Dyrkning og Elektrofysiologi af celler på NRcC Patch-clamp Chips

Summary

Vi viser, hvordan plane patch-clamp-chips fremstillet på National Research Council of Canada er steriliseret, grundes, fyldt med medium, belagt med celler, og anvendes til elektrofysiologiske optagelser.

Abstract

På grund af sin udsøgte følsomhed og evnen til at overvåge og kontrollere de enkelte celler på niveauet af ionkanaler, patch-fastspænding er guld standard for elektrofysiologi anvendes på sygdomsmodeller og farmaceutiske skærme både ^1. Fremgangsmåden traditionelt involverer forsigtigt at kontakte en celle med en glaspipette fyldt med en fysiologisk opløsning med henblik på at isolere en patch af membranen under dens spids ^2. En elektrode indsættes i pipetten indfanger ion-kanal-aktivitet inde i membranen plaster eller, når brydes for hele celler. I det sidste årti har patch-clamp chips blevet foreslået som et alternativ ^{3, 4:} en ophængt film adskiller fysiologisk medium fra dyrkningsmediet, og en åbning mikrofabrikerede i filmen erstatter toppen af pipetten. Patch-clamp chips er blevet integreret i automatiserede systemer og kommercialiseret til high-throughput screening ^5. Til Incrlette gennemløb, omfatter de strømningstekniske levering af celler fra suspensionen, deres placering på åbningen ved sugning, og automatiserede rutiner for at opdage celle-til-probe forseglinger og træde ind i helcelle tilstand. Vi har rapporteret om fremstilling af en silicium patch-clamp chip med optimeret impedans og åbning form, der tillader høj kvalitet optagelse af action potentialer i dyrkede sneglen neuroner ^6, for nylig, har vi også rapporteret om fremskridt i retning af forhør af pattedyr neuroner ^7. Vores patch-clamp-chips er fremstillet på den canadiske Photonics Fabrication Centre ^8, en kommerciel støberi, og fås i store serier. Vi er ivrige efter at engagere sig i samarbejde med electrophysiologists at validere brugen af ​​NRcC teknologi i forskellige modeller. De chips, der anvendes ifølge den almindelige opbygning vist i figur 1: silicium chip er i bunden af ​​en plexiglas kultur hætteglas og bagsiden af ​​åbningen er forbundet med en underjordisk channEl forsynet med rør ved hver ende af emballagen. Cellerne dyrkes i hætteglasset, og cellen på enden af ​​sonden overvåges ved en måleelektrode indsat i channel.The to uden strømningstekniske porte lette opløsning udveksling med minimal forstyrrelse af cellen, hvilket er en fordel i forhold til glaspipetter til intracellulær perfusion.

Figur 1. Princip for måling ved hjælp af NRcC patch-clamp chip

Vi detaljer her de protokoller, der sterilisere og primes chips, indlæse dem med medium, plade dem med celler, og til sidst bruge dem til elektrofysiologiske optagelser.

Protocol

1. Chip fabrikation

Fremgangsmåden beskrevet i ⁶ resulterer i en 3 um tyk selvstændig film, en lav 1 Mohm adgang modstand og en glat overflade tragtformet åbning, der letter en intim forsegling med cellen ^9, se fig 2. De chips er singulated og limet i plexiglas pakker med blænden over et hul forbinder chip til en underjordisk kanal. Limning dispenseres på en måde, der minimerer shunten kapacitansen til en nominel 17 pF. Pakker er forsynet med to 1,5 mm i diameter og 6 mm lange rør, som strømningstekniske porte (figur 3).

Figur 2. Scanningselektronmikrofotografi af en fokuseret ionstråle sektion af en NRcC patch-clamp chip viser en glat siliciumdioxid overflade og tragtform, der begunstiger intime celle-kontakter, og en flad dyse, der udgør en lav adgang resistance.

Figur 3. En chip er limet på bunden af kulturen hætteglasset i en plexiglas pakke forsynet med underjordiske fluidik og glasrør.

2. Sterilisation, grunding og test

Følgende trin skal udføres i en biologi sikkerhedskabinet for at undgå forurening eller tilstopning af hullet.

