Summary
우리는 생체내에서 호중구 chemoattractant의 근원에 대한 응답으로 호중구 모집 중에 동적으로 호중구 - 내피 세포 상호 작용을 측정하기위한 brightfield intravital 현미경의 프로토콜을 설명합니다. 호중구 intraluminal 크롤링, 마우스 cremaster 근육 조직에 transendothelial 마이 그 레이션 및 chemotaxis 시간은 타락한 동영상 사진 및 ImageJ와 추적과 시각입니다.
Abstract
혈류에서 염증 조직 leukocytes 순환의 모집은 염증의 1,2의 결정과 복잡한 프로세스입니다. 염증 조직의 postcapillary venules에서 venular 벽 luminal 표면에 처음에는 밧줄과 롤 leukocytes. 내피에 leukocytes 연금을 롤백하고 케모카인 또는 venular 표면에 다른 chemoattractants에 대한 응답으로 확고한 접착력을 받고있다. 많은 자기편 leukocytes이 내피에있는 junctional 넘쳐 흐름 사이트에 부착의 초기 사이트에서 재배치, 프로세스 intraluminal 3를 크롤 링 칭했다. 크롤링 다음, leukocytes는 chemoattractant의 소스 (chemotaxis) 4쪽으로 extravascular 조직에서 내피 (윤회)를 통해 이동하고 마이 그 레이션. Intravital 현미경은 생체내에서 백혈구 - 내피 세포 상호 작용을 시각화하고 백혈구 모집 2,5의 세포 및 분자 메커니즘을 드러내는위한 강력한 도구입니다. 이 보고서에서는, 우리는 호중구 chemoattractant의 경사도에 대응 마우스 cremaster 근육에서 호중구 모집의 세부 프로세스를 시각화하고 결정하는 brightfield intravital 현미경을 사용하는 포괄적인 설명을 제공합니다. 호중구 채용, 호중구 chemoattractant MIP - 2 (CXCL2, CXC의 케모카인) 또는 WKYMVm (TRP - LYS - 티르 - 발 - D - 만났고, 합성 아날로그를 포함한 아가로 오스 겔의 작은 조각 (~ 1 mm 3 크기)를 유도하기 위해 세균성 펩타이드의)는 관찰 postcapillary venule에 인접한 근육 조직에 배치됩니다. 시간 타락한 비디오 촬영 및 컴퓨터 소프트웨어 ImageJ, 내피, 호중구 transendothelial 마이 그 레이션 및 조직에서 마이 그 레이션 및 chemotaxis에 호중구 intraluminal 크롤 링 시각 및 추적과 함께. 이 프로토콜은 intraluminal 크롤링 속도, 윤회 시간, 분리 시간, 마이 그 레이션 속도, chemotaxis 속도와 조직의 chemotaxis 지수 많은 호중구 모집 매개 변수의 신뢰성 및 정량 분석이 가능합니다. 우리는이 프로토콜을 사용하여 이러한 호중구 모집 매개 변수가 안정적으로 결정하고 단세포 운동이 편리 생체내에서 추적할 수있다는 것을 보여준다.
Protocol
1. 아가로 오스 겔에 Chemoattractant의 준비
- 피펫 10 50 ML 원뿔 튜브 2 × PBS의 ML, 그리고 뜨거운 물이 들어있는 비커에 넣고하여 튜브를 따뜻하게.
- 피펫 10 증류수의 ML 다른 50 - ML 원뿔 관에 0.4 g 아가로 오스 분말을 추가 (약간 느슨하게의 모자)와 혼합 가열 (700 와트 전자렌지에서 ~ 1 분) 전자 레인지에 불과 끓는까지 .
- 아가로 오스 솔루션 튜브, 소용돌이 혼합 용액에 예열이 × PBS를 추가하고 뜨거운 물을 비커에 따뜻하게 유지.
- Micropipette의 chemoattractant 3 μl 인도 잉크를 포함하는 1.5 - ML Eppendorf 튜브의 뚜껑에 솔루션 (예 : CXC의 케모카인 1 ㎜의 WKYMVm의 MIP - 2 또는 12 μl의 0.5 μg의 10 μl)와 (방지 micropipette를 사용 흡인하여 잘 섞는다 공기 방울).
- 뚜껑에 200 μl pipet 팁 및 아가로 오스 솔루션 (42 ° C)의 micropipette 110 μl의 팁 끝을 잘라 즉시 다른 피펫 팁을 (공기 방울을 방지)를 사용하여 잘 섞는다.
