Hücreler NRCC Patch-klemp Chips kültür ve Elektrofizyoloji

Summary

Biz hücreler ile kaplanmış orta yüklenen astarlanmalıdır Kanada Ulusal Araştırma Konseyi, sterilize edilir,, fabrikasyon ve elektrofizyolojik kayıtlar için kullanılan düzlemsel patch-klemp cips göstermektedir.

Abstract

Onun zarif duyarlılık ve iyon kanallarının düzeyinde tek tek hücrelerin izlenmesi ve kontrol etme yeteneği sayesinde, yama-klemp Elektrofizyolojinin altın standart hem ¹ hastalık modelleri ve ilaç ekranlar uygulanır. Bu yöntem, geleneksel bir cam pipet ile bir hücre tarafından doldurulacak bir yama membran, doruğuna ² altında izole etmek için bir fizyolojik çözelti yavaşça başvurmadan içerir. Pipet takılı bir elektrot, membran rüptürü yama veya tüm hücre içinde iyon kanal aktivitesini yakalar. Son on yıl içinde, patch-klemp cips, ^{3, 4} alternatif olarak ileri sürülmüştür: bir asma film kültür ortamından fizyolojik orta ayırır ve, film microfabricated bir diyafram pipet apeks değiştirir. Patch-klemp çipleri otomasyon sistemleri entegre ve yüksek throughput tarama ⁵ için satışa sunulmuştur. Incrhacmi kolaylığı, hücre-probe mühürler algılamak ve tüm hücre moduna girmek için akışkan süspansiyon hücreleri teslimat, emme diyafram üzerinde konumlarını ve otomatik rutinleri içerir. Biz optimize empedans ve aksiyon potansiyelleri ⁶ kültürlü salyangoz nöronlar yüksek kaliteli kayıt izin delik şekli patch-klemp bir silikon çip üretim bildirdin; son zamanlarda, biz de memeli nöronlar ⁷ sorguya doğru ilerleme var. Patch-klemp cips Kanada Fotonik Üretim Merkezi ^8, ticari bir döküm imal ve büyük seriler mevcuttur. Biz, farklı modellerde NRCC teknoloji kullanımı doğrulamak için electrophysiologists ile işbirliği yapmaya istekli. Şekil 1'de temsil genel şemasına göre yongaları kullanılır: silikon çip bir pleksiglas kültür şişe ve diyafram arka alt bir yeraltı chann için bağlıEl paketinin iki ucunda tüpleri ile donatılmıştır. Hücreler flakon kültüre ve sonda üst hücre ölçüm elektrodu, akışkan portları hücreye az düzeyde rahatsızlık vererek çözüm alışverişini kolaylaştırmak dışında iki channel.The takılı bir tarafından izlenir; intrasellüler için cam pipetler göre bu bir avantaj perfüzyon.

Şekil 1. yama klemp NRCC çip kullanan ölçüm prensibi

Biz burada detay sterilize ve asal cips, onlara yük hücreleri ile orta, plaka, ve nihayet elektrofizyolojik kayıtlar için bunları kullanmak için protokolleri.

Protocol

1. Chip imalat

3 mikron kalınlığında kendi başına durabilen bir film, düşük 1 Mohm erişim direnci ve hücre ⁹ ile samimi bir mühür kolaylaştıran bir düz yüzeyli huni şekilli diyafram ⁶ sonuç açıklanan süreç, şekil 2'ye bakınız. Cips çipi bir yeraltı kanalına bağlayan bir delik karşı karşıya diyafram ile singulated ve pleksiglas paketleri yapıştırılmalıdır. Yapıştırma nominal 17 pF, şant kapasitans en aza indirir bir şekilde dağıtılır. Paketleri iki adet 1.5 mm çapında ve akışkan limanlar olarak 6 mm uzunluğunda cam tüpler (Şekil 3) ile donatılmıştır.

Şekil 2 yama klemp bir NRCC çip odaklı iyon demeti bölümünde elektron mikroskobu Tarama yumuşak bir silikon dioksit yüzey ve samimi hücre bağlantıları yana huni şekli ve sığ bir delik düşük bir erişim dayanımı hesapları olduğunu gösterire.