• Steriliser chips i en Harrick grundlæggende plasma renere (www.harrickplasma.com) med 0,1-0,3 mbar resterende lufttryk i 15 minutter ved maksimal effekt på 18 W. Andre luft plasma systemerne kan anvendes, med sammenlignelig effekttæthed (24 mW / cm ³⁾ og holde produktet af effekttæthed og tidskonstant. Plasmabehandlingen gør også chips hydrofile, hvilket letter priming.
• Passer glasrør med sterilt Silastic Laboratory siliconerør, 1 mm ID x 2 mm OD (Cole ParmerKat. # 96.115-08), 3inch på den ene side en inch på den anden side.
• Fylde fluidik gennem rørene med sterilfiltreret standard phosphatpufferopløsning (PBS), at sørge for ikke boble er fanget.
• Klippe den lange silikoneslange medens tryk PBS fra den korte side ved 1 atm. En pulje af PBS siver gennem åbningen kan være synlige i hætteglasset. Klip tryk levering af PBS og tag den korte silikoneslange fra forsyningen.
• Fylde hætteglasset med filtreret PBS under anvendelse af en sprøjte.
• Nedsænkes en Ag / Ag: Cl elektrode i kort rør, og en modelektrode i hætteglasset. En impedans meter anvendes til at bekræfte, at adgang til modstanden mellem 300kohm og 3Mohm og shunt kapacitans mellem 10pF og 25Pf. En chip med en lavere modstand sandsynligvis har en lækage, og en højere kapacitet anses uhensigtsmæssig til anvendelse som det ikke kan indfange de hurtigste dynamik cellens elektrofysiologi ^6. En chip med en lavere kapacitanseller højere modstand anses sluttet, selvom det kunne være simpelthen at en boble er fanget i åbningen. Nogle chips testes igen efter 1H og fundet at have den korrekte elektrokemiske impedans.
• Skylle strømningstekniske kanal med sterilt deioniseret vand, tømme det øverste hætteglasset og skylles med samme to gange.
• Nedsænkes emballerede chip med rør i frisk sterilt deioniseret vand i 30 minutter og derefter indlæse med andre chips i en steril beholder fyldt med sterilt deioniseret vand. Dette sikrer, at chips forbliver hydrofil, og beskyttet mod forurening.

3. Chips forberedelse i cellebiologi Lab

De følgende trin udføres i et HEPA-filtreret laminar strømningshætte anvendelse af aseptisk teknik, skal alle opløsninger, der anvendes i denne procedure filtreres steriliseres før brug under anvendelse af en 0,22 um filter.

• Åbn en chip beholder under et HEPA filtreret laminar flow hætte og fjerne chips fra container nedad for at undgå øse mulige flydende forureninger i top hætteglasset.
• Skylning toppen af ​​hætteglasset chip 2x med frisk filtreret sterilt deioniseret vand for at fjerne eventuel resterende snavs fra chip overfladen.
• Aspirer sterilt deioniseret vand fra toppen hætteglasset.
• Forbinde den ene ende af silastic-rør fastgjort til den fluide kanal til en tryksat sprøjte indeholdende sterilt filtreret deioniseret vand. I vores system er sprøjter fyldt med opløsning tryk ved forbindelse til en tryklufttank indstillet til 20 psi. For at sikre sterilitet, bliver luften filtreret (0,22 um filter) forud for indtræden i sprøjten, og vores system har også en on / off ventil, der giver os mulighed for at stoppe eller lægge pres når det er nødvendigt.
• Ved hjælp af en hæmostat, udgangsenden af ​​røret klemme.
• Åbne on / off ventiler at presse opløsningen.
• At skylle subterranen strømningstekniske af chippen med frisk sterilt deioniseret vand, løsne klemmerne udgangsenden af ​​røret.
• Til force vand op gennem åbningen, klemme udgangsenden af ​​røret med en hæmostat.
• For at undgå vandafledning, klemme indgangs-og udgangsenderne af slangen med en hemostats og lukke on / off ventiler.
• Løsnes indgangsenden af ​​røret fra sprøjten.
• Indsætte glas propper i begge ender af røret og fjerne hemostats.
• Fyld top hætteglas med filter steriled deioniseret vand.
• Låget af en 35 mm steril skål ind i bunden af ​​en 100 mm steril skål
• Sted chip oven på 35 mm låget og dækslet 100 mm skål låg.
• Billeddata chips for at sikre, at membranen og åbningen af spånerne er fri for snavs og / eller luftbobler. I vores laboratorium har vi anvender en opretstående mikroskop og et 20x lang arbejdsafstand mål.
• Hvis snavs og / eller luftbobler er til stede, skyl fluidisk kanal og top hætteglasset. Hvis snavs og / eller luftbobler ikke kan fjernes chippen kasseres.
• Når de chips, erafbildes, tilbage til laminært flow og trække begge ender af røret.
• Vedhæfte den ene ende af røret til en tryksat sprøjte indeholdende fysiologiske medier.
• Klemme udgangsenden af ​​røret med en hæmostat
• Åbne overtryksventil, fjerne hæmostat fra udgangsenden af ​​fluidik og skyl strømningstekniske kanal med fysiologiske medier
• At skylle underjordiske strømningstekniske med fysiologiske medier, åbne on / off ventiler og fjerne hæmostat fra udgangsenden af ​​røret.
• At tvinge de fysiologiske medier op gennem åbningen, klemme udgangsenden af ​​røret med en hæmostat.
• Clamp input-ende af røret med en hæmostat og lukke on / off ventiler.
• Fjerne indgang ende af røret fra sprøjten og proppen begge ender af røret med glas propper.
• Fjern hemostats.
• Fjerne vandet ovenfra hætteglasset.
• Fyld top hætteglasset med filtersteriliseres fysiologiske medier.
• Placere chip tilbage til 100 mm petriskål.
• Placere bunden af ​​en 35 mm skål i 100 mm skål og fylde den med filtersteriliseret deioniseret vand for at berige fugtighed.
• Dæk fadet, indtil det er tid til plettering