- 4에서 chemoattractant 함유 겔을 저장 ° C.
2. Intravital 현미경에 대한 Cremaster 근육의 준비 (그림 1)
- 10 MG / kg xylazine 200 MG / kg 케타민을 하이드로 클로라이드의 혼합물의 IP 주사하여 성인 남성이 마우스를 마취.
- 오른쪽 외부 경정맥 정맥과 전기 면도기와 음낭의 앞쪽에을 통해 지역을 면도. 마취 후, anesthetized 마우스 특별한 관심과주의를주는 것이 중요합니다. 가열 램프는 저체온증에서 마우스를 방지하기 위해 사용할 수 있습니다. 마우스 통증 반응에서 무료로해야합니다.
- , 수평 절개를 찾아 100 U / ML 헤파린의 식염수에 가득한 PE - 10 튜브를 사용하여 경정맥 정맥을 ...에 카테 테르를 꽂다. 필요한 경우 경정맥 혈관의 Catheterization은 추가 anesthetics 마약의 관리를 위해 필요합니다.
- 마우스가 집에서 만든 cremaster 근육 보드 (그림 1)에 얼굴을 거짓말로 배꼽 테이프와 마우스 뒷다리를 수정.
- cremaster 근육 및 마우스 몸을 따뜻하게 유지하기 위해 37 ° C의 물 순환 장치에 보드를 연결합니다.
참고 : 2.6에서 2.14로 모든 절차가 매우 부드럽게 5 수행해야합니다.
- 왼쪽 cremaster 근육을 노출 scrotal 피부에 절개를합니다. 관련 근막에서 근육을 조심스럽게을 해부하다.
- 37과 cremaster 근육을 Superfuse ° C - 예열 연동 펌프를 사용하여 (131.9 NaCl, MM의 4.7 KCl, 1.2 MgSO 4, 20 NaHCO 3,, 산도 7.4) 염분 중탄산염 버퍼.
- cremaster 근육 보드의 명확한보기 유리 받침대에 잡아 cremaster 근육의 말초 끝에 4-0 치료를 묶어.
- 길이 방향 cremaster 근육을 부식. 4-0 봉합사로, 근육 평면을 보유하고 받침대에있는 가장자리를 따라 그것을 확보. 기본 근육의 고환과 epididymis을 분리하여 복강으로 그들을 이동합니다.
- ~ 0.6 37 ° C - 예열 재관류 버퍼와 ML / 분 및 22 노출된 근육 커버 × 22mm 유리 coverslip에있는 근육 Superfuse.
- , 현미경 무대에 cremaster 근육 보드를 놓습니다 현미경 근육을 검사, 적절한 postcapillary venule을 (똑바로 unbranched이며 일반 전단 속도와 25-40 μm의의 직경을 가지고있는 venule 선택) 찾아 비디오 카메라를 조정 venule은 TV 모니터 중 하나를 왼쪽이나 오른쪽 끝에 수직 위치에서 시각 수 있도록합니다.
- 30 분의 평형 후, 비디오 레코더를 사용하여 기본적인 제어 데이터로 5 분 선택한 postcapillary venule의 영상 이미지를 기록합니다.
- superfusion를 중지하고 근육에 coverslip을 제거합니다.
- 350 μm의에서 preselected 영역에 cremaster 근육의 표면에 ~ 1 mm 3 크기 chemoattractant 함유 젤 장소 및 병렬 관찰 postcapillary venule로, 장소에 젤 잡아 coverslip을 추가하고 매우에서 근육 조직을 superfuse 천천히 출시 및 겔의 형성 chemoattractant의 그라디언트의 설립을 허용하는 속도가 느린 속도 (≤ 10 μl / 분).
- chemoattractant 포함된 젤의 추가 90 분 영상 이미지를 기록합니다. 녹음하는 동안, 조정 및 준수에 현미경 초점을 유지, 크롤 링 transmigrating 및 venule 내부와 근육 조직에 leukocytes을 chemotaxing.
- 실험 후, 분석을 위해 컴퓨터에 비디오 파일을 가져옵니다.
3. ImageJ를 사용하여 셀 추적
- 컴퓨터에서 추출하여 AVI 포맷 (예, AVI 파일을 DVD 비디오로 변환 무료 컴퓨터 소프트웨어 bitRipper를 사용)에 동영상을 변환합니다.