Şekil 3,, yeraltı akışkansal ve cam tüpler ile donatılmış bir Pleksiglas paketi, bir çip içinde, kültür flakonun dibinde yapıştırılır.

2. Sterilizasyon, doldurma ve test

Aşağıdaki adımları, diyafram kirlenme veya tıkanmayı önlemek için bir biyoloji güvenlik kabini yapılmalıdır.

• 18 W. Diğer hava plazma sistemleri maksimum güçte 15 dakika için 0.1-0.3 mbar artık hava basıncı ile harrick temel plazma temizleyici (www.harrickplasma.com) cips sterilize karşılaştırılabilir güç yoğunluğu (24 mW ile kullanılabilir / cm ³⁾ ve güç yoğunluğu ve ürünün sabit tutmak. Plazma tedavisi de astar kolaylaştıran, cips hidrofilik vermektedir.
• Steril silastik Laboratuvar silikon tüp, 1mm ID x 2mm OD (Cole Parmer cam tüpler FitCat. # 96115-08) bir tarafında, 3 inç, diğer tarafta 1 inç.
• Hiçbir kabarcık tutulur emin olun, steril filtre standart Fosfat Tampon Çözeltisi (PBS) ile tüpler aracılığıyla akışkansal doldurun.
• 1 atm kısa kenarı PBS basınçlandırma ise uzun silikon tüp Clip. Delikten sızan, PBS bir havuz, flakon görünür olabilir. PBS basınçlı kaynağı Klip ve bu kaynağı kısa bir silikon tüp ayırmak.
• Flakon, PBS bir şırınga kullanılarak filtrelendiğini ile doldurun.
• Cl kısa tüp elektrot ve bir şişe içinde bir karşı elektrot ve Ag / Ag bırakın. 10pF ve 25pF arasında 300kohm ve 3Mohm ve şant kapasitans arasındaki empedans metre erişim direnci olduğunu onaylamak için kullanılır. Düşük bir dirence sahip bir çip, bir kaçak olması muhtemeldir ve bu hücrenin elektrofizyoloji ⁶ hızlı dinamikleri yakalamak olmayabilir gibi yüksek bir kapasitans kullanım için uygunsuz olarak kabul edilir. Daha düşük bir kapasitans ile bir yongaveya daha yüksek bir direnç, bir kabarcık delik içinde sıkışıp basitçe olabilir rağmen, takılı olarak kabul edilir. Bazı yonga, 1H sonra yeniden test edilmiş ve doğru elektrokimyasal empedans sahip bulundu.
• Akışkan kanalı steril deiyonize su ile yıkayın; üst flakonun boşaltılması ve aynı iki kez durulayın.
• Steril deiyonize su ile dolu steril bir kapta diğer çipleri ile yüklemek taze steril deiyonize su tüpleri ile paketlenmiş yonga sonra 30 dakika bırakın. Bu çipleri hidrofilik ve kirlenmeye karşı korunuyor kalmasını sağlar.

3. Hücre biyolojisi laboratuvarı cips hazırlama

Aşağıdaki adımları aseptik teknikler kullanarak bir HEPA filtreli laminer akış kaputu yapılmaktadır, bu yordamı kullanılan tüm çözümler 0.22μm bir filtre kullanarak kullanmadan önce sterilize filtre edilmesi gerekir.