4. Celleudpladning af snegl neuroner

De patch-clamp chips kan være egnet til en række præparater. Vi tester i øjeblikket vores chips med pattedyr primære kortikale neuroner og har fået de foreløbige resultater med celler dyrket i 14 dage ^7, hvilket indikerer, at vores sterilisation protokollen er tilstrækkelig, og at de chips ikke er cytotoksisk i længerevarende kulturer. Med henblik på denne protokol blev sneglen neuroner valgt, fordi de repræsenterer en enkel, men veletableret model til at studere neuronal elektrofysiologi ^11, og det er med de celler, vi har fået de væsentligste resultater til dato ^10. Detaljeret celleisolering og kultur procedurer harblevet beskrevet tidligere ^{12, 13.}

• Fjerne den ydre skal 2-3 måneder gamle Lymnaea stagnalis med stumpe pincet og bedøve dyr i Lymnaea saltvand indeholdende 10% Listerine.

  Alle efterfølgende trin udføres aseptisk i en laminar luftstrøm hætte med steriliseret dissektion udstyr og opløsninger ved stuetemperatur.

• Erstatte fysiologiske medier i fluidik med det passende optagelse opløsning under anvendelse af en Eppendorf-pipette. I tilfælde af Lymnaea neuroner opløsningen indeholder (i mM): 50 KCI, 5 _MgCl2, 5 ethylenbis (oxyethylennitrilo) tetraeddikesyre (EGTA) og 5 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsyre (HEPES; pH 7,4 ; 130 mOsm) ¹⁴
• Pin sneglene i en Sylgard skål fyldt med Lymnaea saltvand og fjerne hele hjernen som tidligere beskrevet ¹³
• Behandle isolated hjerner i definerede medier (DM) med trypsin enzym (0,2% opløsning, Sigma, katalog nr. T-9201) i 18 minutter efterfulgt af behandling i DM og trypsin-inhibitor (Sigma, sojabønne, Catalog # T-9003) i 15 minutter.
• Pin hjernerne i en lille Sylgard skål fyldt med høj osmolaritet definerede medier (HODM - DM med glucose tilsættes 750 pi 1 M glucoseopløsning til 20 ml DM).
• Ved hjælp af fine tænger og dissektion sakse, det ydre og indre lag af ganglierne af interesse fjernes, og udsætter neuronerne.
• Under anvendelse af en flammepoleret glaspipette fyldt med HODM og fastgjort til en mikrosprøjte, forsigtigt sugning nær cellen af ​​interesse (venstre pedal dorsal 1), indtil neuron frigøres fra hjernen og suspenderes i pipetten.
• Den glaspipette bevæges derefter og dyppes i individuelle neurochips hvor blid udsendelse fra mikrosprøjten giver de neuroner, der skal forsigtigt skubbet ud af pipetten og anbringes på toppen af ​​de enkelte patch hullerne på chips.
• Tillader celler at sidde uforstyrret i mindst 2 timer ved stuetemperatur for at fremme deres fastgørelse til spånfladen omgiver åbningen.

