Odling och Elektrofysiologi av celler på NRCC Patch-clamp Chips

Summary

Vi visar hur plan patch-clamp chips tillverkas vid National Research Council of Canada steriliseras primas, laddad med medium, klädd med celler och används för elektrofysiologiska inspelningar.

Abstract

På grund av dess utsökta känslighet och förmåga att övervaka och kontrollera enskilda celler på nivå jonkanaler är patch-clamping den gyllene standarden för elektrofysiologi tillämpas på sjukdomsmodeller och farmaceutiska skärmar både ^1. Metoden innefattar traditionellt försiktigt bringa en cell med en glaspipett fylld med en fysiologisk lösning i avsikt att isolera en lapp av membranet under dess spets ^2. En elektrod införd i pipetten fångar jonkanalaktivitet i membranet lapp eller, när brustit, för hela cellen. Under det senaste årtiondet har patch-clamp chips föreslagits som ett alternativ ^{3, 4:} en upphängd film skiljer fysiologiska mediet från odlingsmediet och en öppning mikrofabricerade i filmen ersätter toppen av pipetten. Patch-clamp chips har integrerats i automatiserade system och kommersialiseras för high-throughput screening ^5. Att incrunderlätta genomströmningen, omfattar de fluidic leverans av celler från suspension, deras placering på öppningen genom sugning, och automatiserade rutiner för att upptäcka cell-till-sond tätningar och ingå hel cell-läge. Vi har rapporterat om tillverkning av en kisel patch-clamp-chip med optimerad impedans och mynning form som tillåter inspelning med hög kvalitet på aktionspotentialer i odlade snigel neuroner ^6, nyligen har vi också rapporterat framsteg när förhör däggdjur nervceller ^7. Våra patch-clamp chips tillverkas i kanadensiska Photonics Fabrication Centre ^8, en kommersiell gjuteri, och finns i stora serier. Vi är angelägna om att engagera sig i samarbeten med Elektrofysiologer att validera användningen av NRCC tekniken i olika modeller. Flisen som används enligt det allmänna schemat som visas i figur 1: kiselchipset är vid botten av en Plexiglas kultur flaska och baksidan av öppningen är förbunden med en underjordisk channel försedd med rör vid vardera änden av förpackningen. Cellerna odlas i flaskan och cellen på toppen av sonden övervakas genom en mätelektrod insatt i channel.The två yttre fluidiska portar underlätta lösning utbyte med minimal störning av cellen, vilket är en fördel jämfört med glaspipetter för intracellulär perfusion.

Figur 1. Mätprincipen använda NRCC patch-clamp chip

Vi detalj här protokollen för att sterilisera och prima marker, ladda dem med medium, tallrik dem med celler och slutligen använda dem för elektrofysiologiska inspelningar.

Protocol

1. Chiptillverkningen

Den process som beskrivs i ⁶ resulterar i en 3 | im tjock självstående filmen, en låg 1 Mohm tillgång motstånd och en slät yta trattformad öppning som underlättar en intim tätning med cellen ^9, se figur 2. Flisen avdelad och limmas i plexiglas paket med öppningen mot ett hål som förbinder chip till en underjordisk kanal. Limningen dispenseras på ett sätt som minimerar shuntkapacitans till en nominell 17 pF. Paket är försedda med två 1,5 mm diameter och 6 mm långa glasrör som fluidic portarna (Figur 3).

Figur 2. Svepelektronmikrofotografi av en fokuserad jonstråle sektion av en NRCC patch-clamp-chipet visar en slät yta kiseldioxid och trattform som gynnar intima cellkontakter och ett grunt öppning som står för en låg åtkomst resistance.

Figur 3. En krets är limmad vid botten av kulturen flaskan i en plexiglas-paketet försedd med underjordiska fluidik och glasrör.

2. Sterilisering, priming och testning

Följande steg skall utföras i en biologi säkerhetsbänk för att undvika förorening eller igensättning av öppningen.