• HEPA filtreli bir laminer akış kaputun altında bir çip kutuyu açın ve conta fişleri kaldırmakasimtotik üst şişeye mümkün yüzen kirletici karıştırıyordu önlemek için yüz aşağı.
• Çip yüzeyde herhangi bir kalıntı enkaz kaldırmak için taze filtre steril deiyonize su ile çip 2x flakon üst durulayın.
• Üst flakon kapalı steril deiyonize su aspire edin.
• Silastik hortumu arasında akışkan kanalı steril süzülmüş deiyonize su içeren basınçlı bir şırınga ekli bir ucunu. Sistemimizde, solüsyonuyla doldurulmuş şırıngalar 20psi üzere ayarlanmış bir sıkıştırılmış hava tankı için bir bağlantı ile basınçlı hale gelirler. Sterilite sağlamak için, hava şırınga girmesinden önce (0.22 mikron filtre) filtre edilmiş ve bizim sistemi de gerektiğinde bize baskı durdurmak veya uygulamak için izin veren bir açma / kapama vanası vardır.
• Hortumu arasında çıkış ucu kullanarak, bir hemostat kelepçe.
• Çözüm basınç / vanaları kapatın açın.
• Taze steril deiyonize su ile çip subterranen akışkan durulama, boru çıkış çözülme.
• Için içindiyafram aracılığıyla ce su, bir hemostat ile boru çıkış sonunda kelepçe.
• Suyu drenajı önlemek için bir hemostat birlikte, boru giriş ve çıkış uçları kelepçe ve / açma kapama vanaları kapatın.
• Şırıngadan boru giriş sonuna ayırın.
• Hortumun her iki ucunda cam fişleri takın ve hemostat çıkarın.
• Üst flakon, filtre steriled deiyonize su ile doldurun.
• 35 mm steril çanak kapağı 100 mm steril çanak üssü haline getirin
• 100 mm çanak kapağı ile 35 mm kapak ve kapağın üstünde yer çip.
• Görüntü cips cips membran ve diyafram enkaz ve / veya hava kabarcıkları serbest olmasını sağlamak için laboratuarımızda biz dik bir mikroskop ve 20x uzun çalışma mesafesi objektif kullanın.
• Enkaz ve / veya hava kabarcıkları varsa, akışkan kanalı ve üst flakon tekrar tekrar yıkayın. Enkaz ve / veya hava kabarcıkları kaldırıldı edilemezse çip atılır.
• Cips kezlaminer akış kapağı, görüntülü dönmek ve hortumun her iki ucunda çıkarın.
• Tek bir borudan ucunu fizyolojiksel ortam içeren basınçlı bir şırınga.
• , Bir hemostat ile hortumun çıkış ucunda Kıskaç
• Basınç vanasını açın, hemostat akışkansal çıkış ucundan kaldırmak ve, fizyolojik medya ile Mikroakışkan kanal yıkayın
• Yeraltı akışkan fizyolojik medya ile durulayın / vanaları kapalı, açık ve Hortumun çıkış hemostatı kaldırın.
• Fizyolojiksel ortam delikten zorlamak için, bir hemostat ile hortumun çıkış ucu kelepçe.
• Hemostat ile boru giriş sonuna Kelepçe ve / açma kapama vanaları kapatın.
• Hortumu plug şırınga ve her iki ucunda hortumu glas fişli giriş ucu çıkarın.
• Hemostat çıkarın.
• Üst şişeden su çıkarın.
• Filtre steril fizyolojik medya ile üst flakon doldurun.
• 100 mm petri içine çip geri yerleştirin.
• 35 mm çanak taban 100 mm kabına yerleştirin ve nem zenginleştirmek için filtre steril deiyonize su ile doldurun.
• Kaplama için zamanı gelene kadar çanak Kapak

4. Salyangoz nöronlarının hücre kaplama

Yama-kelepçe yongaları, çeşitli preparatları için uygun olabilir. Şu anda memeli Primer kortikal nöron dökülmesinin test ve sterilizasyon protokolü yeterli olduğunu gösterir ve cips, uzun vadeli kültürlerinde sitotoksik olmadığı 14 gün ^7, kültüre hücreleri ile elde edilen ilk sonuçlar. Onlar, nöronal elektrofizyoloji ¹¹ okumak için basit ama köklü bir modeli temsil eder, çünkü bu bizim için en önemli sonuçları tarihi ¹⁰ edindiğiniz bu hücreler ile, bu protokolün amacı doğrultusunda, salyangoz nöronlarının seçilmiştir. Ayrıntılı hücre izolasyonu ve kültürü prosedürleri varÖnceden ^{12, 13} tarif edilmiştir.

• Çıkarın, Listerine içeren% 10 Lymnaea tuzlu künt forseps ve uyutmak hayvanlar ile 2-3 aylık Lymnaea stagnalis dış kabuk.

