske blokken og plasser dem på lab benk ved romtemperatur. Fjern elastiske bånd og tre grillspyd fra stablet tallerkener. Fast trykke ned på toppen av frøplante Plate til "sprekk" platene. Deretter forsiktig skrelle Root Plate og frøplante Plate apkunst.
- La vannet i Root Plates å tine i romtemperatur. Tining kan bli fremskyndet av incubating de Root Plates i en termisk blokk innstilt på 25 ° C.
5. Oppbevar frøplante Plate på Low Temperature in the Dark
Etter vev innhøsting, kan frøplante platene oppbevares i mørke ved lav temperatur som vil opprettholde levedyktighet av frøplantene mens genotype analyse er utført. Spirene kan lagres på disse temperaturene i flere uker uten at det påvirker levedyktighet.
- Etter vev høste, forsegle den nedre delen av frøplante plate med selvklebende tape.
- Plasser en klar plast lokk på toppen av frøplante Plate og fest med Micropore tape.
- Stack flere frøplante plater sammen og pakk inn i aluminiumsfolie.
- For Arabidopsis frøplanter, plasserer platene ved 4 ° C. For tomat frøplanter, plasserer platene ved 12 ° C. Når genotyping er fullført, seedlings kan fjernes fra denne lave temperaturen inkubering og transplantert til jord som beskrevet nedenfor.
Seks. DNA-ekstraksjon
DNA egnet for PCR reaksjoner lett kan utvinnes fra roten vevsprøver. Utbyttet av total DNA utvinnes fra Arabidopsis roten vevsprøver er ca. 400 ng i gjennomsnitt 2.
- Pass på at vannet i Root Plates er helt tint før du utfører DNA-ekstraksjon prosedyren. Inspiser platene for å fastslå om noen brønner har vesentlig mindre vann enn gjennomsnittet. Hånd pipette destillert vann i brønner som krever ekstra vann.
- Bruk MicroFill maskinen for å legge til 25 mikroliter av en Tris-EDTA-løsning (500 mM Tris, 8 pH, 50 mM EDTA, pH8) til hver brønn på Root Plates.
- Seal brønnene på Root plater ved hjelp av termisk tetting folie og varme forsegling maskin.
- Plasser den forseglede roten plater på GenoGrinder maskinen medforseglet slutten av platene vendt ned. Denne plate orienteringen gir optimal perle bevegelse og hindrer perler fra stikker i brønnene. Rist platene i GenoGrinder i 3 ½ minutter ved 1350 slag per minutt.
- Overfør platene til en sentrifuge med mikroplate transportører og spinne plater for 10 minutter ved 3500 RPM ved 4 ° C til pellet de pulverisert rot vev.
- Den resulterende utvannet ekstrakt inneholder genomisk DNA som kan brukes direkte i PCR reaksjoner. Vanligvis vil man legge til 2 mikroliter av denne DNA-ekstrakt til en PCR-reaksjon.
- For oppbevaring av DNA-prøver, forsegle mikroplate bruke selvklebende pakking tape og plass ved minus 20 ° C. DNA-prøver kan lagres i flere måneder med ingen tydelig reduksjon i kvalitet.
7. Transfer Seedlings med ønsket Genotype til jord
Når genotype analysen er fullført, kan frøplanter med ønsket genotype bli overført fra frøplantePlatene til jord.
- Fjern frøplante Plates fra kjølelagring og forberede potter med vannmettet jord blanding.
- For å fjerne en individuell frøplante fra frøplante Plate, bruk en tang som gjør det mulig å ta tak i agar støpsel uten å knuse frøplante. Ta tak i agar pluggen med pinsett og forsiktig skyve agar pluggen ut av frøplante Plate være forsiktig så du ikke skader frøplante. Alternativt kan trykkluft brukes til å forsiktig skyte agar kontakten og frøplante ut av brønnen. Legge trykk på lite hull i bunnen av brønnen fram til pluggen spretter ut på lab benken.
- Forbered et lite hull i jorden størrelsen på agar pluggen. Plasser agar plugg i jorda og pakk fuktig jord rundt agar pluggen for å sikre frøplante i jorda. Ikke forsøk å fjerne noen av agar fra hele frøplante.