• Sterilisera marker i en Harrick grundläggande plasma renare (www.harrickplasma.com) med en 0,1-0,3 mbar kvarvarande lufttrycket i 15 minuter vid maximal effekt 18 W. Andra luftplasma system kan användas, med jämförbar effekttäthet (24 mW / cm ³⁾ och att hålla produkten av effekttätheten och tidskonstanten. Plasmabehandlingen gör också flisen hydrofil, vilket underlättar initiering.
• Montera glasrör med steril Silastic Laboratory silikonslang, 1 mm ID x 2 mm OD (Cole ParmerKat. # 96.115-08), 3inch på ena sidan, en tum på den andra sidan.
• Fyll Fluidics genom rören med sterilfiltreras standard fosfatbuffertlösning (PBS), vilket gör att ingen bubbla fångas.
• Kläm fast långa silikonslang samtidigt trycksätta PBS från kortsidan vid 1 atm. En pool av PBS sipprar genom öppningen kan vara synliga i flaskan. Klipp den trycksatta leverans av PBS och ta den korta silikonslangen från leverans.
• Fyll flaskan med filtrerad PBS med hjälp av en spruta.
• Doppa en Ag / Ag: Cl elektrod i det korta röret och en motelektrod i flaskan. En impedans mätare används för att bekräfta att tillgången motståndet är mellan 300kohm och 3Mohm och shuntkapacitans är mellan 10 pF och 25pF. Ett chip med en lägre resistans har sannolikt en läcka, och en högre kapacitans anses olämplig för användning som det kanske inte fånga snabbaste dynamiken i cellens elektrofysiologi ^6. Ett chip med en lägre kapacitanseller högre resistans anses pluggas, fastän det kan helt enkelt vara att en bubbla har fastnat i mynningen. Vissa flisen testas efter 1H, och befanns ha den korrekta elektrokemisk impedans.
• Spola den fluidala kanal med sterilt avjoniserat vatten; tömma vial och skölj med densamma, två gånger.
• Sänk ned förpackade chip med rör i färskt sterilt avjoniserat vatten under 30 minuter och sedan ladda med andra marker i en steril behållare fylld med sterilt avjoniserat vatten. Detta säkerställer att chips kvar hydrofila och skyddas från föroreningar.

3. Chips beredning i cellbiologi lab

Följande steg utförs i en filtrerad HEPA laminärt flöde med aseptisk teknik måste alla lösningar som används i detta förfarande filtreras steriliseras före användning med hjälp av en 0,22 filter.

• Öppna ett chip behållare under en filtrerad HEPA laminärt flöde och ta bort marker från contaexaminator nedåt för att undvika ösa eventuella flytande föroreningar i toppen flaskan.
• Skölj toppen av flaskan med chipet 2x med färskt filtrerades sterilt avjoniserat vatten för att avlägsna eventuellt kvarvarande skräp från spånytan.
• Aspirera sterilt avjoniserat vatten från toppen flaskan.
• Ansluta en ände av silikonplaströr fäst vid fluidiska kanal till en trycksatt spruta innehållande sterilt filtrerat avjoniserat vatten. I vårt system, sprutor fyllda med lösningen är trycksatt genom anslutning till en tryckluft tank satt till 20 psi. För att säkerställa sterilitet, luften filtreras (0,22 m filter) före inträdet i sprutan och vårt system har också en på / av ventil som tillåter oss att stoppa eller utöva påtryckningar när det behövs.
• Användning av en hemostat, klämma fast den utgående änden av röret.
• Öppna på / av ventilerna för att trycksätta lösningen.
• Att skölja subterranen fluidisk av chipset med färskt sterilt avjoniserat vatten, frikoppla den utgående änden av röret.
• Att förce vattnet upp genom öppningen, klämma utgången änden av röret med en hemostat.
• Att undvika att vatten avlopp, klämmer de ingående och utgående ändar av röret med en peanger och stänga på / av ventiler.
• Lösgöra den ingående änden av röret från sprutan.
• Sätt glas pluggar i båda ändarna av röret och avlägsna hemostater.
• Fyll upp flaskan med filter steriled avjoniserat vatten.
• Placera locket på en 35 mm steril skål in i botten av en 100 mm skål sterilt
• Placera marker på toppen av 35 mm lock och täck med 100 mm skål lock.
• Image chips för att säkerställa att membranet och öppningen av markerna är fria från skräp och / eller luftbubblor. I vårt labb använder vi en upprätt mikroskop och en 20x långt arbetsavstånd mål.
• Om skräp och / eller luftbubblor förekommer upprepade gånger spola fluidiska kanal och toppen injektionsflaska. Om skräpet och / eller luftbubblor inte kan avlägsnas chipet kastas.
• Då chipsen äravbildas, återgå till huv med laminärt flöde och koppla båda ändarna av röret.
• Fästa en ände av slangen till ett trycksatt spruta innehållande fysiologiska media.
• Klämma den utgående änden av röret med en hemostat
• Öppna tryckventil, ta bort hemostat från utgången slutet av Fluidics och spola fluidiska kanalen med fysiologiska media
• Att skölja underjordiska fluidic med fysiologiska media, öppna on / off ventiler och ta bort hemostat från utgången slutet av slangen.
• Att tvinga de fysiologiska media upp genom öppningen, klämma fast den utgående änden av röret med en hemostat.
• Klämma ingångsänden av slangen med en hemostat och stänga på / av-ventiler.
• Avlägsna den ingående änden av röret från sprutan och pluggen båda ändarna av röret med glas pluggar.
• Ta bort peanger.
• Avlägsna vattnet från den övre flaskan.
• Fylla den övre flaskan med filtersteriliserade fysiologiska media.
• Placera chipet tillbaka in i 100 mm Petri-skål.
• Placera basen av en 35 mm platta i 100 mm skål och fyll den med filter steriliserat avjoniserat vatten för att berika fukt.
• Täck skålen tills det är dags för plätering