  Tüm sonraki basamaklar oda sıcaklığında sterilize diseksiyonu ekipman ve çözümleri ile bir laminer hava akımı kaput içinde aseptik yapıldı.

• Eppendorf pipet kullanarak uygun kayıt çözümü ile akışkansal fizyolojik ortam değiştirin. Durumda Lymnaea nöronların çözüm içerir (mM): 50 KCl, 5 _MgCl2, 5 etilenbis (oxyethylenenitrilo) tetraasetik asit (EGTA) ve 5. 4 - (2-hidroksietil)-1-piperazinetansülfonik asit (HEPES, pH 7.4. 130 mOsm) ¹⁴
• Pin Lymnaea tuzlu su ile dolu bir Sylgard kabına salyangoz ve daha önce ¹³ olarak açıklanan tüm beyin kaldırmak
• Isolat tedavi18 dakika 15 dakika tedavi için DM ve tripsin inhibitörü (Sigma, Soya, Katalog # T-9003) takip ed tripsin enzimi ile tanımlanan medya beyinleri (DM) (% 0.2 'Çözüm, Sigma, Katalog # T-9201).
• (-; 1M glukoz çözeltisi 20 mL DM 750 uL glukoz eklendi DM HODM) medya tanımlanan yüksek ozmolarite dolu küçük Sylgard, çanak beyinleri Pin.
• Ince forseps ve diseksiyon makas kullanarak, nöronlar açığa ilgi gangliyonların dış ve iç kılıf çıkarın.
• , Ilgi (sol pedalı dorsal 1) hücre yakınındaki nazik emme uygulamak,, nöron beyin ayrılır ve, pipet içinde süspanse edilmekte kadar bir yangın cilalı cam pipet ile doldurulur HODM ve Mikroşırınga iliştirilir.
• Cam pipet sonra taşındı ve yumuşak sınırdışı mikroenjektör, nöronlar pipetle yavaşça dışarı itti ve fiş tek tek yama deliklerin üstüne yerleştirilir üzere sağlar bireysel neurochips daldırılır.
• Hücreleri, diyafram çevreleyen çip yüzeyine bağlılıklarını teşvik etmek için oda sıcaklığında en az 2 saat boyunca rahatsız edilmeden oturup bekleyin.

5. Elektrofizyolojik kayıtlar

(Bizim durumumuzda bir Multiclamp 700B amplifikatör, Molecular Devices, Foster City, CA, USA) amplifikatöre yongaları bağlamak için

• Çözüm, yeraltı Mikroakışkan ve uygun kayıt çözümleri ile çip şişe içinde değiştirin. , HEPES ile pH 7.9,, Lymnaea nöronların durumda üst kültürü odalarına (mM: 51,3 NaCl, 1.7 KCl, 4 CaCI2 ve 1.5 MgCİ2) Lymnaea tuzlu su ile doldurulmuştur tamponlu ¹⁴
• Kararlılık için, yapıştırıcı bir cam slayt üzerine çip ve mikroskop altında yerleştirin.
• Amplifikatör (bizim durumumuzda bir Multiclamp 700B amplifikatör, Molecular Devices, Foster City, CA, USA) çip bağlamak için, hortumun bir ucunu kesti ve Silve eklemekr tel hangi kafa-sahne bağlanmıştır.
• Üste çipi şişe içinde referans elektrotu yerleştirin.
• Çip şimdi kayıt için hazırdır.
• Tüm hücreli (Rt = 50-100 M artı kapasitif geçişlerini, hücre ekli (R _t> 1 GΩ) gösterge niteliğinde: toplam direncini ölçmek _(Rt) ve nöronların yapılandırması belirlemek için amplifikatör ile bir 5 mV adım uygulayın ya da hiç mühür (M R _t <5), membran diyafram üzerinde rüptürü). Son deneyler ¹⁰ hücreleri,% 58 oranında yüksek direnç contalar vardı ve bu hücreler,% 80 uyarılabilen yanıtları gösterdi.