- Plasser transplantert frøplantene i vekst rommet under standard vekstvilkår. Dekk til potten med et plastlokk forto første dagene etter transplantasjon. Deretter fjerner lokket og fortsette å vokse planter ved hjelp av standard vilkår.
8. Representant Resultater:
Et eksempel på Arabidopsis frøplanter dyrket ved hjelp av Ice-Cap-systemet er vist i figur 4A. Disse frøplanter hadde vært i Ice-Cap fontene i to uker da bildet ble tatt og var klare for vev innhøsting. Root vev fra disse samme frøplante er vist i Figur 4B. Den totale mengden DNA ekstrahert fra en prøve av Arabidopsis roten vev er typisk i størrelsesorden 100 ng til 700 ng 2. Dette avkastning beregningen er basert på bruk av bare én del av råoljen rot ekstrakt. Fordi bare ca. 10% av råoljen rot ekstrakt er vanligvis brukes til DNA-ekstraksjon prosessen, er det mulig å få betydelig mer genomisk DNA for nedstrøms analyse ved å beholde mer av råolje ekstrakt. Den totale mengden av genomisk DNA oppnådd ved bruk av Ice-Cap prosedyre er tilstrekkelig til å utføre hundrevis av PCR reaksjoner to.
Figur 1: Flytdiagram av Ice-Cap prosess. A) frøplante Plate inneholder agar vekstmedier som frøplanter spire. Roots penetrerer agar og vokse ned mot bunnen av tallerkenen. Hull i bunnen av brønnene av platen er forseglet med selvklebende film. B) Den frøplante Plate er stablet oppå en Root Plate som inneholder vann og et metall ball. Roots exit hullene i bunnen av brønnene på frøplante Plate og vokse inn i brønner på Root Plate. C) Wooden grillspyd er satt inn mellom frøplante Plate og Root Plate dagen før stablet Ice Cap platene er plassert i en thermoblock i tørris / etanol bad. D) Når vannet i Root Plate har frosset fast, er frøplante Plate skrellet vekk fra Root Plate, som gir en Root Plate med 96 vevsprøverog en frøplante Plate med 96 levedyktige frøplanter. De tre grillspyd lette separasjon av de to platene i løpet av dette trinnet.
Figur 2: Fotografier av en frøplante Plate og et Root Plate. A) En frøplante Plate og en Root Plate sett separat. B) En frøplante Plate stablet oppå en Root Plate. Den stålkuler som brukes for DNA-ekstraksjon kan sees i brønnene på Root Plate. Elastiske bånd brukes til å sikre de to platene sammen.
Figur 3: The Ice-Cap Fountain. The Ice-Cap Fountain brukes til å opprettholde et konstant vannivå ved nøyaktige høyden på toppen av brønnene på Root Plates. Denne kontinuerlige vanning systemet sikrer at vannet i brønnene av roten platene ikke blir utarmet på grunn av fordampning og transpirasjon. A) En hjemmelaget stativsom støtter cookie sheet der stablet Ice-Cap Plates sitte. B) Et nærbilde av en av de 1 "nuts som gir et middel for nettopp å justere nivået på cookie sheet slik at en uniform Havdypet er oppnådd over overflaten av fontenen. C) Dette bildet viser alle deler som trengs for å konstruere hjemmelaget rack for en Ice-Cap Fountain. D) Den monteres Ice-Cap Fountain. en nedsenkbar fontene pumpe stadig flytter vannet fra nedre reservoaret til cookie ark, som hviler på toppen av hjemmelaget rack. En fjærbelastet klemme brukes til å feste slangen til kanten av cookie sheet.
Figur 4: Arabidopsis seedlings dyrket ved hjelp av Ice-Cap prosess. A) Sett ovenfra ser ned i to brønner på en frøplante Plate. Hver brønn inneholder en Arabidopsis frøplante. B) Sidevisning av to brønner i et Root Plate. Røtter kan sees vrirundt den indre overflaten av brønnene. Spirene i dette bildet hadde vært i Ice-Cap Fountain for ca. to uker og er i vekst stadium der vev avling normalt ville bli utført.