4. Cell plätering av snigel nervceller

De patch-clamp-chips kan vara lämplig för en mängd olika beredningar. Vi testar för närvarande våra marker med däggdjur primära kortikala neuron och har fått preliminära resultat med celler som odlats under 14 dagar ^7, vilket tyder på att vår sterilisering protokoll är adekvat och att chips inte är cytotoxiska i långsiktiga kulturer. För detta protokoll, var snigel nervceller valdes eftersom de representerar en enkel men väl etablerad modell för att studera neuronal elektrofysiologi ^11, och det är med de celler som vi har fått de viktigaste resultaten hittills ^10. Detaljerad cellisolering-och kultur hartidigare beskrivits ^{12, 13.}

• Ta bort den yttre skalet från 2-3 månader gamla Lymnaea stagnalis med trubbiga pincett och bedöva djur i Lymnaea saltlösning innehållande 10% Listerine.

  Alla efterföljande steg utfördes aseptiskt i en laminärt luftflöde huv med steriliserat dissektion utrustning och lösningar vid rumstemperatur.

• Byt fysiologiska medier i Fluidics med lämpliga inspelningen lösningen med en Eppendorf-pipett. I fallet med Lymnaea neuroner lösningen innehåller (i mM): 50 KCl, 5 _MgCl2, 5 etylenbis (oxietylennitrilo) tetraättiksyra (EGTA) och 5 4 - (2-hydroxietyl)-1-piperazinetansulfonsyra (HEPES, pH 7,4 ; 130 mOsm) ¹⁴
• Nåla sniglarna i en Sylgard skål fylld med Lymnaea saltlösning och ta bort hela hjärnan som tidigare beskrivits ¹³
• Behandla ISOLATed hjärnorna i definierade medier (DM) med trypsin enzym (0,2% lösning, Sigma, katalog # T-9201) i 18 minuter, följt av behandling i DM och trypsininhibitor (Sigma, sojabönor, Katalog # T-9003) under 15 minuter.
• Nåla hjärnan i en liten Sylgard skål fylld med hög osmolaritet definieras media (HODM - DM med glukos till; 750 pl 1 M glukoslösning till 20 ml DM).
• Användning fin pincett och saxar dissektion, ta bort det yttre och inre hölje av ganglia av intresse, att exponera de neuroner.
• Med hjälp av en brand polerat glaspipett fylld med HODM och fäst en mikrospruta, tillämpa skonsam sugkraft nära cellen av intresse (vänstra pedalen dorsal 1) tills neuron lossnar från hjärnan och är upphängd i pipetten.
• Den glaspipett sedan flyttas och doppas i enskilda neurochips där lätt utvisning från mikrosprutan tillåter nervceller som försiktigt pressas ut ur pipetten och placeras på toppen av de enskilda plåstret hålen på chips.
• Tillåta cellerna att stå orörd under ett minimum av 2 timmar vid rumstemperatur för att främja deras fastsättning på spånytan omger öppningen.