5. Elektrofysiologiske optagelser

For at forbinde chips til forstærkeren (i vores tilfælde en Multiclamp 700B forstærker, Molecular Devices, Foster City, CA, USA)

• Erstatte opløsningen i den underjordiske strømningstekniske og chippen hætteglasset med de passende optagelse løsninger. I tilfælde af Lymnaea neuroner, er de øvre kultur kamre fyldes med Lymnaea saltvand (i mM: 51,3 NaCl, 1,7 KCI, 4 CaCl2, og 1,5 MgCl2) pufret til pH 7,9 med HEPES ^14.
• For stabilitet. Lim chippen på et objektglas, og læg det under et mikroskop
• For at tilslutte chip til forstærkeren (i vores tilfælde en Multiclamp 700B forstærker, Molecular Devices, Foster City, CA, USA), skæres den ene ende af slangen og sæt en Silver tråd, der er forbundet til hoved-fase.
• Anbring referenceelektroden i toppen hætteglasset af chippen.
• Chippen er nu klar til optagelse.
• Anvende en 5 mV trin med forstærkeren til måling af total modstand (R _t) og bestemme konfigurationen af neuroner: celle-tilknyttet _(Rt> 1 GQ) helcelle-(Rt = 50-100 MQ plus kapacitiv transienter, vejledende af membranbrud over åbningen), eller nogen tætning _(Rt <5 MQ). I vores sidste sæt af eksperimenter ^10, havde 58% procent af cellerne høj modstand sæler, og af dem, 80% af cellerne viste irritable reaktioner.

6. Repræsentative resultater

• Anvend depolariserende strømimpulser (20 pA tilvækst) til neuron (i dette tilfælde LPeD1).
• Hold neuron ved Vm tæt på sin hvilende potentiale (~ - 60 mV).
• Overhold svarene på disse depolariserende impulser. Overskridelse aktions potentialer børskal overholdes, hvis neuron er levedygtig.
• Figur 4 viser et repræsentativt resultat, der er diskuteret i detaljer i ^{14, 15.}

Figur 4. Voltage reaktioner (øverst) i en LPeD1 neuron til trindelt række intracellulære strømimpulser (nedenfor). De nuværende pulser blev anvendt ved Vm = - 60mV.

Fejlfinding

• Før plating, at billedet chips afgøre, om membranen og blænde er fri for snavs og egnet til plettering. Vi bruger en oprejst mikroskop og en 20x lang arbejdsafstand mål. I vores sidste sæt af forsøg ^1, blev 67% procent af chips succes grundes på denne måde.
• Hvis snavs og / eller luftbobler er til stede kassere chip og prøv en anden.
• Forskellige overfladebehandlinger (plasma) eller overtræk (PDL, PEI etc.) kan prøvet, men succes kan være meget afhængig af celletypenanvendes.
• Sammensætningen af ​​strømningstekniske ("pipette")-opløsning i kritisk for dannelsen af ​​Giga-tætning og hel-celle. Juster løsning, at være opmærksom på osmolaritet, pH og ion-makeup.
• Ved længere tids kultur, begynder med medier i mikrofluidkanal, derefter skifte til pipettering løsning forud for optagelse via blid tyngdekraften fodret perfusion (~ 0,5 ml / min).

Discussion

NRcC patch-clamp chip afhøring platform er et potentielt effektivt redskab til høje informationsindhold farmaceutiske assays og til at undersøge in vitro modeller af sygdom. Dens fordele sammenlignet med glaspipetter er en lav adgang modstand, hvilket er en fordel at probe store celler, og på trods af en noget større kapacitans vil resultere i sammenlignelige dynamik for mindre celler. Spontan celle til blænde sæler er rutinemæssigt blevet indhentet, og hele celleindtastning er blevet observeret at være spontan ^14. En klar forskel mellem chips og glaspipette metode er, at proben er en del af celledyrkningsskål og ikke manuelt bringes i kontakt med cellemembranen. Dyrkning af celler, eventuelt en del af funktionelle net, resulterer i mere biologisk relevante modeller som sygdomsmodeller og en anden mekanisme til fastgørelse høj celle til at probe forseglinger ^16. Imidlertid, i modsætning til cellesuspensioner, canno aspirationt anvendes til at positionere en celle på proben. Sneglen neuroner, som andre store celler, er egnede til manuel placering på toppen af ​​sonden. For mindre celler kræver længere kultur gange, har vi undgås behovet for en manipulation og holde en høj sandsynlighed for at opnå en forsegling ved mønstring vedhæftning polypeptider oven af ​​proberne til at placere celler oven på prober, og viste placering af celler på sonde ^17,18.

NRcC udvikler også en polyimid mikrofluid patch-clamp chip ¹⁹ med en kapacitans sammenlignelig med glaspipette. Det endelige mål for dette projekt er en multiple-sonder patch-clamp-chip, som gør det muligt samtidig monitorering af den elektrofysiologiske aktivitet i flere neuroner involveret i netværket adfærd på løsningen af de enkelte ionkanaler ^14. Denne metode er en høj opløsning supplerende metode til multi-elektrode-arrays 20.