Discussion
The Ice-Cap metoden presenteres her gjør en forsker å samle inn vevsprøver fra hundrevis eller kanskje tusenvis, av individuelle planter i en enkelt dag og effektivt ekstrakt genomisk DNA fra disse prøvene for bruk i genotyping reaksjoner. Ved å gi den enkelte forsker muligheten til å genotype tusenvis av frøplanter i løpet av kort tid har Ice-Cap metoden potensial til å rette en rekke genetiske eksperimenter som ellers ikke ville være praktisk å utføre. Flere eksempler er gitt nedenfor.
- Genetisk Mapping. Fin-skala genetisk kartlegging kan bli fremskyndet hvis forskeren er i stand til å identifisere rekombinasjon hendelser innenfor et bestemt intervall langs kromosomet 3. Dersom dette intervallet innebærer en svært kort genetisk avstand, så rekombinasjon arrangementer vil være relativt sjelden i segregering kartlegging befolkningen. Av denne grunn kan det være nødvendig å screene tusenvis av individuelle planter for å finne den ønskede recombinant enkeltpersoner. Denne prosessen kan bli sterkt fremskyndet gjennom bruk av Ice-Cap. Selv i en tid med genome-wide re-sekvensering, er det likevel nødvendig å direkte vise at en gitt mutasjon er direkte ansvarlig for en fenotype av interesse. I disse tilfeller vil det være nødvendig å skille de mutasjon av interesse fra andre nært knyttet mutasjoner for å bevise en kandidat mutasjon faktisk er utløsende. I slike situasjoner vil Ice-Cap gir en effektiv metode for å bryte sammenhengen mellom et par av tett knyttet mutasjoner.
- Multi-mutanter. Det har blitt vanlig for forskere som studerer Arabidopsis å kombinere mutant alleler fra flere forskjellige loci i en enkelt individ for å overvinne funksjonelle redundans 4-6. Som et eksempel vurdere et tilfelle hvor man ønsker å kombinere mutant alleler fra fire forskjellige loci i en enkelt plante gjennom genetiske krysset. For dette prosjektet, vil det være nødvendig å generere enn individ som er heterozygot på disse fire loci som en del av krysset ordningen. Når dette firedoble-heterozygote setter frø, er det firedoble homozygote forventes å være tilstede med en hastighet på én av 256 i den resulterende befolkningen i avkom. Screening for denne sjeldne individuelle ved tradisjonelle metoder ville være ganske arbeidskrevende. Til sammenligning ville bruke Ice-Cap for dette prosjektet gi vitenskapsmann med en effektiv strategi for å identifisere sjeldne firedoble homozygote i én generasjon.
- iTILLING. Vårt laboratorium nylig beskrevet en ny tilnærming til screening for tilstedeværelsen av induserte mutasjoner i genene av interesse i Arabidopsis 7. Denne metoden er en variant av en etablert teknikk som kalles Tilling som brukes til å finne mutasjoner i bestilles populasjoner av individer behandlet med et kjemisk mutagen 8-10. Vi har kalt vår metode iTILLING fordi det er en individuell versjon av Tilling som gjør at et individual forsker for å oppnå noe som tradisjonelt har krevd stor forskerteam å fullføre. Ice-Cap utgjør en integrert del av iTILLING metode 7, som beskrevet nedenfor.
Ideen bak iTILLING er å produsere et flyktig mutant befolkning, som står i kontrast til den holdbar mutant populasjonene opprettet for tradisjonelle Tilling prosjekter. For iTILLING, er frø fra en bulked M2 befolkning sådd inn 50-100 Ice Cap blokker, og DNA er ekstrahert bruker Ice-Cap-metoden. Arabidopsis frøplanter er da plassert ved 4 ° C mens mutasjon screening utføres ved hjelp av Ice-Cap DNA forbereder. Tomato seedlings er lagret ved 12 ° C.. Når seedlings bærer ønsket mutasjoner har blitt identifisert, er de utvinnes fra Ice-Cap plater og overført til jord. iTILLING er ikke ment å gi en langvarig mutant befolkningen for et helt forskningsmiljø til skjerm. I stedet gir iTILLING en strategi deren vitenskapsmann kan sile en tilpasset mutant befolkning for mutasjoner i en håndfull gener raskt, effektivt og til en relativt lav kostnad.