5. Elektrofysiologiska registreringar

Att ansluta marker till förstärkaren (i vårt fall en Multiclamp 700B förstärkare, Molecular Devices, Foster City, CA, USA)

• Byt lösningen i den underjordiska fluidiska och chipet flaskan med lämpliga inspelning lösningar. I fallet med Lymnaea neuroner, är de övre kultur kamrarna fylls med Lymnaea saltlösning (i mM: 51,3 NaCl, 1,7 KCl, 4 CaCl2, och 1,5 MgCl2) buffrad till pH 7,9 med HEPES ^14.
• För stabilitet, lim chipet på en glasskiva och placera den under ett mikroskop.
• För att ansluta chip till förstärkaren (i vårt fall en Multiclamp 700B förstärkare, Molecular Devices, Foster City, CA, USA), skär den ena änden av slangen och sätta in en Silver tråd, som är ansluten till huvudet steg.
• Placera referenselektroden i den övre flaskan av chipet.
• Chipet är nu klar för inspelning.
• Applicera ett 5 mV steg med förstärkaren för att mäta totala motståndet (R _t) och bestämma utformningen av nervceller: cell-anslutna (R _t> 1 GQ), hel-cell (Rt = 50-100 MQ plus kapacitiv transienter, vägledande av membranet spricker över öppningen), eller någon tätning _(Rt <5 MQ). I vår sista uppsättning av experiment ^10, hade 58% procent av cellerna hög resistans tätningar och av dessa visade 80% av cellerna retbara svar.

6. Representativa resultat

• Tillämpas depolariserande strömpulser (20 pA inkrement) till neuron (i detta fall LPeD1).
• Håll neuron i Vm nära sin vilopotential (~ - 60 mV).
• Observera svaren på dessa depolariserande pulser. Överskridande aktionspotentialer börobserveras om neuron är genomförbar.
• Figur 4 visar ett representativt resultat som diskuteras i detalj i ^{14, 15.}

Figur 4. Voltage svar (övre del) en LPeD1 neuron till graderad serie av intracellulära strömpulser (nedan). De nuvarande pulser tillämpas vid Vm = - 60mV.

Felsökning

• Innan plätering, för att visuellt chips avgöra om membranet och bländare är fria från skräp och lämpar sig för plätering. Vi använder en upprätt mikroskop och en 20x långt arbetsavstånd mål. I vår sista uppsättning av experiment ^1, var 67% procent av marker med framgång grundade på detta sätt.
• Om skräp och / eller luftbubblor finns kasta chip och prova en annan.
• Olika ytbehandlingar (plasma) eller beläggningar (PDL, PEI etc.) kan prövas, men framgång kan vara mycket beroende av celltypanvändas.
• Kompositionen av den fluidala ("pipett")-lösning i kritisk för bildningen av giga-tätningen och hel-cell. Justera lösning uppmärksamma osmolaritet, pH och joniska makeup.
• För längre sikt kultur, börja med media i mikroflödessystem kanal växla sedan till pipettera lösningen före inspelningen via skonsam gravitationen matas perfusion (~ 0,5 ml / min).

Discussion

NRCC s patch-clamp chip förhör plattformen är ett potentiellt kraftfullt verktyg för höga läkemedelsinformation innehåll analyser och för att undersöka in vitro modeller av sjukdom. Dess fördelar jämfört med glaspipetter är en låg tillgång motstånd vilket är en fördel att undersöka stora celler, och trots en något större kapacitans kommer att resultera i jämförbara dynamik för mindre celler. Spontan cell till bländare sälar har rutinmässigt erhållits och hela cellinmatning har observerats vara spontan ^14. En tydlig skillnad mellan chipsen och glaspipett metod är det faktum att sonden är en del av cellkulturen skålen och är inte manuellt bringas i kontakt med cellmembranet. Odling av celler, möjligen en del av funktionella nätverk, resulterar i mer biologiskt relevanta modeller som sjukdom modeller, och en annan mekanism för att säkerställa hög cell för att undersöka sälar ^16. Emellertid, till skillnad från cellsuspensioner, aspiration cannot användas för att positionera en cell på sonden. Snigel neuroner, vilket andra stora celler, är mottagliga för manuell positionering på toppen av sonden. För mindre celler kräver längre kultur tid har vi undanröjt behovet av någon manipulering och hålla en hög sannolikhet att erhålla en tätning av polypeptider mönstring adhesion på toppen av proberna för att placera cellerna på toppen av proberna, och visade placeringen av cellerna på Sonden ^17,18.

NRCC utvecklar också en polyimid mikroflödessystem patch-clamp chip ¹⁹ med en kapacitans som är jämförbar med den hos glaspipett. Det yttersta målet för projektet är en multipel-prober patch-clamp chip som gör det möjligt att samtidigt övervakning av elektrofysiologiska aktivitet av flera nervceller som deltar i nätverket beteende vid upplösning av individuella jonkanaler ^14. Denna metod är en hög upplösning kompletterande metod till flera elektrodgrupperna 20.