- 시간 타락한 동영상을 생성하는 비디오 편집 소프트웨어를 사용합니다. 예를 들어, 시간이 타락한 영화 (512분의 1 또는 1천24분의 1 시간 - 경과하기 위해 Windows Movie Maker를 사용하여원래, 실시간 비디오에서 t 30 FPS 속도). 변환 및 DV - AVI 형식으로 압축 시간 타락한 영화를 저장할 수 있습니다.
- 같은 현미경 설정에 따라 교정 마이크로 미터의 이미지를 기록, 컴퓨터에 이미지를 가져오려면, ImageJ로 이미지를 엽니다. ImageJ에서 총 픽셀 화면 (예를 들어, 720 × 480 픽셀)의 왼쪽 상단에 나타납니다. X와 Y의 축 (예 : 200 × 150 μm의) 모두에서 화면의 크기를 측정합니다. 이에서 μm의 당 픽셀 (예를 들어, X = 200분의 720 = 3.6 픽셀 / μm의,와 y = 150분의 480 = 3.2 픽셀 / μm의)의 개수를 계산합니다.
- 동영상을 가져오려면, 오픈 ImageJ 다시, "QT 영화 오프너"의 인터페이스에서 "OK" "파일 - 가져오기를 사용하는 QuickTime 동영상 플러그인 것은"분석하는 동영상을 선택하고를 누릅니다.
- 세포를 추적하는 "플러그인 - 수동 추적"을 클릭하십시오. 시작하기 전에 추적 하단에있는 필드에 해당 정보를 입력합니다. 간단히,
- 시간 간격 (초)을 = fold-time-lapse/30 (예를 들면, 1020 × 시간 경과가 30분의 1,020 = 34 초 / 프레임 간격 것입니다.)
- X / Y 교정 = 마이크로 미터의 이미지의 보정을 사용하여 μm의 / 픽셀 측정.
- Z 교정 = 0 (마우스 cremaster 근육이 조직 및 세포 크롤링 및 마이 그 레이션의 매우 얇은 층 밝은 필드 transillumination 아래에 약 2 차원뿐입니다 등).
- = 1 중심에 대해 사각형 크기를 검색합니다.
- 도트 크기 / 선 폭 / 글꼴 크기 : 필요한 경우 그들이 조정할 수 있습니다.
- 기준점으로 안정적이고 명확한 지점을 선택합니다. 이 기준점은 모든 실험을하는 동안 변경하고 안정적인 남아있는 명확하고 작은 구조 지점 수 있습니다. 마지막 프레임에 처음부터 참조 지점을 추적하고 "최종 트랙"을 클릭하여 "트랙 추가 '를 클릭합니다. 데이터는 자동으로 결과를 테이블에 나타납니다.
- neutrophils를 크롤 링하고 마이 그 레이션 트랙을 하나씩 클릭 각 프레임에 그 실종 조직의 모양의 세포를 추적하고 Microsoft Excel에서 결과를 완료하고 저장 "최종 트랙"을 클릭하여 "트랙을 추가."
4. 호중구 채용 매개 변수의 분석
- Microsoft Excel에서 결과 파일을 열고 (분석에 기준점의 변화를) 데이터를 분석할 수 있습니다.
- Intraluminal 크롤링
- 거리를 크롤링 : 총 거리는 세포가 최적의 윤회 사이트 (μm의)에 초기 자기편 사이트에서 루멘으로 크롤 링합니다.
- 속도를 크롤 링 거리 / 시간 (μm의 / 분) 크롤 링.
- Transendothelial 마이 그 레이션
- 윤회 시간 : 세포가 전체 세포의 몸이 venule 밖이며 셀 시체가 루멘 (분 또는 초)에서 볼 수 없습니다 때 시간 내피를 통해 윤회하다 시작 시간부터.
- 파견 시간 : 시간에서 전체 셀 몸이 세포가 venule (꼬리 retracts) (분 또는 초)과 접촉을 잃는 경우 시점에 (바로 윤회 후) 그냥 venule 밖입니다.
- 조직에 Chemotaxis
- 마이 그 레이션 거리 : 조직에서 마이 그 레이션의 끝 지점 (μm의)로 시작 시점에서 세포가 이동하는 거리의 합계.
- 마이 그 레이션 속도 : 조직 / 시간에 마이 그 레이션 거리 (μm의 / 분).
- Chemotaxis 거리 : 거리 세포의 합계가 조직의 X - 축 (μm의)에서 마이 그 레이션합니다.
- chemotaxis의 속도 : chemotaxis 거리 / 시간 (μm의 / 분).
- Chemotaxis 지수 : 조직에서 마이 그 레이션 거리로 chemotaxis 거리를 나누어의 비율.