6. Temsilcisi Sonuçlar

• Depolarizan akım darbeleri (20 pA artış), nöron (Bu durumda LPeD1 yılında) uygulayın.
• Vm yakın dinlenme potansiyeli (- 60 mV ~) nöron tutun.
• Depolarizan bakliyat tepkileri gözlemleyin. Overshooting aksiyon potansiyellerinöron uygulanabilir olup olmadığını görülebilir.
• Şekil 4, ^{14, 15} 'de ayrıntılı olarak ele alınmaktadır temsili bir sonucunu göstermektedir.

Şekil 4. Gerilim yanıtları intrasellüler akım darbeleri (aşağıda), kademeli dizi LPeD1 nöron (üstte). 60mV - akım darbeleri Vm = uygulanmıştır.

Sorun Giderme

• Membran ve diyafram enkaz ücretsiz ve kaplama için uygun olup olmadığını kaplama önce, görüntü yongaları belirlemek için. Biz dik bir mikroskop ve 20x uzun çalışma mesafesi objektif kullanın. Bizim son deneyler ^1, cips% 67 oranında başarıyla bu şekilde astarlanmalıdır.
• Enkaz ve / veya hava kabarcıkları varsa fiş atmak ve başka bir tane deneyin.
• Çeşitli yüzey işlemleri (plazma) veya kaplamalar (PDL, PEI vb.) Denenebilir, ancak başarı hücre tipine son derece bağlı olabilirkullanılmıştır.
• Kritik bir mühür giga-ve, bütün-hücre formasyonu için akışkan çözeltisi ("pipet") bileşimi. Osmolarite, pH ve iyonik makyaj dikkat, çözüm ayarlayın.
• Uzun vadede kültür için, sonra nazik yerçekimi beslemeli perfüzyon (~ 0.5 ml / dak) üzerinden kayıt önce çözüm Pipeti geçiş, mikroakışkan kanalı medya ile başlar.

Discussion

Yama-klemp yonga NRCC sorgulama platformu, yüksek bilgi içeriği ilaç deneyleri için potansiyel olarak güçlü bir araçtır ve hastalığın in vitro modeller araştırmak için. Büyük hücreler yoklamak bir avantajı, bir düşük erişim direnci, cam pipet ile karşılaştırıldığında avantajları vardır, ve biraz daha büyük bir kapasitans rağmen küçük hücreler karşılaştırılabilir dinamiği neden olur. Rutin diyafram mühürler spontan hücre elde edilmiştir ve bütün hücreye girişi spontan ¹⁴ olduğu saptanmıştır. Probun, hücre kültürü çanağı parçasıdır ve elle, hücre membranı ile temas getirilen gerçeğine arasında açık bir fark, cips ve cam pipet yöntemi olup. Hücreleri kültür, muhtemelen fonksiyonel ağları parçası, hastalık modelleri olarak daha fazla biyolojik olarak amaca uygun modeller sonuçları ve mühürler ¹⁶ yoklamak için yüksek hücre güvenliğini sağlamak için farklı bir mekanizma. Ancak, hücre süspansiyonları ile kontrast, aspirasyon bulaşmıyort, prob bir hücre konumlandırmak için kullanılacaktır. Salyangoz nöronlar, diğer büyük hücreler olarak, probun üstüne manuel konumlandırma uygundurlar. Hücrelere artık kültür kez gerektiren küçük hücreler için, biz herhangi bir manipülasyon için ihtiyacı ortadan kalktığı ve prob üst hücrelere yerleştirmek için problar üstüne, desenlendirme adezyon polipeptidlerin tarafından bir mühür elde etme olasılığı yüksek tutmak ve göstermiştir yerleştirme prob ^17,18.

NRCC aynı zamanda gelişmekte olan bir cam pipet ile karşılaştırılabilir bir kapasitans mikroakışkan yama kelepçe çip ¹⁹ poliimid. Bu projenin nihai hedefi, bireysel iyon kanalları ¹⁴ çözünürlükte ağ davranışı yapan birkaç nöronlarının elektrofizyolojik aktivitenin eş zamanlı izleme sağlar. Çoklu problar patch-klemp yonga Bu yöntem, yüksek çözünürlükte bir çoklu-elektrot dizilerin 20 tamamlayıcı bir yöntemdir.