Vi har funnet Ice-Cap å være en effektiv metode for dyrking og genotyping Arabidopsis, tomat, og ris. Vi forventer at andre arter av planter bør også være mottakelig for Ice-Cap. En begrensning på det mangfoldet av arter som kan innpasses ved Ice-Cap er størrelsen på frø. Kun planter med frø liten nok til å passe inn i brønnene på en 96-brønns plate vil være kompatibel med Ice-Cap i sin nåværende konfigurasjon.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av et stipend fra National Science Foundation (Grant nummer MCB-0447750).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GenoGrinder | Spex/CertiPrep, Metuchen, NJ | 2000 Geno/Grinder | Machine for shaking Root Plates for DNA extraction |
| ABgene Thermo-Sealer | ABgene Limited | AB-0384 | Manual heat sealing machine used to Root Plates prior to tissue disruption |
| Centrifuge equipped with swinging microplate carriers | Beckman Coulter Inc. | Allegra 25R | Any centrifuge with swinging microplate carriers would be suitable |
| MicroFill Microplate Dispenser | BioTek | AF1000A | Automated liquid dispenser for filling microplates |
| Bialetti brand 17x11 inch Commercial Large Cookie Sheet | Target Department Store | www.bialetti.com | This specific cookie sheet has the ideal depth for Ice-Cap |
| Custom Made Metal Rack | Hardware Store | See text for full description | |
| 33 Liter plastic storage box | Target Department Store | Sterilite Brand | For Ice-Cap Fountain. Plastic storage box large enough to hold the 17x11 inch cookie sheet |
| 30 gallon per hour Fountain Pump | Sunterra | 104506 | Small submersible fountain pump available at garden supply stores |
| Hose for fountain pump | Any Supplier | Hose compatible with fountain pump | |
| Plastic Clamp | Hardware Store | Clamp to hold hose to cookie sheet | |
| Clear plastic lids from Falcon Microtest flat bottom 96-well polystyrene plates | BD Biosciences | 351172 | Clear plastic lids for covering Ice-Cap Seedling Plates |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| 3/32-inch diameter stainless steel balls | Hartford Technologies, Rocky Hill, CT | 034-006-1K | Used to disrupt root tissue after harvest |
| 3 inch Elastic hair bands | Local Grocery Store | Used to secure Root Plate to Seedling Plate | |
| 4 mm diameter wooden skewers | Local Grocery Store | These skewers are typically used to prepare kabobs | |
| Fisher Scientific Nunc brand, 1-mL filter plates without frit | Fisher Scientific | 278012 | 96-well Seedling Plates with holes in bottom. |
| Fisherbrand 96-Well Tall-Chimney PCR Plate | Fisher Scientific | 14-230-242 | 96-well Root Plates |
| Agar - cell culture tested | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| 4-Morpholin–thanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture | Sigma-Aldrich | M-5524 | |
| Easy Peel heat sealing foil | ABgene Limited | AB-0745 | Heat sealing film for sealing Root Plates prior to tissue disruption |
| Duck Brand Extra Wide Packaging Tape, 3.00" x 54.6 yd | Office Max | Item no. 21242139 | Adhesive tape for sealing microplates containing DNA extracts for storage |
| Sealing Roller | Bio-Rad | MSR-0001 | Hand held rolling tool for pressing adhesive sealing tape onto microplates |
| 96-well metal thermal block | Cole-Parmer | 36400-66 | Used to freeze the Root Plates for tissue harvest |
| Whatman Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1002 090 | Used for surface sterilizing seeds |
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | 5 ¾"disposable Pasteur pipette used for transferring seeds to Seedling Plate |
| Pyrex baking dish (20 cm x 30 cm) | Target Department Store | Used to construct a dry ice/ethanol bath. | |
References
- Clark, K. A., Krysan, P. J. Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0). Plant Methods. 3, 8-8 (2007).
- Krysan, P. I. ce-cap A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis. Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).
- Jander, G. Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era. Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).
- Liljegren, S. J. SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis. Nature. 404, 766-770 (2000).
- Buechel, S. Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration. Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).
- Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis. Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis. Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).
- Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery. Plant J. 45, 684-694 (2006).
- Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics. Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).
- McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).