5. 대표 결과 :
bightfield intravital 현미경은 백혈구 - 내피 세포 상호 작용의 연구에 사용되며 neutrophils for 반드시되지 않을 수 있지만, 우리는 조직학 연구에 의해, neutrophil chemoattractant - 대우 cremaster 근육의 고용 세포의 이상 95% 실제로 neutrophils 있었 확인 . 이 보고서에서, 호중구 - 선택 chemoattractants를 사용하여, 우리는 생체내에 neutrophils의 채용을 추적 절차를 제시한다. 특히, 우리는 추적 호중구 intraluminal 크롤링, transendothelial 마이 그 레이션, 그리고 시간 경과 intravital 비디오 현미경과 ImageJ를 사용하여 anesthetized 마우스에 cremaster 근육 조직의 chemotaxis의 프로토콜을 설명합니다. cremaster 근육에 chemoattractant 함유 아가로 오스 겔 천천히 chemoattractant을 출시하고 chemoattractant 그라디언트가 조직 설립 수 있습니다. 호중구의 chemoattractant는 마우스에 cremasteric postcapillary venules에서 호중구 - 내피 세포 상호 작용을 유도. 전체 실험은 TV 모니터에 컬러 비디오 카메라에 의해 예상과 비디오 레코더에 기록된 영상과 직립 brightfield intravital 현미경 시각이다. 우리는 호중구 결정intraluminal 크롤링, transendothelial 마이 그 레이션 및 마이 그 레이션 및 응답의 근육 조직의 chemotaxis은 chemoattractant MIP - 2를 호중구하고 WKYMVm는 (그림 2) 아가로 오스 겔에서 준비했습니다. 우리는 MIP - 2 (0.5 μm의)와 WKYMVm이 (0.1 MM에서) 거의에서 비교의 시간 길이, 호중구 마이 그 레이션 및 근육 조직의 chemotaxis에 대한 venule에서와 비슷한 속도, 호중구 transendothelial 마이 그 레이션과 분리에서 호중구 intraluminal 크롤 링을 elicited 것을 발견 유사한 호중구의 chemotaxis 인덱스 (P> 0.05, 학생 t 시험)와 같은 속도합니다.
그림 1. intravital 현미경 시스템의 개략도 그림. 마우스 cremaster 근육은 현미경 스테이지에 cremaster 근육 보드의 명확한보기 받침대에 exteriorized 37 ° C - 예열 중탄산염 버퍼 식염수에 superfused 있습니다. 직립 현미경 brightfield intravital 현미경에 CCD 컬러 비디오 카메라로 연결됩니다. 흑백 깊은 냉각 CCD 디지털 카메라도 형광 현미경을위한 intravital 현미경 포트에 연결되어, 이미지가있는 직접 컴퓨터에 의해 처리됩니다.
brightfield intravital 현미경의 그림 2. 호중구 모집 매개 변수. 호중구 모집은 아가로 오스 겔 준비 MIP - 2 또는 WKYMVm이 postcapillary venule에 인접한 350 μm의 배치 호중구의 chemoattractant의 점진적 릴리스에 의해 유도되었다. 시간 타락한 비디오 데이터는 실험의 실시간 비디오 녹화를 처리 후 ImageJ에 의해 분석되었다. cremaster 근육 (D)에서 호중구 intraluminal 링 (A), 윤회 시간과 분리 시간 (B), 조직에서 마이 그 레이션 속도와 chemotaxis 속도 (C) 및 chemotaxis 지수는 MIP - 2 또는 WKYMVm 아가로 오스 겔에의 관리 후 결정 C57BL / 6 마우스에 cremaster 근육 (N = 3, # 추적 세포의 = 22 일 (A와 B) 및 27 (C와 D)를 각각 MIP - 2, 그리고 = 26 일 (및 B) 44 ( WKYMVm에 대한 각각 C와 D)에서).
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Discussion
Intravital 현미경은 염증시 백혈구 모집의 세포 및 분자 메커니즘을 밝히 위해 필수적인 도구입니다. 이러한 cremaster 근육 및 장간막과 같은 transluscent 조직의 microvasculature에서 백혈구 - 내피 세포 상호 작용의 결정에 대한 양적 시각화의 기법 1.5의 응용 프로그램에 대한 황금 표준 남아 있습니다. 기존 brightfield의 intravital 현미경은 많은 독특한 기술 특징을 가지고 있으며, 이들 조직에서 공개 채용 메커니즘은 생체내 1,2,6 대부분의 조직에 적용됩니다. 그러나, 폐, 간, 뇌 등 다른 조직에서 백혈구 모집의 메커니즘 cremaster 근육과 장간막 1 공개과는 꽤 다른 발견되었습니다. 또한, 형광 현미경은 몇 가지 덜 투명한 조직에서 사용할 수 있습니다.
라이브 세포의 기능에 photodamage 알려져있는 형광 기반의 현미경과 비교 brightfield intravital 현미경보다 생리 및 세포와 조직 (따라서 적은 유물과)에 덜 해로운 경우의 동적 세포 행동을 관찰을위한 오랜 영상 살아있는 동물은 7 필요합니다. 그것은 또한 더 편리합니다 적은 비용과 더 형광 라벨이 필요하지 않습니다. 한편, intravital 현미경의 transillumination 이미징과 함께, 자동 추적 세포 운동은 시장에 현재 사용 가능한 상용 이미징 소프트웨어 불가능합니다. 그러나, 같은 brightfield intravital 현미경에 대한 별도의 형광 intravital 이미징 시스템 (예, 형광 CCD 카메라와 컴퓨터에 이미지를 예상하여) (그림 1)을 설정하는 것은 매우 쉬운 그것이다. 이것은 하나의 실험에서 동일한 샘플 준비에 brightfield 현미경과 형광 이미징 사이를 전환할 수있는 편리를 제공합니다. 이것은 또한 표시된 세포와 배경 이미징 소프트웨어 충분히 크고 적합한지의 형광 강도 사이의 대비가 컴퓨터에 설치되어있을 때 그것이 가능한 자동 형광 현미경 하에서 intravital 찬란 레이블 세포의 움직임을 추적할 수 있습니다.
우리의 프레 젠 테이션 여기 묘사된대로, 우리는 호중구 채용의 전 과정의 직접 관찰 및 각 채용 단계에서 세포와 분자의 기능 결정에 대한 생체내 기술이의 가치를 보여줍니다. chemoattractant는 아가로 오스 겔 준비에 포함된하고 조직에 개최와 함께, 단방향 chemotactic 기울기는 자연스럽게 지역의 염증 8,9 중에 발생하는 사람들을 닮은 백혈구 채용 반응을 유도 조직 설립하실 수 있습니다. chemoattractant의 근원쪽으로 postcapillary venule에서 방향 백혈구 운동이 brightfield intravital 현미경과 비디오 촬영에 의해 명확하게 시각하실 수 있습니다. 시간 저속 비디오 처리, 세포의 움직임은 ImageJ으로 추적할 수 있으며 높은 재현성 매개 변수의 일련 측정할 수 있습니다. 특정 유전자 변형 마우스, 억제제 및 선택 chemoattractants으로 분석 시스템은 우리가 백혈구 채용에서 특정 단백질의 기능을 공개하는 데 도움이됩니다. 예를 들어,이 기술은 호중구 transendothelial 마이 그 레이션 10 규제의 게이트 키퍼로서 내피 세포 LSP1에 대한 역할, 호중구 intraluminal 크롤 링에 맥 - 1에 대한 역할 (αMβ2 인테), 최적 transendothelial 마이 그 레이션을위한 필수적인 단계를 식별하는 우리에게 도움을 3, 조직 11 호중구 chemotaxis에 PI3Kγ에 대한 역할.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 건강 연구 캐나다 연구소 (CIHR, 걸레 - 86749)에서 연구 부여에 의해 지원되었다. L. 리우 CIHR 새로운 탐정 수상 (MSH - 95374)의 수상자이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene tubing, PE10 | Becton Dickinson | 427401 | I.D. 0.28mm × O.D. 0.61mm |
| India ink | Speedball Art | Super Black | 100% carbon black pigment, no dyes |
| Cautery | Aaron Medical | AA03 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Murine recombinant MIP-2 | R&D Systems | 452-M2 | |
| WKYMVm | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | 072-12 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | Ultrapure |
| Heparin | Sigma | H-3393 | |
| Upright microscope | Olympus | BX61WI | |
| 3CCD color video camera | SONY | DXC-990 | |
| HD-DVD video recorder | LG Electronics Inc. | RH398H-M | |
| TV monitor | LG Electronics Inc. | 22LG30 | |
| Water circulator | Thermo Scientific | HAAKE DC10 | |
| Peristaltic pump | Gilson; Pharmacia | Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3 | |
| Cremaster muscle board | University of Saskatchewan | Home-made |
References
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- Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective. J. Immunol. 180, 6439-6446 (2008).
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